Laporan Isolasi Dna Jadi2
Laporan Isolasi Dna Jadi2
ELEKTROFORESIS DNA
Laporan Praktikum Genetika
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Mata Kuliah Genetika (BI409)
Disusun oleh :
Kelompok 1, Kelas B
Ridwan Maulana (0704739)
Adriana (0706685)
Eva Hafida (0704558)
Jeina Kranimulia Putri (0608383)*
Noviyanti F (0704401)
Ratna Sari Murti (0700733)
Zea Zetina (0704479)
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat
pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus
berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA
mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.
Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan
sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan
sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak
memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier
dan memiliki protein histon.
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-
komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah
sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh
sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki
suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi,
baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah.
Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana
terdapat DNA didalamnya.
DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh polisakarida
dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu
kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk
melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat,
dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat.
Kehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak
sensitive oleh enzim retriksi dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR.
Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk memisahkan,
mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Cara
pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok
dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk
pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.
1.2 Tujuan
1. Dapat melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman
2. Dapat memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA
Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah
medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA
Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV
Jenis Elektroforesis
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase
diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion
kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem
pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat
terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion,
pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel
kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-
protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan
poliakrilamida sebagai gel media.
1.4 Metode Kerja
Isolasi DNA Tanaman
Alat :
• mikrovivet berbagai ukuran
• tabung 1,5 ml
• tips mikropipet berbagai ukuran
• saringan
• gelas kimia
• sendok
• penangas
• vorteks
• mini sentrifuga
• blender / lumping
Bahan :
• buffer ekstraksi (100 mM tris- HCl, Ph 8; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl, CTAB
2%)
• Potasium asetat 5 M
• SDS 20%
• Kloroform : Isoamil alcohol (24:1)
• Alkohol 100% (pa)
• TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8)
• Buah strowberi
• CTAB 2%
Elektoforesis DNA
Range pemisahan molekul DNA dengan agarose gel
Agarose % Seaparsi optimal dari
molekul DNA (Kb)
0,3 5,0-60
0,6 1,0-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7,0
1,2 0,4-6,0
1,5 0,2-4,0
2,0 0,1-3,0
Bahan kimia :
• Buffer TAE 10 X (400 mM Tris asetat, 10 mM EDTA Ph 8 )
• Eidium bromida
• Loading buffer
• DNA Marker
• Agarose
Alat dan bahan :
• Elektroforesis unit (meliputi comb dan tray)
• Power suply
• Mikropipet digital
• Transilluminator UV
BAB II
HASIL PENGAMATAN
Sampel di homogenkan
dengan cara dibolak-balik sebanyak
50x
Larutan Bening
DNA
Tabel 2. Pengamatan Hasil Elektroforensis DNA
Foto Hasil Pengamatan Keterangan
Fragmen DNA yg
sempurna, karena tidak terurai
Isolasi DNA
1. Hitung jumlah senyawa yang dimasukka pada tahapan kerja nomer 5, 14 dan 18!
Buffer ekstraksi sebanyak 4 kali volume total sampel = 4 x
Kloroform Isoamil Alkohol sebanyak ½ x volume total sampel = ½ x
Alkohol sebanyak 2 x volume total sampel = 2 x
2. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam isolasi DNA !
Buffer ekstraksi berperan dalam proses destruksi jaringan tanaman sehingga terjadi
degradasi pada DNA.
SDS berfungsi sebagai detergen yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi
protein.
Kloroform Isoamil Alkohol membantu proses denaturasi protein yang masih
menempel pada kromosom.
Alkohol digunakan untuk mempresipitasi asam nukleat.
Elektroforesis DNA
1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis anda !
2. Mengapa DNA hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV ? Jelaskan !
DNA berukuran sangat kecil dan sulit untuk diamati, oleh karena itu untuk
memudahkan pengamatan DNA diwarnai menggunakan Etidium bromida. Etidium
bromida ini akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru akan
tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.
3. Apakah Etidium Bromide ? Bagaimana cara kerja Etidium bromida dalam proses
pewarnaan DNA ?
Etidium bromida seperti telah disebutkan di atas adalah pewarna yang digunakan
untuk mempermudah pengamatan DNA dalam gel. Etidium bromida akan
berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru akan tampak jika di bawah
lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.
BAB III
PEMBAHASAN
Isolasi DNA
Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap tanaman strawberry.
Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu
mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan mengambil beberapa bagian dagiang
buah strawberry yang dihancurkan didalam tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan
dinding dan membran sel dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer
ekstraksi.
Untuk mengisolasi jaringan buah strawberry, maka jaringan tanaman tersebut
yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya
sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung diberikan larutan
pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan di atas yang merupakan larutan
hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis
sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks
(chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu
dalam larutan tersebut juga terdapat larutan NaCL yang berfungsi untuk menstabilkan
larutan sehingga mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya.
Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang terisolasi
tadi, diberikan pula larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak
lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Pada saat proses destruksi jaringan
tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim
endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris,
EDTA, CTAB, potassium asetat, dan SDS. Senyawa CTAB dan SDS merupakan
detergen, yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan
EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuclease.
Kemudian sampel tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah
dihomogenkan warna larutan berubah menjadi merah.
Sampel yang telah homogen kemudian diinkubasikan, setelah itu diberi larutan
Potassium asetat dan dihomogenkan, setelah homogeny sampel disimpan dalam wadah
berisi es. Potassium asetat adalah senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein
sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-potassium aesta-protein- debris
sel. Setelah itu sampel disentrifuga pada kecepatan 14.000 rpm selam 10 menit.
Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak
dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang berwarna merah. Fasa
atas yang kemudian diambil untuk digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut
juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel tanaman dari
zat-zat lainnya.
Kemudian, pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol (24:1)
yang berperan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom,
sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 100%. Pemberian
alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. DNA dalam
alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi
protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap
presipitasi presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai
DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-
benang endapan DNA pada dasar tabung.
Pembahasan Elektroforesis
\Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan gel agarose karena dengan
menggunakan gel agarose teknik yang digunakanpun cukup sederhana, mudah
penanganannya dan sederhana, selain itu gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan
dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb (pasangan basa) sampai 800.000pb.
Selainitu penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi
dari DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan Etidium Bromida
sebagai pewarna. Etidium bromide nantinya akan berinteraksi dengan basa dari molekuk
DNA dan memberikan warna orange Floresance dibawah lampu UV.
Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita
DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen.Gambar pada hasil pengamatan kami
ditemukan salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang
sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA
bermigrasi,sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.
Bab IV
Kesimpulan
DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. Pada
praktikum isolasi DNA dari tanaman digunakan jaringan tanaman yang mengandung
sedikit kontaminan, yaitu menggunakan daging buah. Prinsip-prinsip dalam melakukan
isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi DNA memiliki beberapa
tahapan, yaitu isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, ekstraksi dalam
larutan, purifikasi, dan presipitasi.
Dari hasil pengamatan dapat dilihat hasil dari tahap-tahap yang telah dilakukan.
Isolasi DNA telah berhasil dilakukan. Hal tersebut dilihat dengan adanya benang-benang
DNA yang terbentuk. Terbentuknya benang-benang tersebuut juga merupakan hasil dari
proses tahapan-tahapan yang dilakukan dengan menggunakan larutan senyawa-senya
tertentu.
DAFTAR PUSTAKA
Sentrifuge
Pipet Ukur