See

discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/287644094

Produksi dan Pengolahan Asam Hialuronat

Article December 2015

CITATIONS READS

0 117

1 author:

Reynard Bonifasius
Bandung Institute of Technology
1 PUBLICATION 0 CITATIONS

SEE PROFILE

All in-text references underlined in blue are linked to publications on ResearchGate, Available from: Reynard Bonifasius
letting you access and read them immediately. Retrieved on: 23 September 2016
 Produksi dan Pengolahan Asam Hialuronat

Reynard*

Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Institut Teknologi Bandung

Jalan Ganesha No. 10, Bandung, Indonesia
*Corresponding Author: reyfasio@students.itb.ac.id

Abstrak
_______________________________________________________________________________________

Asam hialuronat merupakan polisakarida berbentuk linear yang disusun oleh dua unit terulang, terdiri dari
asam (1,4)-glukuranonat (GlcUA) dan (1,3)-N-asetil glukosamin (GlcNAc) dengan rantai polisakarida lebih
panjang dibandingkan glikoprotein, tidak bercabang, tidak memiliki gugus sulfat, serta berikatan dengan
protein inti secara non-kovalen. Asam hialuronat terdapat pada berbagai vertebrata, terutama pada vitreous
humor dan jaringan kartilago. Asam hialuronat terdapat pula pada bakteri patogen, seperti Pasteurella
multocida dan Streptococcus. Asam hialuronat merupakan senyawa yang memiliki penggunaan luas di dunia
medis dikarenakan sifat biokompatibilitasnya yang baik. Ketika asam hialuronat diperoleh dari jaringan
hewan, protein lain dapat terbawa sehingga dapat menyebabkan respon imunologis yang tidak diharapkan.
Isolasi dan purifikasi asam hialuronat dapat berasal dari jaringan hewan ataupun dari hasil fermentasi oleh
bakteri. Isolasi dan purifikasi asam hialuronat yang berasal dari jaringan hewan umumnya dilakukan dengan
digesti enzimatik, sedangkan isolasi dan purifikasi asam hialuronat yang berasal dari fermentasi dapat
dilakukan dengan ekstraksi pelarut organik dan imprinted microbeads. Selain itu, terdapat pula metode isolasi
yang dikembangkan agar spesifik terhadap asam hialuronat yang memiliki berat molekul besar dan asam
hialuronat yang tersulfatasi. Pada umumnya, asam hialuronat yang digunakan berada dalam bentuk linear.
Meskipun demikian, banyak keperluan yang membutuhkan modifikasi secara kimia. Proses modifikasi tersebut
merupakan derivatisasi , seperti modifikasi rantai linear dan pembentukan ikatan kovalen antara rantai asam
hialuronat dengan crosslinking processes. Modifikasi tersebut menghasilkan HA dengan kualitas yang lebih
baik.

Kata kunci : asam hialuronat, fermentasi, purifikasi, biokampatibilitas, modifikasi

