BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Penelitian

Indonesia merupakan Negara beriklim tropis yang memiliki kelembaban tinggi sehingga

memungkinkan untuk tumbunya berbagai tanaman mikroorganisme dengan baik.salah satu

mikroorganisme yang dapat tumbuh dengan baik adalah jamur yang merupakan salah satu

masalah di negara-negara di daerah tropis seperti di Indonesia.Kondisi kulit yang mudah

berkeringat dan lembab,kebersihan diri,pola hidup yang tak sehat kurang mejadi perhatian bagi

kebanyakan masyarakat Indonesia,tak terjaga dan kurangnya pengetahuan tentang kesehatan

merupakan factor yang memungkinan pertumbuhan jamur penyebab penyakit kulit.penyakit kulit

yang disebabkan oleh jamur ditandai dengan bercak bersisik,rasa gatal di daerah yang terkena

terutama ketika berkeringat,daerah yang terkena perlahan menjadi melebar.jamur adalah

organisme mikroskopis tanaman yang terdiri dari sel,seperti cendawan dan ragi

Beberapa jenis jamur dapat berkembang pada permukaan tubuh yang bisa menyebabkan infeksi

kulit,kuku,mulut dan vagina.Jamur yang paling umum menyebabkan penyakit kulit adalah

tinea.infeksi umum yang ada pada mulut dan vagina disebut sariawan hal ini itu disebabkan oleh

Candida.Mekanisme kerja obat antijamur dengan mempengaruhi sterol membrane plasma sel

jamur ,sintesis asam nukleat jamur dan dinding sel jamur.Obat Anti jamur terdiri dari beberapa

kelompok yaitu:polyene (amfoterisinB,nistatin,natamisin Kelompok

Azol(Ketokonazole,ekonazol,klotrimazol,mikonazol,flukonazol,itrakonazol),

allilamin(terbinafin),grisefulvin dan flusitosin.

1
 Ketokonazole merupakan obat anti jamur yang mempunyai spectrum antimikotik yang

efektif terhadap dermatofit dan ragi.Ketokonazole digunakan untuk mengatasi infeksi jamur pada

kulit. Misalnya kurap pada bagian kaki,panu seta ketombe.antijamur ini berfungsi membunuh

jamur penyebab infeksi,sekaligus mencegah tumbuh nya kembali.Obat ini termasuk golongan

imidazole sintetik.Ketokonazole bekerja terutama dengan menghambat enzim sitokrom P450 14

a-demethylase. Enzim ini berperan dalam jalur biosintesis sterol yang mengarah dari lanostrerol

ke ergosterol,sebagai antiandrogen mekanisme aksinya dibedakan menjadi dua,pertama

memblokir biosintesis testicular dan adrenal androgen sehingga terjadi penurunan tingkat

sirkulasi testosterone. Ketokonazole merupakan antagonis reseptor androgen seperti testosterone

dan dihidrotestosteron (DHT) untuk mengikat reseptor androgen,Ketokonazole mempunyai

ikatan yang kuat dengan keratin dan mencapai keratin dalam waktu 2 jam melalui kelenjar

keringat ekrin.

Namun saat Sekarang ini banyak obat-obat yang digunakan untuk anti jamur.,Maka oleh

sebab itu Penjaminan kualitas obat sangatlah penting dilakukan maka untuk memenuhi

persyaratan untuk pengunaanya dibutuhkan lah Validasi Metoda Analisa

.Istilah Validasi pertama kali dicetuskan oleh Dr.Bernard T.Loftus Direktur Food an Drug

Administration (FDA) Amerika Serikat pada akhir tahun 1970-an sebagai bagian penting dari

upaya untuk meningkatkan mutu produk industry Farmasi.Validasi merupakan suatu proses

penilaian sesuai tidaknya suatu metoda harus divalidasi berdasarkan parameter parameter

tertentu.Validasi dilkukan untuk menguji keakuratan metode baru atau metode standar yang telah

dimodifikasi.terdapat beberapa manfaat validasi metoda analisa yaitu evaluasi kinerja suatu

metode analisis,menjamin akurasi dan presisi dari hasil prosedur analisa.Penetapan kadar zat

2
aktif ketokonazole dapat dilakukan dengan menggunakan alat instrument salah satunya

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

Pengguanaan KCKT dapat digunakan untuk menganalisis berbagai macam kandungan

yang komplek dalam suatu bahan serta dapat menetukan residu sampai tingkat microgram.

