(TUGAS REKAYASA GENETIKA)

POLYMERASE CHAIN REACTION/PCR

NUR ALFIAH IRFAYANTI
ISTIANAH PURNAMASARI
JAYADI
RORI ORYZA


DOSEN PENGAMPU : PROF.NATSIR DJIDE.,M.Si.,Apt



PROGRAM PASCASARJANA FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2014



BAB I
PENDAHULUAN

Latar Belakang
Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas) serta
segala sluk beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan, ilmu ini
mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pearisan sifat, bagaimana sifat
keturunan ilmu itu diturunkan dari generasi kegenerasi serta variasi-variasi yang
mungkin timbul didalamnya atau yang menyertainya. Pewarisan sifat tersebut dapat
terjadi melalui proses seksual. Genetika berusaha membawakan material pembawa
informasi untuk diwariskan (bahan genetik), bagaimana informasi tersebut di
ekspresikan ekspresi genetic dan bagaimana informasi tersebut dipindahkan dari
individu satu ke individu lain. PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan
untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target
DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA
yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.





BAB II
PEMBAHASAN
2.1. Pengertian PCR (Polimerase Chain Reaction)
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR
(polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini,
DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga
memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh
Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994
berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan
biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang
kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah suatu
metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan
menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan
dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan
amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas
penggunaannya.
Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara
amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan
non-target. Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in
vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda,
penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh
DNA polimerase dari arah terminal 5 ke 3. Hanya saja pada teknik PCR tidak
menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan
dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida,
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam
larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran
secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang
diinginkan.
Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan
untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target
DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA
yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.
PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan menggunakan dua
oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung 5dari dua untaian skuen
target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer (primer PCR) untuk
memungkikan DNA template dikopi oleh DNA polimerase. Untuk mendukung
terjadinya annealing primer ini pada template pertama kali diperlukan untuk
memisahkan untaian DNA substrat melalui pemanasan.
Hampir semua aplikasi PCR mempekerjakan DNA polimerase yang stabil
terhadap panas, seperti polimerase Taq. Awalnya enzim diisolasi dari bakteri
Aquaticus Thermus. DNA polimerase enzimatis ini merakit sebuah untai DNA baru
dari pembangunan blok DNA, nukleotida , dengan menggunakan DNA beruntai
tunggal sebagai template dan oligonukleotida DNA (juga disebut primer DNA ), yang
dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA. Sebagian besar metode PCR menggunakan
siklus termal , yaitu, bergantian pemanasan dan pendinginan sampel PCR untuk
serangkaian langkah pasti suhu. Langkah-langkah siklus termal yang diperlukan
pertama yang secara fisik memisahkan dua helai dalam heliks ganda DNA pada suhu
tinggi dalam proses yang disebut DNA leleh . Pada suhu yang lebih rendah, masing-
masing untai kemudian digunakan sebagai template dalam sintesis DNA oleh
polimerase DNA untuk selektif memperkuat DNA target. Selektivitas hasil PCR dari
penggunaan primer yang komplementer ke wilayah yang ditargetkan untuk
amplifikasi DNA di bawah kondisi spesifik siklus termal.
Metode PCR dapat melipatgandakan suatu fragmen molekul DNA menjadi
molekul DNA (110 bp / 5 x 10-19) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus
reaksi selama 220 menit (Newton and Graham, 1994).

Alat PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION)
2.2. Komponen
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase,
komponen lain yang dibutuhkan adalah:
a. Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang
menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA.
Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri
E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan
DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik
tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang
komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah
tertentu yang kita inginkan.
b. dNTP (deoxynucleoside triphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru.
dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP,
dGTP dan dTTP.
c. Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan
reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
d. Ion Logam
Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim
DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
Ion logam monovalen, kalsium (K+).
2.3. Prinsip Kerja
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali
siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR
dalam satu siklus:


Gambar proses prinsip kerja PCR (Polimerase Chain Reaction)
1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada
suhu tinggi, 9496 C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA
menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini
dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA
terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi
templat (patokan) bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA
templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara
4560 C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat
\menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di
sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis
DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya
dilakukan pada suhu 76 C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan
renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain.
Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai.
Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara
ksponensial
Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain
sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal
akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing
menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut
dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur(reverse primer).
Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai
dari tempat penempelannya hingga ujung 5 DNA templat (ingat polimerisasi DNA
selalu berjalan dari ujung 5 ke 3 atau berarti dari ujung 3 ke 5 untai templatnya).
Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai
DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.
Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi
akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada
putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2
n
2n.
Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama
dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang
merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan
(diamplifikasi).
Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka
pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 2
20
2.20 =
1.048576 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat
awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA
templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20
untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu
jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.
2.4. Perancangan Primer
Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang
primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi
masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung
fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau
setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah
ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan
pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk
merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan.
Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan
dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah
spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh,
untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian
gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan
basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina , dan
sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.
Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian
dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi
antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area).
Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan
basa primer.
Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan
asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke
urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih
dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari
satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat
merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam
ini dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran
urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada
daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi
sempurna (100%).
Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis
menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-
dimer akibat homologi sendiri(self-homology) atau homologi silang (cross-
homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah
tempel(mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga
dilakukan untuk mengetahui titik leleh (T
m
) masing-masing primer dan kandungan
GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai T
m
yang relatif sama dengan
kandungan GC yang cukup tinggi.
2.5 Alat-alat yang dibutuhkan dalam PCR
Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro
antara lain(Mahmuddin (2010)):
1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan
diamplifikasi
2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing
sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP
campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat
dNTP terpisah yang digabung.
4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
5. Minyak mineral ringan
6. Akrilamida (grade elektroforesis)
7. N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, #
5516UB)
8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
9. TEMED (N, N, NN Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, #
5524UB)\
Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:
1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)
2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest
Scientific)