_____________________________________________________________________________________

1. Pendahuluan unit disakarida yang sama dengan ikatan

glikosida (-1,4) [3]. Asam hialuronat
Pada tahun 1934, Karl Meyer dan
umumnya memiliki berat molekul antara
John Palmer menulis dalam Journal of
2x105 - 10x107 Da [4]. Pada organisme
Biological Chemistry tentang suatu
hidup, hialuronan disintesis dengan
senyawa polisakarida dengan berat
bantuan enzim hialuronan sintase. Jumlah
molekul besar yang diisolasi dari cairan
unit disakarida terulang umumnya
vitreous mata sapi dan kemudian diberi
mencapai 10.000 unit. Namun demikian,
nama asam hialuronat (HA) [1].
telah dilaporkan terdapat jumlah unit
Asam hialuronat yang dikenal
disakarida terulang mencapai 25000 unit.
sebagai hialuronan merupakan polisakarida
Ukuran massa dari polimer bervariasi dari
berbentuk linear yang disusun oleh dua
satu jaringan ke jaringan lain. Sebagai
unit terulang, terdiri dari asam (1,4)-
contoh, pada umbilikal manusia, ukuran
glukuronat (GlcUA) dan (1,3)-N-asetil
dari hialuronan adalah 3-4 juta Da, dan
glukosamin (GlcNAc). Asam hialuronat
pada cairan sinovial mencapai 6 juta Da.
termasuk jenis glukosaminoglikan
Asam hialuronat terdapat pada berbagai
(mukopolisakarida) dengan rantai
vertebrata. Umumnya asam hialuronat dari
polisakarida lebih panjang dibandingkan
jaringan hewan diekstrak dari pial ayam.
glikoprotein, tidak bercabang, tidak
Pada tahun 1981, Balazs mendapatkan
memiliki gugus sulfat, serta berikatan
paten untuk produksi natrium hialuronat
dengan protein inti secara non-kovalen [2].
yang diekstraksi dari pial ayam dan dapat
Dimer ini dihubungkan oleh ikatan
digunakan untuk kosmetik. Produk tersebut
glikosida (-1,3) membentuk satu unit
mengandung protein 50% - 400%
disakarida, kemudian dihubungkan dengan
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015
asam glukuronat
Gambar 1. Struktur Molekul Asam Hialuronat
lebih banyak dibandingkan yang
terekstrak. Dengan pemanasan 100 C,
sebagian besar polisakarida rusak dan
meninggalkan produk berupa asam
hialuronat dengan berat molekul tinggi dan
asam hialuronat dengan berat molekul
rendah. Selain berasal dari ekstraksi
jaringan hewan, hialuronan terdapat pula
pada kapsul dari beberapa bakteri patogen,
seperti pada Pasteurella multocida,
golongan A dan C dari Streptococcus,
seperti Streptococcus pyrogenes pada
manusia serta Streptococcus equi dan
Streptococcus uberis pada hewan [2].
Asam hialuronat dengan berat
molekul rendah ditemukan pada kapsul
bakteri Streptococcus grup A dan C, dan
Pneumococcus tipe II strain D39R. Secara
industri, asam hialuronat diproduksi oleh
Streptococcus zooepidemicus dan
Streptococcus equi yang menggunakan
sumber karbon dan nitrogen untuk
memproduksi pula asam laktat. Bakteri
tersebut diisolasi dari saluran konjungtivitis
Guinea Pig. S. Zooepidemicus yang telah
diisolasi kemudian dikembangkan pada
tabung Sakaguchi. Pada kondisi titer sel
maksimum, proses kultur diterminasi dan
benzil alkohol ditambahkan untuk
sterilisasi.
Asam hialuronat yang secara
konvensional diekstrak dari cairan vitreous
mata sapi dan pial ayam sulit untuk
menghasilkan asam hialuronat dengan berat
molekul besar. Hal tersebut dikarenakan
2
N-asetil glukosamin
asam hialuronat yang dihasilkan
membentuk kompleks dengan proteoglikan
yang berada pada jaringan hewan. Selain
hal tersebut, penggunaan asam hialuronat
yang berasal dari jaringan hewan telah
menimbulkan masalah etika ketika
digunakan sebagai terapi bagi manusia.
Oleh sebab itu, produksi asam hialuronat
melalui bakteri garam negatif, seperti
Streptococcus lebih dipilih saat ini[3].
Asam hialuronat merupakan senyawa
yang memiliki penggunaan luas di bidang
medis. Akibat sifat biokompatibilitasnya
yang tinggi, hialuronan diaplikasikan untuk
viscosurgery, pengobatan osteoartritis,
oftalmologi, serta sebagai material anti
penuaan pada kosmetik. Selain itu,
kombinasi sifat unik dari asam hialuronant
yang menyebabkan asam hialuronat banyak
diterapkan pada dunia medis, antara lain
sifat higroskopis yang tinggi, viskoelastis,
tidak bersifat imunogen, dan kapasitas
untuk terdegradasi secara aman[5].
Kemampuan yang besar dari polimer untuk
memerangkap air dikarenakan sifat
hidrofilik asam hialuronat. Akibat gugus
karboksil pada rantai asam hialuronat, asam
hialuronat berperilaku sebagai polielektrolit
pada pKa 2,9 dengan kehadiran air.
Molekul asam hialuronat dapat
mengembang sampai 1000 kali hingga
membentuk matriks terhidrasi [7;8]. Sifat
viskoelastik dari asam hialuronat
disebabkan oleh perilaiku reologi dari asam
hialuronat yang menunjukkan elastisitas gel
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 3

