Abd.

Malik
10/ 307253/ PFA/994

Review: Pemisahan Preparatif dan Determinasi Matrin dari Tumbuhan

Obat China Sophora flavescens dengan Menggunakan Sistem
Moleculary Imprinted Solid-Phase Extraction
Jia-Ping Lai, Xin-Wen He, Yue Jiang, Feng Chen
Anal Bioanal Chem (2010) 375:264269 DOI 10.1007/s00216-002-1675-2
Springer-Verlag
Pendahuluan
Sophora flavescens (famili fabaceae) adalah pohon yang tersebar di
wilayah asia dan dapat tumbuh pada semua kondisi suhu. Pohon ini
mengandung

alkaloid

quinolizidine,

yaitu

matrine

dan

matrine

oxide/oksimatrin. Matrin (MT) dan oksimatrin (OMT) merupakan komponen

utama dari tumbuhan obat china Sophora flavescens yang aktif secara
biologis sebagai obat antifebril, nyeri, diuretik, batuk, antidotum, tumor,
antiaritmia, abiritatif, meningkatkan leukosit, dan menjaga fungsi hati.
Untuk memisahkan MT dan OMT agar lebih efektif dan efisien, peneliti
melakukan pengembangan metode ekstraksi dan determinasinya. Metode
pemisahan kedua senyawa tersebut masih sedikit dilaporkan termasuk
metode counter-current chromatography (CCC), High-Performance Liquid
Chromatography (HPLC) dan Thin-Layer Chromatography (TLC). Ketiga
metode tersebut belum maksimal dalam memisahkan senyawa MT dan
OMT. Sedangkan untuk determinasi terutama digunakan HPLC dan
Capillary Zone Electrophoresis (CZE)

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

Molecularly imprinted polymers (MIPs) adalah polimer crosslinker

dengan daerah binding site membentuk jalinan kopolimerisasi dengan
monomer fungsional pada molekul templat. MISPE adalah pengembangan
dari metode solid-phase extraction (SPE) klasik dengan menggunakan
fase diam Molecularly imprinted polymers (MIPs) yang sudah bersih dari
pengotor. Pada penelitian ini menggunakan Molecularly imprinted
microsphere (MIMs) yang disintesis dari cairan polimer micro-suspension
untuk memisahkan matrin dari tumbuhan tersebut dengan matrin (MT)
murni sebagai molekul templat. MIMs adalah suatu jenis membran yang
mengandung MIPs dengan selektifitas dan afinitas yang tinggi.
Metode Penelitian
Pembuatan MIMs
MIMs dibuat dengan terlebih dahulu melarutkan Poly (vinil alkohol) (PVA)
500 (3,4 g) dalam 120 mL air dengan kemurnian tinggi pada suhu 90o

95 C, hal ini dilakukan untuk memudahkan dalam pembentukan polimer.

PVA adalah suatu polimer sintetis yang larut dalam air, dapat membentuk
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

lapisan, bahan pengemulsi dan mempunyai sifat adhesif. Larutan tersebut

dimasukkan dalam labu berleher tiga. Molekul penuntun MT murni (1
mmol) dan monomer fungsional methacrylic acid (MAA) (6 mmol)
dicampur dalam botol gelas kemudian ditambah kloroform sebagai progen.
MAA adalah komponen organik yang dapat larut dalam air panas dan
pelarut organik yang lain. MAA banyak digunakan untuk membentuk
polimer. Campuran organik disimpan dalam freezer dengan
o

mempertahankan pada suhu 0 C selama 30 menit. Sejumlah 50 mmol

ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) sebagai copolymer crosslinker
dalam reaksi radikal bebas dan 150 mg AIBN sebagai inisiator
ditambahkan

kedalam

campuran

dan

larutan

tersonikasi.

Semua

campuran dimasukkan dalam fase air pada labu berleher tiga sambil
diputar pada 410 rpm dengan penurunan secara perlahan (0,8 L/min)
o

sambil dialiri nitrogen (99.99%). Temperatur diturunkan ke 60 C untuk

mendorong terjadinya polimerisasi. Proses ini dijaga selama 24 jam.
Butiran dicuci dengan air terpurifikasi, metanol, dan campuran metanolasam asetat glasial (9:1 v/v), selanjutnya mikrosphere non-imprinted
dibuat dengan cara yang sama tanpa penambahan molekul penuntun MT.
MIMs digunakan sebagai fase diam untuk memisahkan senyawa MT dan
OMT.
Ekstraksi Matrin kasar dari Sophora flavescens Ait.
Ekstraksi matrin dilakukan dengan terlebih dahulu merendam Akar
Sophora flavescens 5,0 g dalam 10,0 mL amonium hidroksida 2,0 %
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

selama 4 jam. Amonium hidroksida adalah pelarut yang dapat digunakan

untuk membasakan, mengendapkan atau memurnikan senyawa golongan
alkaloid. Untuk mengendapkan alkaloid Harborne 1987, menganjurkan
meneteskan NH4OH pekat dan untuk mencuci endapan menggunakan
NH4OH 1%.