1.2 Rumusan Masalah

Suatu metoda analisis baru dapat digunakan apabila telah dilakuakan validasi.Hal ini

karena adanya perbedaan alat,keterbatasan alat,bahan kimia atau kondisi lain yang meyebabkan

metoda tersebut tidak dapat diterapkan secara keseluruhan.Sehingga sering dilakukan

modifikasi,penyederhanaan maupun perbaikan metode ,akibatnya metoda tersebut harus

divalidasi dengan cara yang benar.

1.3 Tujuan Penelitian

1. Membuktikan bahwa validasi metoda analisa penetapan kadar kandungan zat aktif

ketokonazole yang digunakan secara konsisten dapat memberikan hasil yang akurat
2. Menunjukan bahwa semua metode tetap yang digunakan sesuai dengan tujuan

penggunaanya sehingga memiliki hasil yang dapat dipercaya

3. Menjamin bahwa performan karakteristik metode analisis sesuai dengan tujuan dan selalu

memberikan hasil yang dapat dipercaya

1.4 Kegunaan Penelitian

1. Metoda yang didapat bisa digunakan untuk pemeriksaan analisa rutin

2. Dapat mengetahui sejauh mana ketepatan dan kecermatan suatu instrument pengukuran

dalam melakukan fungsi ukurannya agar data yang diperoleh bisa relevan

BAB II

3
 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Ketokonazole

Struktur Ketokonazole

Gambar 2.1 Struktur kimia Ketokonazole (Sweetman,2009)

Nama Kimia : cis-1-Acetyl-4-(4-((2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1H-1M-idazol-1

ylmeth l)-1,3-dioxolan-4-yl) methoxy) phenyl)-piperazine

Rumus Molekul : C26H28N4O4Cl2

Bobot Molekul : 531,431 g/mol

Pemerian : Berbentuk Putih

Titik lebur : 1480-1520

Kelarutan :

Penyimpanan : Dalam Wadah tertutup Rapat terlindung dari cahaya matahari

Ketokonazol adalah suatu obat anti jamur turunan imidazol yang memiliki

aktivitas antifungi yang efektif terhadap dermatofit, ragi, misalnya

tricophyton,

epidermophyton , microsporum, candida albicans (Katzung, 2004).

pedis yang disebabkan oleh Trichopyton, Epidermophyton. Juga untuk

4
 pengobatan Candidiasis kulit dan mycose permukaan atau disebut tinea

(Katzung, 2004)

Ketokonazol adalah obat anti jamur turunan imidazol yang mempunyai

aktivitas antijamur, baik sistemik maupun nonsistemik. Banyak industri

Farmasi yang memproduksi obat tersebut, sehingga perlu dikembangkan

metode analisis kuantitatifnya untuk pengawasan mutu. Ketokonazol

dalam sediaan tablet menurut Farmakope Indonesia IV dan United Stated

Pharmacopoeia 27 ditetapkan kadarnya secara kromatografi cair kinerja

tinggi (KCKT)

2.2 Tablet

Tablet adalah bentuk sediaan padat yang terdiri dari satu atau lebih bahan obat yang

dibuat dengan pemadatan, kedua permukaannya rata atau cembung.Tablet memiliki perbedaan

dalam ukuran, bentuk, berat, kekerasan, ketebalan. Kebanyakan tipe atau jenis tablet

dimaksudkan untuk ditelan dan kemudian dihancurkan dan melepaskan bahan obat ke dalam

saluran pencernaan.Tablet dapat diartikan sebagai campuran bahan obat yang dibuat dengan

dibantu zat tambahan yang kemudian dimasukan kedalam mesin untuk dikempa menjadi tablet.