2.6 Variasi PCR
Ada banyak variasi dari PCR yang umum di kenal, antara lain:
1. Alel-spesifik PCR : atau kloning teknik diagnostik yang didasarkan pada -
nukleotida polimorfisme tunggal (SNP) Hal ini membutuhkan pengetahuan
sebelumnya dari urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel , dan
menggunakan primer yang 3 'berakhir meliputi SNP. amplifikasi PCR dalam
kondisi ketat jauh kurang efisien dalam adanya ketidaksesuaian antara
template dan primer, amplifikasi sukses jadi dengan kehadiran sinyal primer
spesifik-SNP dari SNP spesifik secara berurutan.
2. Polymerase Cycling Assembly (PCA): sintesis buatan urutan DNA yang
panjang dengan melakukan PCR di kolam oligonukleotida panjang dengan
segmen tumpang tindih pendek. The oligonukleotida bergantian antara rasa
dan arah antisense, dan segmen tumpang tindih menentukan urutan fragmen
PCR, sehingga selektif menghasilkan produk DNA panjang akhir.
3. Asymmetric PCR : Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA
beruntai ganda. Hal ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi probing
amplifikasi hanya satu dari dua untai komplementer diperlukan. PCR
dilakukan seperti biasa, tetapi dengan kelebihan besar primer untuk untai yang
ditargetkan untuk amplifikasi. Karena (lambat aritmatika amplifikasi)
kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah digunakan Facebook,
siklus PCR tambahan yang diperlukan.
4. Amplifikasi tergantung helikase : mirip dengan PCR tradisional, tetapi
menggunakan suhu konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan
annealing / siklus ekstensi. DNA helikase , sebuah enzim yang unwinds DNA,
digunakan di tempat denaturasi termal.
5. Hot Start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama
proses set up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan
memanaskan komponen reaksi terhadap temperatur leleh (misalnya, 95C)
sebelum menambahkan polimerase. Khusus sistem enzim telah dikembangkan
yang menghambat polimerase, aktivitas pada suhu sekitar, baik oleh mengikat
dari antibodi atau oleh kehadiran inhibitor yang terikat kovalen yang
terdisosiasi hanya setelah suhu aktivasi langkah-tinggi. Hot-start/cold-finish
PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak aktif pada suhu
kamar dan akan segera diaktifkan pada suhu perpanjangan.
6. PCR spesifik Intersequence (ISSR): metode PCR untuk sidik jari DNA yang
memperkuat daerah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan
sidik jari yang unik dengan panjang fragmen diperkuat.
7. Inverse PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit
sekitar genom sisipan. Ini melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi
diri, sehingga diketahui pada urutan kedua ujung urutan tidak diketahui.
8. Mediated PCR Ligasi : menggunakan linker DNA kecil diligasikan dengan
DNA kepentingan dan beberapa primer anil ke linker DNA, tetapi telah
digunakan untuk sekuensing DNA , berjalan genom , dan DNA footprinting.
9. PCR spesifik Metilasi (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim
Herman di Johns Hopkins School of Medicine dan digunakan untuk
mendeteksi metilasi dari CpG pulau dalam DNA genom. DNA pertama
diobati dengan natrium bisulfit, yang mengubah unmethylated basa sitosin ke
urasil, yang diakui oleh primer PCR sebagai timin. Dua PCR kemudian
dilakukan pada DNA dimodifikasi, menggunakan primer set identik kecuali
pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada titik-titik ini, satu set primer
mengakui DNA dengan sitosin untuk mengamplifikasi DNA alkohol, dan satu
set mengakui DNA dengan urasil atau timin untuk mengamplifikasi DNA
unmethylated. MSP menggunakan qPCR juga dapat dilakukan untuk
mendapatkan informasi kuantitatif daripada kualitatif tentang metilasi.
10. Miniprimer PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat
memperpanjang dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10
nukleotida. Metode ini memungkinkan menargetkan untuk mengikat PCR
primer daerah yang lebih kecil, dan digunakan untuk memperkuat sekuens
DNA, seperti atau eukariotik 18S rRNA).
11. Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA): izin beberapa
sasaran diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga
menghindari keterbatasan resolusi PCR multipleks.
12. Multiplex-PCR : terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR
tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik
untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus,
informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan
membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan.
temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus dioptimalkan
untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon.
Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk
band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .
13. Nested PCR : meningkatkan kekhususan amplifikasi DNA, dengan
mengurangi latar belakang karena khusus non amplifikasi DNA. Dua set
primer yang digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi pertama,
sepasang primer digunakan untuk menghasilkan produk DNA, yang selain
target yang dimaksud, masih dapat terdiri dari fragmen DNA non-khusus
diperkuat. Produk (s) yang kemudian digunakan dalam PCR kedua dengan
satu set primer yang mengikat situs sebagian atau seluruhnya berbeda dari dan
terletak 3 'dari masing-masing primer yang digunakan dalam reaksi pertama.
Nested PCR sering lebih berhasil dalam memperkuat fragmen spesifik DNA
yang panjang dari PCR konvensional, tapi membutuhkan pengetahuan lebih
rinci tentang urutan target.
14. Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi
(BUMN): sebuah rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk splice
bersama lebih fragmen DNA atau dua yang berisi urutan komplementer. Hal
ini digunakan untuk bergabung dengan potongan DNA yang mengandung
gen, urutan peraturan, atau mutasi, teknik tersebut memungkinkan penciptaan
DNA spesifik dan panjang konstruksi.
15. Kuantitatif PCR (Q-PCR): digunakan untuk mengukur jumlah produk PCR
(umum secara real-time). Ini secara kuantitatif jumlah ukuran mulai DNA,
cDNA, atau RNA. Q-PCR biasanya digunakan untuk menentukan apakah
urutan DNA hadir dalam sampel dan jumlah salinan dalam sampel.
Kuantitatif real-time PCR memiliki tinggi tingkat yang sangat presisi. QRT-