yang dikombinasikan dengan viskositas Tabel 1. Nama Dagang Produk yang

fluida. Melalui pengukuran reologi, asam Mengandung HA [12]
hialuronat berperilaku sebagai material
Nama dagang produk mengandung asam hialuronat
pseudo-plastik yang viskositasnya menurun
ketika terjadi kenaikan tegangan geser. AEC Biomatrix Hyaluronic
Sifat reologi dipengaruhi oleh berat Acid SOL
Hyaluronic
molekul dan panjang rantai molekul,
konsentrasi dan kondisi lingkungan seperti Acid
pH [6]. Karena terdapat pada berbagai
Amisil-HA BioCare BHA- BioCare HA-24
jaringan manusia, asam hialuronat memiliki
10 Bio
sifat kompatibilitas yang baik, sehingga
banyak diaplikasikan untuk bidang
biomedik. Selain itu, karena struktur BioCare Polymer BioCare BioCareSA
molekul yang sama untuk semua hewan, BHA-10 Polymer HA-24
molekul asam hialuronat tidak akan
menyebabkan respon sistem imun jika
digunakan pada manusia [8]. Asam Cromoist Glycoderm PC LipoCare HA/E
hialuronat secara in vivo terdegradasi oleh WHYA
hialuronidase menghasilkan produk yang
aman. Kondisi aman tersebut diestimasi Nama dagang produk mengandung Natrium
menggunakan waktu paruh dari asam Hialuronat
hialuronat pada kulit sekitar 24 jam, di mata
sekitar 24-36 jam, di kartilago sekitar 1-3 Actimoist AEC Sodium Avian Sodium
minggu, dan 70 hari di cairan vitreous Hyaluronate Hyaluronate
[9;10;11]. Nilai komersial dari asam Powder
hialuronat melebihi polisakarida lain yang
dihasilkan secara ekstraselular oleh
mikroba. Dengan estimasi nilai jual pasar Hyasol BT LMW Nikkol Sodium
dunia $ US 500 juta, hialuronan terjual $ Hyaluronic Hyaluronate
US 100.000 per kilogram [2]. Pada tabel 1 Acid Na salt
terdapat beberapa nama dagang dari produk
yang mengandung asam hialuronat dan OriStart SH RITA HA C-1C RITA C-1-P
turunannya. Karena sebagian besar
penggunaan asam hialuronat adalah untuk
keperluan medis, maka proses purifikasi
harus menghasilkan asam hialuronat Hylaform Sodium Restylane
dengan kondisi steril. Umumnya metode Hyaluronate
pemurnian yang dilakukan adalah digesti HA-Q
menggunakan protease,presipitasi pasangan
ion, seperti asetil-piridinium klorida, Nama dagang produk mengandung campuran natrium
membran ultrafiltrasi, presipitasi tanpa hialuronat
pelarut, dan liofilisasi [3]. Atecoron Bellsilk HA Biocrystal
Hydalphatine 3P Hydroxan Hydroxan BG
Hydroxan CH Iricalmin Polysin HQ