1. Menurut FI Edisi IV

Tablet adalah sediaan padat mengandung bahan obat dengan atau tanpa bahan pengisi

2. Menurut USP 26 (hal : 2406)Tablet adalah sediaan bentuk padat yang mengandung obat

dengan atau tanpa bahan pengisi. Berdasarkan metode pembuatannya, dapat diklasifikasikan

sebagai tablet atau tablet kompresi.

5
 3 Menurut British Pharmacopeae ( BP 2002)

Tablet adalah Sediaan padat yang mengandung satu dosis dari beberapa bahan aktif

dan biasanya dibuat dengan mengempa sejumlah partikel yang seragam.

4 Menurut Formularium Nasional Edisi II

Tablet adalah sediaan padat kompak, dibuat dengan cara kempa cetakdalam bentuk

umumnya tabung pipih yang kedua permukaannya rata atau cembung, mengandung

obat dengan atau tanpa zat pengisi.

5 Menurut ANSEL Edisi IV

Tablet adalah bahan obat dalam bentuk sediaan padat yang biasanya dibuat dengan

penambahan bahan tambahan farmasetika yang sesuai.

6 Menurut Buku Pelajaran Teknologi Farmasi

Tablet adalah sediaan obat padat takaran tunggal. Sediaan ini dicetak dari serbuk

kering, kristal atau granulat,umumnya dengan penambahan bahan pembantu,pada

mesin yang sesuai dengan menggunakan tekanan tinggi. Tablet dapat memiliki bentuk

silinder,kubus, batang dan cakram serta bentuk seperti telur atau peluru.

2.2.1 Macam-macam bentuk tablet

1. Bentuk silinder

2.Bentuk kubu

3.Bentuk cakram

4.Bentuk bundar

5.Bentuk batang

6.Bentuk telur/peluru

7.Bentuk pipih/sirkuler

6
 8.Bentuk oval

9.Bentuk cincin

10.Bentuk segitiga,segi empat,segi lima, banyak segi, segiempat, panjang, bentuk hati.

2.2.1 Penggolongaan

A Berdasarkan Metode Pembuatan

Dikenal dua jenis tablet berdasarkan metode pembuatan, yaitu tablet cetak dan

tablet kempa.

Dibuat dari bahan obat dan bahan pengisi, umumnya mengandung laktosa dan

serbuk sukrosa salam berbagai perbandingan. Massa dibasahi dengan Etanol

prosentasi tinggi kadar Etanol tergantung dengan kelarutan zat aktif dan bahan

pengisi dalam pelarut, serta kekerasan tablet yang diinginkan. Pembuatan dengan

cara menekan massa serbuk lembab dengan tekanan rendah pada lubang cetakan.

Kemudian dikeluarkan dan dibiarkan kering.

1 Tablet cetak agak rapuh sehingga tablet dapat di potek dan harus hati-hati saat

pengemasan dan pendistribusiannya., besar tekanan pada tablet 25-50

bar.Kepadatan tablet tergantung pada pembentukan kristal yang terbentuk selama

pengeringan, tidak tergantung pada kekuatan yang diberikan

2. Tablet kempa

Tablet kempa didefinisikan sebagai bentuk sediaan padat yang dibuat dengan

cara pengempaan dari sebuah formula dengan memberikan tekanan tinggi

(tekanan di bawah beberapa ratus kg/cm2) pada serbuk/granul menggunakan

7
 pons/cetakan baja. Umumnya tablet kempa mengandung zat aktif, bahan pengisi,

bahan pengikat, desintegran, dan lubrikan, tetapi dapat juga mengandung bahan

pewarna, bahan pengaroma, dan bahan pemanis.Tablet biasanya mempunyai

ketebalan kurang dari diameternya.Tablet kempa ganda, tablet kempa yang

dibuat dengan lebih dari satu kali siklus tekanan.

B. Berdasarkan Jenis Bahan Penyalut

Berdasarkan jenis bahan penyalut, tablet dapat dibedakan menjadi:

1) Tablet salut biasa / salut gula (dragee), Adalah tablet kempa yang disalut dengan

beberapa lapisan gula baik berwarna maupun tidak. Lapisan gula berasal dari suspensi

dalam air mengandung serbuk yang tidak larut, seperti pati, kalsium karbonat, talk, atau

titanium dioksida yang disuspensikan dengan gom akasia atau gelatin.