Kemudian akar dihancurkan dengan high-speed

desintegrator. Penghancuran akar dapat memudahkan penetrasi pelarut

untuk menembus lapisan batas sehingga mempercepat proses ekstraksi.
Bahan diekstraksi tiga kali dengan 10,0 mL campuran kloroform:metanol
(5:5, v/v) secara berturut-turut. Harborne 1987, juga menganjurkan
penarikan alkaloid dengan kloroform-etanol, kepolaran pelarut ini tidak
jauh berbeda dengan cara yang digunakan oleh peneliti. Ekstraksi
sebanyak tiga kali biasanya akan lebih efektif dibandingkan dengan
satukali menggunakan volume pelarut yang sama. Campuran ekstrak
diuapkan dengan rotavapor R-114. Residu dari hasil penguapan dilarutkan
dalam 10,0 mL metanol kemudian disaring dengan membran Polymer
Thick Film (PTF). PTF biasanya juga digunakan untuk memisahkan
protein. Filtrat digunakan untuk SPE atau analisis dengan MIMs-HPLC.
Solid-Phase Extraction
MIMs kering yang disuspensikan dalam campuran metanol dan 2-propanol
(5:5,v/v) disonikasi dalam waterbath selama 10 menit dan ditempatkan
dalam cartridge SPE yang terbuat dari polypropylene dengan poros yang
besar dan mempunyai kran untuk mendukung MIMs. Bagian atas dibatasi
dengan gelas wool. Cartridge SPE dihubungkan dengan pompa vacuum.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

Pengisian cartridge SPE dengan menggunakan MGAA (9:1, v/v) sebanyak

30 mL, kemudian dijenuhkan dengan 20 mL metanol. Aliran dikontrol
setiap 0,2 mL/menit. Cartridge yang telah dicuci dikeringkan dalam
vaccum. Cartridge kosong juga dilakukan sesuai prosedur. Selanjutnya,
5,0 mL larutan standar atau ekstrak dimasukkan melalui cartridge (berisi
MIMs dan polimer kosong) dengan kecepatan 0,2 mL/menit. Untuk
mengevaluasi perbedaan pengaruh eluen dalam mengelusi pengisian
cartridge dicuci dengan 5,0 mL MW 3:7, v/v, metanolair (5:5, v/v),
metanol, metanoldichloromethane (8:2, v/v) dan metanolasam asetat
glasial (9:1, v/v), secara berturut-turut. Effluent dari setiap eluasi
dikumpulkan untuk dianalisis dengan MIMs-HPLC.
Metode MIMs-HPLC
Microsphere dikemas dalam kolom dengan metode basah menggunakan
campuran metanol:2-propanol (5:5, mL). Sistem HPLC terdiri dari 2 pompa
air 510, modul air temperature-control dan detektor air 996 photodioda
o

array. Temperatur kolom oven dikontrol pada suhu 50 C. Panjang

gelombang dideteksi pada 215 nm. Kolom dibilas dengan campuran
MGAA 9:1, v/v sampai stabil. Aliran disetting pada 1,0 mL/menit. Volume
injeksi 20 uL. Faktor kapasitas dihitung berdasarkan prosedur standar
kromatografi k=(t-t0)/t0, t dan t0 adalah waktu retensi dan waktu awal.
Waktu awal (t0) telah dideterminasi dengan waktu elusi dari peak pelarut.
Faktor imprinted () dihitung dengan cara, =k impr/k non-impr.