Spherica HA Thioglycans Toshiki BINS-3

 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 4

2. Purifikasi Asam Hialuronat dari 3. Isolasi dan Purifikasi Asam

jaringan hewan Hialuronat dari Fermentasi
Streptococcus zooepidemicus
Ketika asam hialuronat diperoleh
dari jaringan hewan, protein lain dapat
terbawa, sehingga dapat menyebabkan fermentasi oleh S.zooepidemicus
respon imunologis yang tidak diharapkan.
Untuk memperoleh HA dengan kemurnian
tinggi, dilakukan depolimerisasi sehingga
menghasilkan produk dengan kualitas
rendah. Sebagai contoh, asam hialuronat
Dilusi biomassa 1:1 v/v dengan air
dari mata sapi (diolah oleh Etapharam, bebas pirogen, lalu sentrifugasi pada
Vienna) mengandung 10% protein dari 17686 g, 4C
keseluruhan makromolekul [12]. Protein
yang terikat pada asam hialuronat
umumnya adalah enzim hialuronidase,
antibodi, proteoglikan, reseptor permukaan
sel, serta protein binding yang terikat pada Supernatant ditambahkan 2-propanol
jaringan dan matriks sel. (1:1 v/v) untuk mempresipitasikan HA
Balazs dalam paten "ultrapure"
tentang asam hialuronat, menyebutkan
bahwa tahap esensial yang dilakukan
dibandingkan dengan proses lain adalah
untuk mengolah asam hialuronat yang Presipitat HA disuspensikan kembali
sebagian besar proteinnya telah dihilangkan dalam 3% w/v Na-asetat
dengan kloroform sampai 5 hari. Hal
tersebut dilakukan dengan tujuan
menghilangkan fraksi kecil senyawa
penyebab inflamasi ketika dilakukan injeksi larutan garam HA diolah secara batch
HA pada mata. Kemurnian asam hialuronat dengan silika gel pada 2% w/v dalam
kondisi diaduk dilanjutkan sentrifugasi
dapat berbeda dari suatu batch komersial ke untuk menghilangkan silika
batch komersial lainnya.
Asam hialuronat yang berasal dari
tali umbilikal manusia umumnya
mengandung protein kurang dari 2% dan
kondroitin sulfat kurang dari 3%. Dengan HA yang telah diklarifikasi dilewatkan
pada charcoal filter
menggunakan kondroitinase dan digesti
protease, dilanjutkan oleh denaturasi
termal, dialisis melawan disosiasi buffer,
dan elektroforesis, dapat dihilangkan semua
fragmen kecil, sehingga dihasilkan asam ultrafiltrasi - diafiltrasi pada
hialuaronat yang homogen [12]. pemotongan 50 kDa dengan membran
polimer sulfon

