Laporan Praktikum Isolasi Elektroforesis Dna Kelompok 2
Laporan Praktikum Isolasi Elektroforesis Dna Kelompok 2
BAB I
PENDAHULUAN
1.1.
Landasan Teori
DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang
dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun
atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat
yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel
makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.
Lamdji (1998, dalam wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitian
keragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting
untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi
melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA. Dalam
Wahyuni (2009), Nicholl (1993) dan Surzycki (2000) pun menyatakan ada
tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis),
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA.\
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan
tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang
berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida
dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika
isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masingmasing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin
tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,
sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada
gel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan
konsentrasi rendah, seperti intercalating agent ethidium bromide (EtBr).
Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel
diletakkan pada media UV-transilluminator (Fatchiyah,2006).
Kelompok 2
(2006)
pun
mengemukakan
beberapa
faktor
yang
2.
Konsentrasi Gel
1
2
3
4
5
6
7
Agarose (%)
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2
1.5
2.0
3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu
bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circularopened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat
yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan
laju migrasi ini karena:
Kelompok 2
Kelompok 2
memisahkan,
mengidentifikasi,
Kelompok 2
BAB II
METODE KERJA
2.1.
Kelompok 2
Kelompok 2
B. Elektroforensis DNA
Disiapkan tray / cetakan gel elektroforensis untuk membuat cetakan
gel. Ditutup rapat sisi-sisi yang terbuka dengan menggunakan selotip.
BAB III
HASIL PENGAMATAN
Isolasi
DNA
strawberry 0,1 mL
buah
Warna
larutan
merah
pekat (merah darah)
Strawberry
pekat
larutannyah,
belum
terbentuk
endapan,
butiran kasar masih tersebar di sekitar larutan.
2
Setelah diinkubasi dalam penangas air suhu
60C selama 20 menit
3
4
Setelah
di
sentrifuge
dengan kecepatan 14000
rpm selama 10 menit
5
Setelah sentrifuge kedua
dengan
kecepatan
14000rpm
selama
10
menit.
6
Setelah ditambahkan alkohol 00% sebanyak
2x volume total sampel.
Larutan bening
DNA
Keterangan
1
Sampel DNA ( telah dilarutkan dalan TE
sebanyak 30 mikroliter ) yang telah disimpan
pada suhu 4C selama 24 jam dan siap di
elekstroforesis.
2
Loading dye,
Loading dye akan ditambahkan ke dalam
3
4
Sampel dimasukkan ke dalam sumur yang
terdapat dalam gel, alat siap dipasang dan
disambungkan ke sumber listrik ( elektroforesis
pada daya 100 volt selama 30 menit )
BAB IV
PEMBAHASAN
4.1. Pembahasan Isolasi DNA
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding
dan membrane sel dan juga membrane inti. Berdasarkan hasil pengamatan,
larutan yang berisi strawberry dan buffer berwarna merah sesuai dengan
warna buah strawberry. Penambahan buffer ekstraksi ini berfungsi untuk
melisiskan membran sel. Dan penambahan SDS 20% bertujuan untuk
melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein sehingga DNA pada
jaringan buah strawberry dapat diisolasi. Larutan dalam tabung tersebut
dihomogenkan dengan menggunakan vorteks.
Kemudian diinkubasi sehingga menghasilkan perubahan warna
larutan. Penginkubasian sampel dalam waterbath bersuhu 65oC selama 20
menit ini dilakukan untuk mengoptimalikan kerja buffer ekstrak. Langkah
selanjutnya adalah penambahan Potassium asetat yang bertujuan untuk
membentuk senyawa kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel.
Yang kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi yang bertujuan untuk
memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan
DNA. Proses ini menghasilkan larutan dengan dua fasa, yakni fasa atas dan
endapan. Kemudian, setelah fasa atas di ambil dan dipindahkan ke dalam
tabung baru, ditambahkan Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI) yang
dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan
pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul lain
seperti polisakarida, yang diharapkan akan didapatkan supernatan yang
berisi DNA bebas kontaminan. Kloroform berfungsi sebagai pendenaturasi
protein,tetapi DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena tidak larut didalam
pelarut organik seperti kloroform.