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

Hasil dan Pembahasan

Pemilihan pelarut pembilas dan eluen untuk MISPE
Dalam sistem MISPE pelarut pembilas dengan eluen harus dibedakan.
Pelarut pembilas digunakan untuk membersihkan pengotor, sedangkan
eluen digunakan untuk mengelusi molekul target. Pemilihan eluen adalah
hal kritis yang harus diperhatikan dalam menentukan kolom MIMs dalam
proses kromatografi. Beberapa pelarut pembilas yang dipilih dalam prose
MISPE seperti metanol:air (3:7,v/v, MW37) metanolair (5:5, v/v, MW55),
methanol (M), metanoldiklorometane (8:2, v/v, MDCM), diklorometan

(DCM) dan metanolasam asetat glasial (9:1, v/v, MGAA). Larutan bilasan
langsung dipisahkan dengan menggunakan metode MIPs-HPLC.
Kromatogram a adalah peak OMT dan b adalah MT yang digunakan
sebagai standar.

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

Pada kromatogram c dibilas dengan menggunakan pelarut MW37,

berdasarkan kromatogram tersebut tidak menunjukkan adanya senyawa
MT ataupun OMT. Sedangkan pada kromatogram d menggunakan MW55
menunjukkan adanya sedikit peak MT maupun OMT. Hal ini menandakan
bahwa MW37 merupakan campuran pelarut bersifat yang polar tidak dapat
membawa MT atau OMT yang merupakan alkaloid dimana alkaloid larut
dalam pelarut kurang polar, sedangkan MW55 sedikit bisa walaupun peak
sangat kecil dibanding kontrol karena konsentrasi metanol ditingkatkan.

Pada kromatogram e dan f menggunakan pembilas M dan MDCM

menunjukkan adanya peak MT dan OMT dengan jelas. Hal ini dapat
terjadi

karena

metanol

merupakan

pelarut

yang

mempunyai

segmentasi/rentang luas dalam melarutkan senyawa dari berbagai tingkat

kepolaran.

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

Pada kromatogram g tidak menunjukkan adanya MT atau OMT dengan

menggunakan DCM. Sedangkan kromatogram h menunjukkan sedikit
peak MT dengan menggunakan MGAA tetapi peak OMT tidak muncul.
Sehingga pada penelitian ini digunakan MW37 sebagai pelarut pembilas
dan MGAA91 sebagai eluen untuk memisahkan MT.
Pengaruh konsentrasi dan volume MISPE
Ekstrak kloroform mengandung banyak pengotor sehingga perlu dibilas
dengan menggunakan MW37. Untuk membilas MT dan OMT harus
menggunakan metanol dengan konsentrasi tinggi karena pada konsentrasi
rendah metanol tidak dapat membersihkan pengotor. Hal ini didukung oleh
penelitian dengan menggunakan variasi konsentrasi.

30 %

Konsentrasi

<30

dengan

analisis

kromatografik

tidak

dapat

mengeluarkan MT sedangkan konsentrasi > 30 dapat meningkatkan

pengeluaran pengotor. Pengotor juga tidak dapat dihilangkan sempurna
jika penggunaan eluen dalam jumlah sedikit.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

Pengeluaran MT dari cartridge-imprinted muncul jika menggunakan eluen

yang banyak sampai 25 mL.sehingga dalam penelitian ini menggunakan
metanol 30% dengan volume 25 mL yang digunakan untuk membilas
pengotor dalam cartridge yang berisi MIMs. (Lihat Fig. 4)
Pemilihan cartridge-MIMs dan kolom
Pada pengguanaan cartridge tidak ada perbedaan nyata antara imprinted
cartridge (IC) dengan non-imprinted cartridge (NIC) pada pembilasan awal
hal ini menunjukkkan bahwa tidak ada IC dan NIC tidak mempunyai ikatan
yang spesifik.

Peningkatan pembilasan tampak jelas setelah volume eluen sebesar 10

mL.

Pengeluaran

IC

tampak

jelas

pada

volume

25

mL.

Ini

mengindikasikan bahwa IC mengikat MT lebih kuat dibandingkan NIC.

Untuk melihat efek imprinting terhadap OMT dilakukan penelitian lanjutan
dengan hasil.