Sterilisasi dengan mikrofiltrasi 0,22 m

Gambar 2. Diagram Alir isolasi dan

Purifikasi HA secara Umum [5;13]
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015
Asam hialuronat dapat dihasilkan oleh
bakteri dengan fermentasi dalam kondisi
anaerobik dengan medium yang diperkaya
oleh glukosa, glikogen, ekstrak ragi, tripton,
KH2PO4,K2HPO4,MgSO4.7H2O,(NH4)2SO4,
dan polistirena [14]. Larutan fermentasi
yang mengandung asam hialuronat lebih
besar dari 2,0 gram/liter dipresipitasi
dengan isopropil alkohol (1:3 v/v). Asam
hialuronat terpresipitasi kemudian
dilarutkan kembali pada larutan 0,15 M
natrium klorida untuk menurunkan
viskositas dan konsentrasi asam hialuronat
(umumnya sampai 0,01 gram HA/liter).
Asam nukleat dan protein lain yang tersisa
kemudian dihilangkan dengan menurunkan
pH larutan dari 6 menjadi 2 dengan
penambahan asam trikloroasetat 0,1 % dan
dilanjutkan dengan charcoal treatment 1-2
% selama satu jam. Setelah itu, larutan
disentrifugasi pada 700 rpm, 4C selama 30
menit.
Setelah sel dan arang disingkirkan,
larutan HA dilewatkan melalui filter
berdiameter 0,45 m (293 mm cassette
holder, Millipore, USA). Larutan HA
kemudian diencerkan sampai lima kali dan
dimurnikan kembali dengan ultrafiltrasi.
Tahap akhir adalah pengubahan konsentrasi
retentat yang mengandung HA sampai
diperoleh konsentrasi awal dengan volume
yang sama dengan volum awal (satu liter)
dan dipresipitasi dengan isopropil alkohol
(1:3 v/v). Penambahan isopropil alkohol
akan menghilangkan berbagai residu
endotoksin yang tersisa pada tahap filtrasi.
Umumnya, kandungan endotoksin diuji
dengan reagen LAL (Charles River
Laboratories, SC , USA). Selain kandungan
endotoksin yang diuji, pada tahap akhir ini,
diukur pula berat molekul menggunakan
hubungan viskositas intrinsik menggunakan
viskometer Cannon-Ubbelhodes. Nilai
viskositas intrinsik yang diperoleh
disubsitusi pada persamaan Mark Houwink
(Martin, 1953; Laurent et al, 1960). Sebagai
standar, nilai intrinsik yang digunakan
didasarkan pada metode dari British
Pharmacopoeia (2003). Karakterisasi dari
HA dilakukan dengan dua cara, yaitu
5
menggunakan spektrofotometer FTIR dan
NMR.
4. Ekstraksi Menggunakan Metode
Digesti Enzimatik.
Umumnya digesti enzimatik
digunakan untuk mengambil asam
hialuronat yang terdapat pada jaringan
hewan. Pada tahap awal, lemak dari
jaringan perlu dihilangkan dengan aseton
dan dikeringkan pada suhu 60C selama 24
jam. Pelet kering kemudian disolubilisasi
dengan 100 mM penyangga natrium asetat
dengan pH 5,5 yang mengandung 5 mM
EDTA dan sistein. Selanjutnya 100 mg
enzim papain ditambahkan untuk tiap gram
jaringan, dan larutan yang terbentuk
diinkubasi selama 24 jam pada 60C
dengan sebuah stirrer. Setelah dididihkan
selama 10 menit, campuran disentrifugasi
dan ditambahkan campuran jenuh etanol
dengan natrium asetat tiga kali campuran
awal. Campuran kemudian ditambahkan ke
supernatant dan disimpan pada suhu 4C
selama 24 jam. Presipitat diambil dengan
sentrifugasi dan dikeringkan pada 60C
[15]. Jaringan dapat pula didigesti
menggunakan pepsin (Bychkov &
Kolesnikova, 1969), pronase (Sven & Zhag,
1986), dan tripsin (Ogston & Sherman,
1958) [4].
5. Ekstraksi Menggunakan Pelarut
Organik dan Natrium Asetat
Dengan cara ekstraksi menggunakan
pelarut organik, jaringan dihomogenkan
dengan aseton dan diinkubasi selama 24
jam pada referigerator. Setelah 24 jam,
aseton disingkirkan dari material dengan
cara memeras jaringan. Pemerasan