Kemudian dilakukan penambahan alkohol sebagai presipitasi DNA
setelah dilakukan sentrifugasi dan pemindahan fasa. Penambahan alkohol
ini berfungsi sebagai penghilang kloroform. Sebab apabila kloroform masih
berada di dalam sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja enzimenzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler.
BAB V
PENUTUP
5.1. Kesimpulan
Untuk melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan, diperlukan
beberapa senyawa kimia tertentu. Senyawa-senyawa tersebut diantaranya
buffer ekstraksi yang berfungsi untuk melisiskan membran sel, SDS 20%
yang berfungsi untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein,
Potassium asetat yang bertujuan untuk membentuk senyawa kompleks
CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel, Phenol:Chloroform:Isolamyl
Alkohol (PCI) yang berfungsi untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan,
Fenol yang berfungsi untuk mendapatkan supernatan yang berisi DNA
bebas kontaminan, Kloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein
kecuali DNA dan RNA, dan alkohol yang berfungsi sebagai penghilang
kloroform.
Sedangkan, dalam melaksanakan elektroforesis DNA, diperlukan
Buffer TAE 10 x (400mM Tris asetat, 10 mM EDTA pH 8), Agarose,
Loading Buffer, DNA Marker, dan Etidium Bromida yang akan mewarnai
DNA.
5.2. Saran
Pada saat praktikum, sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum
dilakukan dengan sesuai dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi
dapat mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini
terutama dalam penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah
ditentukan dalam petunjuk kegiatan praktikum.
JAWABAN PERTANYAAN
A. Pertanyaan tentang Isolasi DNA
1. Hitunglah jumlah senyawa yang dimasukkan pada tahapan kerja nomer 5,
14, dan 18!
Jawab :
Pada tahapan kerja nomor 5, buffer ekstraksi yang ditambahkan adalah
sebanyak: 400 L
Pada tahapan kerja nomor 14, kloroform: isoamil alcohol (24:1) yang
ditambahkan adalah sebanyak: 250l dan 125 l
Pada tahapan kerja nomor 18, alcohol yang ditambahkan adalah
sebanyak: 1000 l.
2. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam proses isolasi
DNA!
Jawab :
Buffer ekstraksi : untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid
bilayer.
SDS 20% : pelarut lipid dari membran sel, melisiskan dinding sel dan
mendenaturasi protein.
Potassium asetat : berikatan dengan debris sel dan protein sehingga
membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potassium asetat-proteindebris sel.
Kloroform & Isoamil alcohol : mendenaturasi protein yang masih
menempel pada kromosom.
Alcohol : mempresipitasi asam nukleat.
B. Pertanyaan tentang Elektroforesis DNA
1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis Anda!
Jawab :
2. Mengapa DNA Anda hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV?
Jelaskan!
Jawab :
Molekul DNA hanya dapat diamati dengan bantuan sinar ultraviolet
karena pada pewarnaan molekul DNA tersebut menggunakan zat pewarna
etidium bromida dan etidium bromida akan berinteraksi dengan basa dari
molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang
dapat dilihat dengan bantuan sinar ultraviolet.
3. Apakah etidium bromida? Bagaimana cara kerja etium bromida dalam
proses pewarnaan DNA?
Jawab :
Etidium merupakan sebuah molekul yang dapat mengikat kuat pada
DNA. Etidium juga biasa digunakan dalam biokimia untuk memvisualisasi
potong-potongan DNA yang telah di pisahkan pada gel elektroforesis.
Molekul etidium berpendar fluor ketika diiluminasi dengan cahaya
ultraviolet (UV) pada kisaran visible UV. Etidium mengikat dengan cara
menyisip di antara ikatan basa pada untai ganda DNA. Struktur cincin
etidium adalah hidrofobik dan mirip dengan struktur cincin pada DNA.
Etidium dapat membentuk kontak van der Walls tertutup dengan pasangan
basa dan hal ini merupakan jawaban bahwa mengapa etidium mengikat
pada lokasi hidrofobik molekul DNA (Wicaksono, 2009).