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

Faktor kapasitas OMT pada IC (6,18) dan kolom blank (4,66) dengan nilai
adalah 1,33. Berbeda dengan faktor kapasitas MT templat pada IC dan
kolom blank kelihatan berbeda, nilai k adalah 12,15 dan 7,04 dan nilai
adalah 1,73. Hal ini mengindikasikan bahwa afinitas spesifik pada IC
adalah MT.
Leakage Load, maximum load dan recovery cartridge
Leakage load (LL) mempunyai rumus LL=cLVL/WMIP, dimana LL
adalah leakage load (gg1), cL adalah konsentrasi substrat (gmL1), VL
adalah leakage volume (mL) dari substrat, dan W MIP (g) adalah bobot
MIPs kering yang dikemas dalam cartridge. Berdasarkan rumus tersebut
diperoleh nilai LL MT pada NIC adalah 15,0 ug/g dan IC adalah 30,0 ug/g.
Hal ini menginformasikan bahwa untuk memisahkan MT lebih bagus
dengan menggunakan IC.
Maximum load mempunyai rumus Lmax=csVs/WMIP, dimana cs
adalah concentration dari tested substrate larutan eluasi, Vs adalah
volume eluent. Berdasarkan rumus tersebut, maximum loads (Lmax) dari
MT pada NIC adalah 22.4 g/g dan IC adalah 38.7 g/g. Hal ini
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

10

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

mengindikasikan bahwa nilai Lmax selalu lebih besar dari nilai L L, dengan
kata lain leakage selalu terjadi sebelum adsorbsi kering tercapai.
Selanjutnya dilakukan penelitian tentang recovery MT dan OMT
pada IC dan NIC. Larutan metanol MT dan OMT (1.0 gmL1, 5mL)
ditambahkan ke dalam ekstrak sampel (5 mL) dari S. Flavescens.
Campuran di run dengan kecepatan 0,2 mL/menit. Pengisian MT dan
OMT pada cartridge dielusi dengan 5,0 mL campuran MGAA91 dan
dianalisis dengan MIMs-HPLC.

Recovery MT pada IC adalah 71,4% sedangkan OMT 57,3%. Hal ini

menunjukkan recovery MT lebih mudah dilakukan dibandingkan OMT.
Pengujian sampel extract S. Flavescens
Sejumlah 5,0 mL extract S. Flavescens di load ke dalam imprinted
cartridge dengan kecepatan 0,2 mL/menit dengan menggunakan larutan
pembilas MW37 dan eluen MGAA91.

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

11

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

Pada

kromatogram

menunjukkan

banyaknya

pengotor

yang

menandakan bahwa itu adalah ekstrak kasar dari extract S. Flavescens,

sedangkan pembanding tidak banyak terlihat. Sehingga ketika ekstrak di
load ke dalam cartridge dibilas dengan 25 mL MW37 tampak jelas
perbedaannya antara ekstrak MT kasar dengan MT murni, karena banyak
pengotor telah diremoved dari cartridge yang digunakan.
Kesimpulan
1. MIMs dapat digunakan untuk solid-phase extraction (SPE) dan Hight
Performance Liquid Chromatografi (HPLC) untuk memisahkan Matrin
(MT).
2. Cartridge MISPE dan kolom MIMs-HPLC menunjukkan afinitas
spesifik terhadap molekul templat Matrin (MT).
3. Pendekatan MISPE lebih stabil, keberulangan, teratur dan antikorosif
dibanding kolom reverse-phase C18.
4. MISPE juga merupakan hal yang baru dalam pengembangan Obat
Tradisional China.
Saran dan komentar
1. Perlu optimasi penggunaan eluen metanolasam asetat glasial
(MGAA) untuk memisahkan Matrin (MT) dengan oksimatrin (OMT).
2. Perbandingan efektifitas dan efisiensi MISPE dengan kolom reversephase C18. perlu diteliti sehingga ada data ilmiah untuk memastikan
kelebihan dan kekurangan kedua sistem.
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

12

Abd. Malik
10/ 307253/ PFA/994

PUSTAKA
Harborne, J.B., 1987. Metode Fitokimia. Terbitan kedua. Terjemahan
Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Penerbit ITB; Bandung.
Lai, J.P., et al. 2003. Preparative separation and determination of matrine
from the Chinese medicinal plant Sophora flavescens Ait by
molecularly imprinted solid-phase extraction.
www. Technology-articles.org. 2010. Preparation of Molecularly Imprinted
Membranes and Their Application Study of the Membrane
Chromatography. Diakses Maret 2011.
Lai, J.P,. et al. 2007. Molecularly imprinted microspheres and nanospheres
for
di(2-ethylhexyl)phthalate
prepared
by
precipitation
polymerization. Jurnal Anal Bioanal Chem.
389(2):405-12.
www. Suite 101.com. Sophora Flavescens: An Asian Herb in the Spotlight
for Fighting Cancer and Inflammation. Diakses Maret 2011.

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

Hal.

13