dilakukan 10 kali dengan interval 24 jam.
Material ini kemudian diekstraksi dengan
larutan 5% natrium asetat. Ekstraksi
dilakukan bertahap sehingga dihasilkan
cairan kental yang diperas bertahap
menggunakan kain tipis. Etil alkohol
dengan volum 1,5 kali volum ekstrak
ditambahkan. Kemudian presipitat
disatukan, disentrifugasi, dilarutkan
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015
kembali pada 5% larutan natrium asetat,
dan disentrifugasi ulang. Protein
dihilangkan dari supermatant dengan
pengadukan menggunakan kloroform empat
kali. Pada tahap selanjutnya, ditambahkan
kembali campuran kloroform - amil alkohol
(1:4 terhadap 1:2) sampai tidak terbentuk
gel. Larutan terakhir didialisis dengan
tambahan kristal natrium asetat (untuk
membentuk larutan Natrium asetat 5%).
Selanjutnya, larutan diasamkan sampai pH
4,0 dan dipresipitasi menggunakan etil
alkohol. Presipitat didesikasi dalam kondisi
vakum menggunakan kalsium klorida
hingga terbentuk material akhir berwarna
putih dan berserabut (Boas, 1949) [4].
6. Glucuronic Acid Imprinted Microbeads
Kebanyakan dari metode digesti
dengan endohidrolase yang dilanjutkan
kromatografi berdasarkan ukuran partikel,
pertukaran ion, dan HPLC berfungsi
dengan baik untuk oligosakarida yang
terdiri dari minimal dua buah dimer asam
hialuronat (HA4) dan kelipatannya [16].
Pemisahan dan pemurnian tersebut
membutuhkan pelarut organik seperti
Gambar 3. Formasi Template Asam D-Glukuronat [16]
6
etanol, aseton, dan isopropanol dalam
jumlah yang banyak [17;18]. Selain itu,
proses yang rumit dan waktu yang lama
akan menghasilkan biaya yang tinggi.
Teknologi membran yang dimanfaatkan
pada proses tersebut [19;20] umumnya
berfungsi untuk memekatkan HA atau
menyingkirkan sejumlah kecil molekul
terlarut.
Dengan molecular imprinting, dibuat
suatu lokus yang selektif terhadap polimer
sintetik menggunakan suatu template
molekul. Molekul target, yaitu asam
hialuronat dapat digunakan sebagai
template untuk imprinting polimer dengan
membentuk cross-link. Setelah template
awal disingkirkan, polimer yang tersisa
akan bersifat lebih selektif. Selektivitas
dari polimer bergantung pada berbagai
faktor, seperti ukuran serta bentuk dari
ruang dan interaksi antar ikatan [16].
Interaksi kovalen, non-kovalen, dan
koordinasi ion metal dapat pula berfungsi
untuk mengorganisasikan gugus-gugus
fungsi di sekitar template.
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015
Dilihat dari segi kekuatan,
spesifitas, dan pengarahan ikatan,
koordinasi ion metal lebih bersifat kovalen
[21]. Hal ini menyebabkan koordinasi ion
metal memberikan peluang bagi penyiapan
template polimer yang spesifik terhadap
protein melalui pengaturan ligan
permukaan.
Molekul asam D-glukuronat (DGA)
dan N-asetil glukosamin membentuk
struktur asam hialuronat (HA). Gugus
hidroksil pada DGA berinteraksi dengan
ion metal serta menunjukkan interaksi yang
mampu mengelat ion metal [22]. Dari hal
tersebut, dapat dikatakan, DGA berfungsi
sebagai molekul template, dan N-
metakriloilamido-L-histidin tembaga (II)
(MAH-CU(II)) merupakan kompleks yang
bergabung dengan DGA serta berfungsi
sebagai monomer pengelat metal. Molekul
DGA sebagai imprinted microbeads
disiapkan bersama kompleks monomer dan
digunakan sebagai absorben yang selektif
untuk purifikasi asam hialuronat.
6.1 Pembentukan Microbeads
Berdasarkan Akdamar, H.Aelya, et
all dalam Separation and Purification of
Hyaluronic Cid by Glucuronic Acid