2) Tablet salut selaput (film-coated tablet), Tablet kempa yang disalut dengan salut tipis,

bewarna atau tidak dari bahan polimer yang larut dalam air yang hancur cepat di dalam

saluran cerna. Penyalutan tidak perlu berkali-kali. Disalut dengan hidroksi propil metil

selulosa, metil selulosa, hidroksi propil selulosa, Na-CMC, dan campuran selulosa asetat

ftalat dengan PEG yang tidak mengandung air atau mengandung air.

3) Tablet salut kempa adalah tablet yang disalut secara kempa cetak dengan massa

granulat yang terdiri atas laktosa, kalsium fosfat, dan zat lain yang cocok. Mula-mula

dibuat tablet inti, kemudian dicetak lagi bersama granulat kelompok lain sehingga

terbentuk tablet berlapis (multi layer tablet). Tablet ini sering di gunakan untuk

pengobatan secara repeat action.

8
4) Tablet salut enteric (enteric-coated tablet), atau lepas tunda, Adalah tablet yang

dikempa yang disalut dengan suatu zat yang tahan terhadap cairan lambung, reaksi asam,

tetapi terlarut dalam usus halus. maka diperlukan penyalut enterik yang bertujuan untuk

menunda pelepasan obat sampai tablet melewati lambung. Bahan yang sering digunakan

adalah alol, keratin, selulosa acetat phtalat.

5) Tablet lepas lambat, Tablet yang pelepasan zat aktifnya dimodifikasi sehingga tablet

tersebut melepaskan dosis awal yang cukup untuk efek terapi yang kemudian disusul

dengan dosis pemeliharaan sehingga jumlah zat aktif atau konsentrasi zat aktif dalam

darah cukup untuk beberapa waktu tertentu. (misal tablet lepas lambat 6 jam, 12 jam,

dsb).

6) Tablet berlapis, tablet yang disiapkan dengan pengempaan granuler tablet pada

granulasi yang baru dikempa. Proses ini dapat diulangi untuk menghasilkan tablet

berlapis banyak dari 2 atau 3 lapisan.

Tujuan Penyalutan Tablet

Melindungi zat aktif yang bersifat higroskopis atau tidak tahan pada pengaruh udara ,

kelembapan dan cahaya.

Menutupi rasa dan bau yang tidak enak

Membuat penampilan yang lebih baik dan menarik

Mengatur tempat pelepasan obat dalam saluran cerna. Misalnya tablet enteric yang pecah

di usus

9
C. Berdasarkan Cara Pemakaian

Berdasarkan cara pemakaiannya, tablet dapat dibagi menjadi:

1. Tablet biasa / tablet telan.

Dibuat tanpa penyalut, digunakan per oral dengan cara ditelan, pecah di lambung.

2. Tablet kunyah (chewable tablet)

Bentuknya seperti tablet biasa, cara pakainya dikunyah dulu dalam mulut kemudian

ditelan,

umumnya tidak pahit. Dimaksudkan untuk dikunyah sehingga meninggalkan residu yang

memberikan rasa enak di mulut.Diformulasikan untuk anak-anak, antasida dan antibiotic

tertentu. Dibuat dengan cara dikempa .biasanya digunakan manitol, sorbitol dan sukrosa

sebagai pengikat dan pengisi. Tablet kempa yang mengandung zat aktif dan eksipien yang

harus dikunyah sebelum ditelan.

3. Tablet hisap (lozenges, trochisi, pastiles)

Sediaan padat yang mengandung satu atau lebih bahan obat, umumnya dengan bahan

dasr beraroma dan manis, yang membuat tablet melarut atau hancur perlahanlahan dalam

mulut. Tablet yang mengandung zat aktif dan zat-zat penawar rasa dan bau, dimaksudkan

untuk disolusi lambat dalam mulut untuk tujuan lokal pada selaput lendir mulut. Tablet

ini dibuat dengan cara tuang disebut pastilles atau dengan cara kempa tablet

menggunakan bahan dasar gula disebut trochisi. Umumnya mengandung antibiotic,

antiseptic, adstringensia.