PCR metode menggunakan pewarna fluorescent, seperti Sybr Green,
EvaGreen atau fluorophore DNA probe yang mengandung seperti TaqMan,
untuk mengukur jumlah produk yang diperkuat secara real time. Hal ini juga
kadang-kadang disingkat RT-PCR (R T ime Bit PCR) atau RQ-PCR. QRT-
PCR atau RTQ-PCR sesuai kontraksi lebih, karena RT-PCR umumnya
mengacu pada reverse transkripsi PCR (lihat di bawah), sering digunakan
dalam hubungannya dengan Q-PCR.
16. RT reverse transcription PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari RNA.
Reverse transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA , yang kemudian
diamplifikasi dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam profiling
ekspresi , untuk menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentifikasi urutan
dari transkrip RNA, termasuk start transkripsi dan situs penghentian. Jika
urutan DNA genom gen diketahui, RT-PCR dapat digunakan untuk
memetakan lokasi ekson dan intron dalam gen. 5 'akhir dari gen (sesuai
dengan awal transkripsi) biasanya diidentifikasi oleh RACE-PCR (Rapid
Amplifikasi cDNA End).
17. PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR ): untuk isolasi dari suatu
urutan yang tidak diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan
diketahui, TAIL-PCR menggunakan sepasang nested primer dengan suhu
yang berbeda anil; degenerate primer digunakan untuk memperkuat yang lain
dari arah yang tidak diketahui.
18. Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR): sebuah varian dari PCR yang
bertujuan untuk mengurangi latar belakang spesifik secara bertahap
menurunkan suhu anil sebagai bersepeda PCR berlangsung. Suhu anil pada
awal siklus biasanya beberapa derajat (3-5 C) di atas m T primer yang
digunakan, sedangkan pada siklus kemudian, ini adalah beberapa derajat (3-
5C) di bawah T primer m. Suhu tinggi memberikan spesifisitas yang lebih
besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih rendah izin lebih
amplifikasi efisien dari produk tertentu terbentuk selama siklus awal.
2.7 Optimasi PCR
Untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal perlu dilakukan optimasi proses
PCR. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara
memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi
kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor seperti jenis polimerase DNA; suhu;
konsentrasi, dalam hal ini berkaitan dengan dNTPs, MgCl2 dan DNA polimerase;
buffer PCR dan waktu.
1. J enis polimerase DNA
Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses PCR yang
terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang akan berbeda dengan
untuk DNA rantai pendek. Penggunaan jenis DNA polimerase tergantung
pada panjang DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen
DNA lebih besar dari tiga kilobasa akan memerlukan jenis polimerase dengan
aktivitas tinggi.
2. Konsentrasi dNTPs, MgCl2; polimerase DNA
Konsentrasi optimal dNTPs ditentukan oleh panjang target DNA yang
diamplifikasi. Untuk panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya
digunakan konsentrasi dNTPs sebanyak 100 uM, sedangkan untuk panjang
target DNA lebih besar dari satu kilobasa diperlukan konsentrasi dNTPs
sebanyak 200 uM. Umumnya konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0
1,5 mM. Konsentrasi MgCl2 yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan
PCR. Sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan
akumulasi produk non target yang disebabkan oleh terjadinya mispriming.
Jumlah polimerase DNA yang digunakan tergantung pada panjang fragmen
DNA yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua
kilobasa diperlukan 1,25 2 unit per 50 uL campuran reaksi, sedangkan untuk
panjang fragmen DNA lebih besar dari dua kilobasa diperlukan 3 unit per50
uL campuran reaksi.
3. Suhu
Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan
salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini
suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan
ekstensi primer. Suhu denaturasi DNA templat berkisar antara 93 95
o
C, ini
semua tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada
panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan
menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi
PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang
terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak
sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah 94
o
C.
Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 - 60
o
C
Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk
proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm
5)
o
C sampai dengan (Tm + 5)
o
C. Dalam menentukan suhu annealing yang
digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan
nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh
eksperimen. Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada
suhu 72
o
C karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA
yang biasa digunakan untuk proses PCR..
4. Buffer PCR
Buffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffer nya.
Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu Low-salt buffer (pH
8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan High-salt buffer (pH 9,2 dan
kapasitas buffer tinggi). Umumnya buffer PCR tersedia sesuai dengan jenis
polimerase DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada DNA
target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 5
kilobasa biasanya diperlukan low-salt buffer sedangkan untuk panjang DNA
target lebih besar dari lima kilobasa digunakan high-salt buffer.
5. Waktu
Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA
templat, annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi DNA templat
umumnya dilakukan selama 30 90 detik, ini semua tergantung pada DNA
templat yang digunakan. Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak
templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA.
Sedangkan waktu denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan proses
denaturasi tidak sempurna.
Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang primer.
Untuk panjang primer 18 22 basa cukup dengan 30 detik, sedangkan untuk
panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu annealing 60 detik.
2.8. Aplikasi teknik PCR
Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984.
Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan,
diantaranya:


a. Isolasi Gen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA
manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan
gen. Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik,
yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip
menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam
amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan
protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk
DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Kembali ke
pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk
diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pankreas
sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu
saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-
benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka
dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu
menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi
insulin juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh
manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan
tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi
atau babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama
probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan.
Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan
gen tersebut.
b. DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode
yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method)
yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses
awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya
menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan
dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap
basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
c. Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau
korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit
atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat.
DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR
untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias
DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan
dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau
bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan
identitas orang yang dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan
pengujian ini untuk menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang
orang tua merasa ragu
d. Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat
ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini
memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering
digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan
hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang
merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau
makhluk lainnya.
Beberapa contoh agen yang dapat dideteksi menggunakan pemeriksaan
amplifikasi asam nukleat diantaranya deteksi bakteri , virus, fungi maupun parasit.
Selain deteksi bahan ini juga dapat menetukan sensitivitas, spesifitas dan kegunaan
lainnya.

Contoh bakteri, virus, fungi
Bakteri
Bordetella pertussis
Borelia burdorferi
Chlamydia pneumonia
Chlamydia trachomatis
Escheria coli
Mycobacterium tubercolosis
Mycobacterium avium complex
Mycoplasma spp
Neissheria gonorhoeae
Streptococcus pneumonia
Streptococcus pyogenes
Fungi dan parasit
Babesia microti
Cryptococcus neoforman
Cryptococcus parvum
Entamoeba histolytica
Fasiola hepatica
Giardia lambia
Leishmania donovani
Leishmania infantum
Palsmodium falciparum
Palsmodium vivax
Pneumaocytis carinii
Schitostoma spp
Toxoplasma gomdii
Trichinella spiralis
Trichomonas vaginalis
Typanosoma cruzi
Typanosoma brucei
Virus
Cytomegolvirus
Enterovirus
Hepaitis B Virus (HBV)
Hepaitis A Virus (HAV)
Herpes simple virus-1 (HSV-1)
HIV (Human immunodefesiensi virus)
Parvovirus B 19
Varicella-Zozter virus
West nile virus
1. Deteksi Resistensi Obat
Dengan makin banyaknya mikroorganisme genetic resistensi antimikroba
diketahui, metode amplifikasi asam nukeat terbukti berguna untuk
mengkonfirmasi resistensi antimikroba pada isolate dilaboratorium dan
untuk mendeteksi langsung pada specimen klinis. Amplifikasi penentu
genetic dapat digunakan untuk mengkonfirmasi resistensi lebih berdasarkan
genotif organism daripada variabilitas ekspresi resistensi fenotopik. Ini
merupakan keuntungan deteksi resistensi secara molekuler, disamping
itujuga memerlukan waktu yang lebih singkat dibandingakan dengan
menggunakan teknik kultur konvensional.

Deteksi Resistensi Obat dengan Metode PCR
Organisme Resistensi Obat Target Gen
Methichilin-Resistent
Ttaphylococcus aureus dan
coagulase- negative
staphylococcus
Metisilin dan
Antibiotika B-
laktamase yang lain
mecA
Vancomycin-resisten
Enterococcus spp
Vankomisisn VanA, vanB,
vanC1 vanC2 dan
VanC3


2.9 Kelebihan dan kekrangan teknik PCR
a. Kelebihan
1. Memiliki spesifisitas tinggi
2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama
3. Dapat membedakan varian mikroorganisme
4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup
5. Mudah di set up
6. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu
sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu
sekuen DNA dalam genom bakteri hanya dengan mencampurkan kultur
bakteri di dalam tabung PCR.
b. Kekurangan
1. Sangat mudah terkontaminasi
2. Biaya peralatan dan reagen mahal
3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua
penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten)
4. Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian
khusus untuk melakukannya.














BAB III
KESIMPULAN
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR merupakan
suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa
menggunakan organisme. Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang
antara dua puluh sampai tiga puluh kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap
yaitu Tahap peleburan (melting) atau denaturasi, Tahap penempelan atau annealing
dan Tahap pemanjangan atau elongasi. Lepas tahap ketika, siklus diulang kembali
mulai tahap satu. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna
hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang
panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan
berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.









DAFTAR PUSTAKA
1. Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed.,
2. David, J. C, Jannet L.,Comparison of Vitek 32 and Microlog ML3 System
for Identification of Select Biological Warfare Agents, Armed Force Institute
of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, DC, 2001de
Nogueira L., Bittrich, V.P.C., Shepherd, G. J., Lopes A. V., and Marsaioli, A.
J. 2001.
3. Djide, M.N, (2006). Dasar dasar bioteknologi farmasi, Makassar
4. Darmo Handoyo, 2001, General Principles and Implementation of
Polymerase Chain Reaction, Pusat Studi Bioteknologi ,Universitas Surabaya
5. Marlina, Radu, S., Kqueen, C. Y., Napis, S., Zakaria, Z., Mutalib, S. A. and
Nishibuchi, M. Occurrence of tdh and trh genes in Vibrio parahaemolyticus
isolated from Corbicula moltkiana Prime in West Sumatera, Indonesia.
Southeast Asian Journal of Tropical Medical Public Health Vol.38 No. 2
March 2007.
6. Marlina, Zulqifli, Anamerta, L., Revadiana, I., Radu, S., Kqueen, C. Y. and
Nishibuchi, M. Identification of Vibrio parahaemolyticus from clinical
samples in West Sumatera Using Polymerase Chain Reaction Methods. Acta
Pharmaceutica Indonesia 31 (2): 2007, 96-99.
7. Retnoningrum, D.S. 1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR)
untuk diagnosis penyakit infeksi. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung: ITB.