Imprinted Microbeads, DGA yang
berfungsi sebagai template adalah sebanyak
1,0 mmol, dan ligan fungsional MAH-Cu2+
sebanyak 1,0 mmol dilarutkan pada 3,0 mL
etanol. Campuran kemudian dirotasi selama
1 jam untuk mengorganisasikan DGA dan
MAH-Cu2+.
DGA-imprinted microbeads
disiapkan dengan bentuk suspensi
menggunakan teknik polimerisasi
berdasarkan prosedur berikut : Pertama,
medium pendispersi disiapkan dengan
melarutkan 0,2 gram polivinil alkohol
dengan 60 mL air distilasi. Setelah itu,
kompleks monomer MAH-Cu2+ - DGA
dicampurkan ke larutan 8,0 mL / 12,0 mL
EDMA / campuran toluen dan 0,09 gram
AIBN dilarutkkan bersama campuran
tersebut [23]. Larutan tersebut kemudian
dipindahkan ke medium pendispersi yang
ditempatkan di magnetically stirrer glass
polymerization reactor 100 mL pada 600
7
rpm dan ditempatkan dalam bak air
termostatik. Reaktor kemudian dibilas
dengan nitrogen berbuih dan kemudian
ditutup. Temperatur reaktor dijaga konstan
75C selama 6 jam, dan polimerisasi
dirampungkan pada 90C selama 3 jam.
Residu - residu seperti monomer yang tidak
terkonversi, inisiator, dan pelarut yang
tersisa dihilangkan dengan campuran 60/40
metanol/air selama 24 jam, dan p(EDMA-
MAH-Cu2+-DGA), lalu dikeringkan dalam
oven vakum selama 70 C. Dengan cara
yang sama, non-imprinted polymer (NIP)
microbeads disiapkan dengan prosedur
polimerisasi.
Sebagai langkah untuk
menghilangkan monomer yang tidak
bereaksi dan komposisi lain dari MIP dan
NIP, maka MIP dan NIP dibilas secara
ekstensif dengan campuran metanol/air
(60/40 %v/v) selama 24 jam pada
temperatur ruang. Setelah pencucian,
template disingkirkan dari microbeads
menggunakan larutan 5 M KOH dalam
metanol selama 48 jam sampai tidak ada
DGA yang tersisa dari larutan sisa.
6.2 Langkah Purifikasi dengan DGA
imprinted microbeads
Purifikasi didahului oleh penambahan
natrium dodesil sulfat (SDS) 0,01 % ke
dalam kultur untuk mengeluarkan asam
hialuronat dari dalam sel. Setelah 15 menit,
campuran ditambah larutan 10 % heksadesil
trimetil amonium bromida hingga terbentuk
flok. Presipitat kemudian disolubilisasi
dalam larutan 2 M CaCl2. Suspensi
kemudian disentrifugasi sampai diperoleh
supernatant. Setelah tahap pra-purifikasi
selesai, asam hialuronat dipisahkan dari
supernatant. Kemudian, larutan
supernatant digunakan sebagai sumber
asam hialuronat. Partikel DGA sebanyak
100 mg kemudian diolah dengan 10 mL
supernatant selama 2 jam disertai magnetic
stirrer pada laju pengadukan 150 rpm.
Partikel kemudian disentrifugasi dan dibilas
untuk menghilangkan molekul yang tidak
terikat. Jumlah molekul asam hialuronat
yang teradsorb pada DGA ditentukan
berdasarkan konsentrasi awal dan akhir
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015
asam hialuronat pada medium. Selanjutnya,
DGA ditempatkan pada medium
pendesorpsi, serta diaduk selama 2 jam
pada 25C dan 600 rpm. Desorpsi asam
hialuronat dari microbead p(EDMA-MAH-
Cu2+) dilakukan dengan larutan 1 M
NaOH. Determinasi dari asam hialuronat
terdesorpsi dilakukan dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
232 nm dengan penambahan enzim
hialuronidase. Satu unit aktivitas
hialuronidase didefinisikan sebagai jumlah
enzim yang menyebabkan kenaikan
densitas optik sebasar 0,001 per menit pada
25C dan pH 7.
7. Isolasi dan Purifikasi Asam
Hialuronat dengan Berat Molekul Besar
secara Spesifik
Asam hialuronat dengan berat
molekul besar merupakan terminologi yang
digunakan untuk asam hialuroant dari