4. Tablet larut (effervescent tablet)

10
 Dibuat dengan cara dikempa. Selain zat aktif, tablet mengandung campuran zat asam

dannatrium bikarbonat yang jika dilarutkan dengan air akan menghasilkan CO2. Diberi

wadah yang tertutup rapat dan terlindung dari lembab, di etiket diberi tanda bukan untuk

ditelan. Tablet ini harus dilarutkan dalam air baru diminum.Contohnya Ca-D-Redoxon,

tablet efervesen Supradin.

5. Tablet Implantasi (Pelet)

Tablet kecil, bulat atau oval putih, steril, dan berisi hormon steroid, dimasukkan ke bawah

kulit dengan cara merobek kulit sedikit, kemudian tablet dimasukkan, dan kulit dijahit

kembali. Zat khasiat akan dilepas perlahan-lahan. Dibuat berdasarkan teknik aseptik,

mesin tablet harus steril. Dimaksudkan untuk implantasi subkutan (Untuk KB, 3-6 bulan,

mencegah kehamilan).

6. Tablet hipodermik (hypodermic tablet)

Tablet cetak/kempa yang dibuat dari bahan mudah larut/melarut sempurna dalam air.

Umumnya digunakan untuk membuat sediaan injeksi steril dalam ampul dengan

menambahkan pelarut steril (FI IV). Umumnya berbobot 30 mg dan disuntikkan di

bawah kulit (subkutan).Dilarutkan lebih dahulu sebelum dijadikan injeksi hipodermik.

7. Tablet bukal (buccal tablet)

Digunakan dengan cara meletakkan tablet diantara pipi dan gusi, sehingga zat aktif

diserap secara langsung melalui mukosa mulut. Tablet biasanya berbentuk oval, keras dan

berisi hormon. Bekerja sistemik, tererosi atau terdisolusi di tempat tersebut dalam waktu

yang lama (secara perlahan).

8. Tablet sublingual

11
 Digunakan dengan cara meletakkan tablet di bawah lidah sehingga zat aktif secara

langsung melalui mukosa mulut, diberikan secara oral. Tablet kempa berbentuk pipih

yang berisi nitrogliserin. Biasanya untuk obat penyempitan pembuluh darah ke jantung

(angina pectoris) sehingga harus cepat terlarut agar dapat segera memberi efek terapi.

Diabsorbsi oleh selaput lendir di bawah lidah.

Penetapan Kadar zat aktif

Tablet Ketokonazole mengandung Ketokonazole C26H28Cl2N4O4,tidak kurang dari 90%

dan tidak lebih dari 110% dari jumlah yang tertera pada etiket.

2.4 Kromaografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi Cair kinerja Tinggi atu KCKT atau bisa juga disebut dengan

HPLC(High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun

1960-an dan awal tahun 1970-an.Saat ini,KCKT merupakan teknik pemisahan yang

diterima secara luas dan paling cepat berkembang untuk analisis dan pemurnian senyawa

tertentu dalam suatu sampel.

Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa

organic,anorganik,maupun senyawa biologis ,analisis ketidakmurnian

(impurities);analisis senyawa senyawa yang tidak mudah menguap ,penentuan molekul

molekul netral ,pemisahan senyawa senyawa yang strukturnya hampir sama ,pemisahan

senyawa senyawa dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industry.KCKT

merupakan metoda yang dapat digunakan dengan baik untuk analisa kualitatif maupun

kuantitatif (Gandjar&Rohman,2007;Harmita,2006)

2.4.1 Prinsip dasar dari HPLC

12
 Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan

kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai

fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada

HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan

terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu

retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya

terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <

senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan

alkohol < golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif

cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time

(RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai

peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari

signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama.

Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga

dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang

dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC

adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom

C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya.

Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom

13
 Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-,

di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis

kolom dan juga fasa mobil., Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap

selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal

kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan

banyaknya jenis komponen dalam sample.

Komponen KCKT, yaitu :

a. Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Bahan yang umum digunakan adalah

gelas dan baja antikarat. Daya tampung tandon harus lebih besar dari 500 ml yang dapat

digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit.
b. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang

secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini

ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan sifat komponen-

komponen sampel (Johnson, 1991).

14
 Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah salah satu variabel

yang mempengaruhi pemisahan. Dalam KCKT, terdapat keragaman yang luas dari solven

yang digunakan dalam semua metode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang

diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua solven. Fase gerak harus:
1. Murni; tidak ada pencemar/kontaminan
2. Tidak bereaksi dengan pengemas
3. Sesuai dengan detektor
4. Melarutkan cuplikan
5. Mempunyai viskositas rendah
6. Mudah recovery cuplikan
7. Tersedia di perdagangan
Dari semua persyaratan di atas, 4 persyaratan pertama adalah yang paling

penting.Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut karena

udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga

data tidak dapat digunakan (Syarif, 2009).

c. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat

sebagaimana syarat wadah pelarut, yaitu : pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan

yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon dan batu nilam.

Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Pompa yang digunakan

untuk tujuan preparatif harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/

menit (Rohman, 2007).

d. Injektor

Ketepatan pengukuran kromatografi cair ditunjukkan dengan reprodusibilitas pengepakan

kolom. Terlebih lagi dengan adanya pengaruh injeksi sampel. Dengan demikian, volume

15
 sampel harus sangat kecil (Skoog, 1998). Pada saat pengisian sampel, sampel

digelontorkan melalui keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada

saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan

menggelontorkan sampel ke kolom. (Gandjar dan Rohman, 2007).

e. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis

bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi

menjadi dua kelompok:

1. Kolom analitik: garis tengah dalam 2-6 nm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk

kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, sedangkan untuk kemasan mikropartikel

berpori biasanya 10-30 cm;

2. Kolom preparatif : umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 2-100

cm.

f. Fase Diam
Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam

diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang

stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya

cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam.

KCKT menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran

partikel penunjang 50 nm, sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi

(Khopkar, 2003).
g. Detektor
Detektor ideal untuk KCKT tidak perlu responsif dalam berbagai rentang suhu. Sebuah

detektor KCKT harus memiliki volume internal minimal untuk mengurangi zona yang

luas dan harus kompatibel dengan aliran cairan. Jenis detektor kromatografi cair terdiri

16
 dari dua jenis. Bulk-properti detektor menanggapi fase gerak massal, seperti indeks bias,

konstanta dielektrik atau kepadatan yang dimodulasi oleh kehadiran zat terlarut.

Sebaliknya, solut-properti detektor merespon beberapa properti dari zat terlarut, seperti

absorbansi UV, fluoresensi atau difusi. Detektor DAD yang paling banyak digunakan

untuk kromatografi cair didasarkan pada penyerapan ultraviolet atau radiasi visibel

(Skoog, 1998).

h. Pengolahan Data

Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang

secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram. Guna kromatogram diantaranya adalah

waktu retensi yang selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi dapat digunakan

untuk identifikasi (kualitatif), luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang

diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi (kuantitatif), untuk

mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom (kapasitas, selektifitas, jumlah pelat

teoritis, jarak setara dengan pelat teoritis dan resolusi).

Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT dibedakan atas :
a. Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika gel,

alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti n-heksan. Pada fase normal

(fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan

meningkatnya polaritas pelarut (Gandjar dan Rohman, 2007).

b. Kromatografi Fase Terbalik

Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat nonpolar yang banyak dipakai

adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8), sedangkan fase geraknya

bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril (Mulja dan Suharman, 1995). Pada fase

17
 terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan

meningkatnya polaritas pelarut(Gandjar dan Rohman, 2007).

2.7 Validasi

Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang

dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk

penggunaannya (WHO, 1992).

Parameter-parameter validasi yang diuji pada penelitian ini adalah batas deteksi,

batas kuantifikasi, linearitas, keseksamaan dan kecermatan (Rohman, 2007).

A. Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem adalah pengujian yang dimaksudkan untuk memastikan kesesuaian

dan keefektifan sistem operasional yang digunakan (Depkes, 2001). Uji ini diperlukan jika

metode analisis yang dilakukan digunakan secara rutin. Proses pengerjaan uji kesesuaian sistem

ini yaitu dengan mengukur larutan standar sebanyak lima kali dan menghitung faktor ikutan (T)

puncak kromatogram yang dihasilkan. Kriteria penerimaan uji kesesuaian sistem yaitu jika 0.5

T 2.0 (Levin 2002; FDA, 1994). Uji kesesuaian sistem dihitung dengan rumus berikut.
A 5 %h+ B 5 %h
T=
2 X A 5 %h

Keterangan:

T : faktor ikutan ,

A5%h : lebar setengah pertama puncak (A) pada 5% tinggi puncak,

B5%h : lebar setengah kedua puncak (B) pada 5% tinggi puncak

18
 Kualitas pemisahan dengan kromatografi kolom dapat dikontrol dengan melakukan

serangkaian uji kesesuaian sistem yang meliputi ukuran banyaknya pelebaran puncak dari

masing-masing puncak solut (efisiensi) dan tingkat pemisahan puncak-puncak yang berdekatan

(resolusi) (Gandjar dan Rohman, 2007). Uraian mengenai parameter-parameter untuk uji

kesesuaian sistem terinci sebagai berikut :

a. Resolusi (daya pisah)

Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling

berdekatan (tR = tR2-tR1) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W1 + W2)/2.
2 tR
Rs=
W 1+W 2

Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak

yang baik (base line resolution) (Rohman, 2009).

b. Faktor pengekoran (tailing factor)
Jika puncak yang dikuantifikasi asimetri (tidak setangkup), maka dilakukan perhitungan

faktor pengekoran untuk mengontrol atau mengkarakterisasi sistem kromatografi. Puncak

asimetri muncul karena berbagai faktor. Peningkatan puncak yang asimetri akan

menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi dan presisi (Rohman, 2009).

Gambar 2.6 Menghitung besarnya TF pada kromatogram

(Sumber:http://2010/11/uji-kesesuaian-sistem-analisis.html)

Gambar tersebut menunjukkan cara menghitung nilai faktor pengekoran (tailing factor,

TF). Kromatogram yang memberikan harga TF = 1 menunjukkan bahwa kromatogram

19
 tersebut bersifat setangkup atau simetris. Harga TF > 1 menunjukkan bahwa

kromatogram mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom

yang dipakai semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk

melihat efisiensi kolom kromatografi (Rohman, 2009).

c. Efisiensi Kolom
Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (N), waktu retensi (waktu retensi

berbeda untuk masing-masing komponen,menandakan pemisahan yang baik dari masing-

masingnya), tinggi lempeng (H) atau juga disebut HETP. HETP merupakan panjang

kolom kromatografi yang diperlukan sampai terbentuknya satu kali keseimbangan

molekul solut dalam fase gerak dan fase diam. Kolom yang memberikan jumlah lempeng

(N) yang besar dan nilai HETP yang kecil akan mampu memisahkan komponen-

komponen dalam suatu campuran yang lebih baik yang berarti bahwa efisiensi kolom

semakin besar (Gandjar dan Rohman, 2007). Jumlah lempeng (N) dihitung dengan:
tR
N=16 ( ) 2
Wb

Keterangan

tR : waktu retensi solut

Wb : lebar dasar puncak

d. Kapasitas kolom
Kapasitas kolom dinyatakan dalam faktor kapasitas. Faktor kapasitas (k) juga

merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k kecil, maka

komponen tertahan sebentar dalam kolom dan jika nilai k yang lebih besar, maka

pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan

20
 puncaknya melebar sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1 sampai 10.

(Ahmad dan Suherman, 1995). Faktor kapasitas kolom dirumuskan dengan:

t Rt M
k '=
tM

Keterangan:

k : faktor kapasitas

tR : merupakan waktu retensi solut;

tM : waktu retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali).

Volume retensi yang bersesuaian juga dapat digunakan karena volume retensi berbanding

lurus dengan waktu retensi. Volume retensi kadang-kadang terpilih dibanding waktu

retensi karena tR bervariasi dengan kecepatan alir (Rohman, 2009). Volume retensi

selanjutnya dihitung dengan rumus:

V = (Vr-Vm)/Vm

Keterangan:

Vr: volume retensi solut

Vm: volume retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali)

B. Kecermatan (akurasi)

Kecermatan merupakan ukuran yang menunjukkan tingkat kedekatan hasil analisis

(kadar) suatu analit dengan nilai yang sebenarnya. Kecermatan diukur dengan

menghitung perolehan kembali (PK). Perolehan kembali ditentukan menggunakan rumus:

21
 a
PK ( )= X 100
b

Keterangan:

a : konsentrasi perolehan kembali

b : konsentrasi standar

Nilai PK bergantung pada matriks sampel, prosedur proses sampel, dan konsentrasi

analit. Batas penerimaan PK adalah 80-110% (Harmita, 2004).

C. Kesesuaian (linearitas)

Linearitas merupakan ukuran yang menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi antara

kadar analit dengan respons detektor. Linearitas diukur dengan menghitung koefisien

korelasi (r) yang didapat dari kurva hubungan antara kadar analit dengan respons detektor

(Depkes 2001). Respons detektor yang digunakan ialah luas puncak. r yang didapat harus

lebih besar dari 0.990 (ICH, 1994). Secara matematis, nilai r dapat dihitung dengan

menggunakan rumus:

Keterangan:

r : koefisien korelasi

xi : konsentrasi analit setiap ulangan

X
: konsentrasi analit rata-rata

22
 yi : luas puncak setiap ulangan

y : luas puncak rata-rata

D. Keseksamaan (presisi)

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang h

omogen. Keseksamaan dinyatakan dengan koefisien variasi (% KV), dengan persamaan

SD
KV =

Keterangan :

KV : Koefisien variasi

SD : Standar deviasi

X
: Rata-rata

E. Spesifisitas

Spesifisitas adalah kemampuan menguji secara tepat suatu analit dengan adanya

komponen lain dan diperkirakan da sebagain cemaran,hasil degradasi dan matriks sampel

Spesifisiatas ditetapkan dengan membandingkan hasil % kadar sampel produk,standar zat

aktif dan placebo(bahan pembantu)

Kriteria penerimaan:
Larutan placebo tidak memberikan respons pada waktu bersamaan dengan waktu

retensi aktif
Kadar bahan aktif dalam sampel berbeda 2% dari kadar zat aktif standar

23
F. Robustnees (ketangguhan)

Ketangguhan adalah suatu metode analisis untuk tidak terpengaruh oleh variasi kecil

yang sengaja dilakukan pada parameter uji atau metode analisisnya (ukuran pengaruh

factor internal tehadap metode).Umumnya yang diuji adalah stabilitas larutan dalam

penyimpanan waktu pengujian .

Robustness ditetapkan dengan membandingkan konsentrasi antara larutan uji yang

disimpan dalam interval waktu tertentu dengan larutan standar yang dipreparasi segar

24
 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Alur Penelitian

25
sisi

26
 Ketokonazole

Validasi Metoda Analisa

Presisi
Lineritas
Spesifisitas

Uji Kesesuaian sistem

27
3.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat gelas yang umum digunakan di

laboratorium analitik,timbangan analitik,Ultrasonik,Pompa,Vacum,Filter,Vial,

3.2 Bahan

Bahan Yang digunakan untuk Validasi metoda analisa,Standar Sekunder

Ketokonazole,Tablel zoralin,Placebo.

28
 Bahan kimia yang dibutuhkan, air suling ganda untuk KCKT (PT IPHA), purified

metanol untuk KCKT (Merck),Ammoium Asetat(Merck), MeOH for analyisis(JT.Baker)

29