garam hialuronat yang memiliki berat
molekul minimal 1000 kDa [24]. Metode
purifikasi yang melibatkan penyingkiran
pengotor protein dari asam hialuronat
menggunakan filtrasi dengan silika gel dan
pengolahan karbon aktif. Selain
menggunakan filtrasi dengan silika, dapat
digunakan filtrasi menggunakan diafiltrasi.
Diafiltrasi merupakan sebuah proses yang
menggunakan filtrasi crossflow yang
menyebabkan spesi molekul dengan berat
molekul rendah, air, dan solven dapat
keluar dari membran secara lebih cepat dan
mudah tanpa mengubah volum larutan,
serta menyisakan molekul asam hialuronat
dengan berat molekul besar [24].
Berdasarkan EP 2 216 412 A2, dengan
diafiltrasi, maka jumlah solven yang
digunakan dalam proses akan berkurang.
Setelah inkubasi, kaldu fermentasi didilusi
dengan air dan diklarifikasi. Selanjutnya,
HA yang terdapat pada kaldu dipresipitasi
ulang dengan volume yang sama dengan
pelarut yang sesuai, namun tidak terbatas
pada isopropanol. Molekul HA dengan
berat molekul besar yang terpresipitasi
kemudian dikonversi menjadi garam
hialuronat. Selanjutnya, garam hialuronat
dapat disolubilisasi pada prosedur purifikasi
selanjutnya. Pengubahan HA menjadi
8
garam natrium saat ini menggunakan
penambahan 3% natrium asetat, lalu
dihomogenkan sampai larut sempurna.
Metode purifikasi dengan menggunakan
silika gel dapat menghilangkan 68%-70%
kandungan protein. Setelah silika gel
disingkirkan dengan sentrifugasi, HA
dengan berat molekul besar diolah
mengguankan karbon aktif yang mampu
menghilangkan protein sampai 85%-90%.
Campuran kemudian melalui pengolahan
tahap lanjut dengan diafiltrasi. Pada
diafiltrasi, terjadi pelarutan HA dengan
solven seperti air bebas pirogen dengan
jumlah yang lebih sedikit. Proses yang
melibatkan purifikasi molekul HA dengan
berat molekul besar sangat signifikan dalam
menyebabkan penurunan volume.
Diafiltrasi dengan sistem kontinu perlu
melibatkan dilusi yang steril, air bebas
pirogen, filter dengan diameter pori 0,22
m, dan filtrasi aseptik. Sebagai alternatif
tambahan, natrium hialuronat dapat
dipresipitasi ulang dengan isopropanol
untuk menghasilkan HA dengan berat
molekul besar. Selanjutnya, HA dapat
diliofilisasi sampai diperoleh kandungan air
kurang dari 5 %. Proses tersebut tidak
membutuhkan penurunan pH sampai
kondisi asam, penggunaan surfaktan, atau
pun detergen. Selain itu, proses
penghilangan protein tidak melibatkan
bahan kimia berbahaya seperti formalin.
Penggunaan solven dengan jumlah sedikit
mengurangi pula beban masukan pada alat
liofilisasi [24].
8. Metode Lain
Pemisahan asam mukopolisakarida
menjadi fraksi yang memiliki gugus sulfat
dan tidak memiliki gugus sulfat diperoleh
dengan menggunakan kompleks setil
piridium (Scott,1960) [4]. Purifikasi akhir
dilakukan dengan menggunakan DEAE-
Sephadex anion exchanger A-25
(Schmidt,1962)[4]. Presipitasi kromatograsi
sentrifugal (Shinomiya, Kabasawa, Toida,
Imanari, dan Ito, 2001)[4], elektrodeposisi,
ultrafiltrasi-diafiltrasi [25] merupakan
piranti-piranti lain yang memiliki arti
penting dalam memisahkan segmen asam
hialuronat.
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 9

9. Modifikasi Asam Hialuronat

Pada umumnya, asam hialuronat propil karbodiimida) dengan tambahan ko-

yang digunakan berada dalam bentuk aktivator seperti N-
linear. Meskipun demikian, banyak hidroksisulfosuksinimida (-sulfo-NHS-)
keperluan yang membutuhkan modifikasi atau 1-hidroksibenzotriazol (-HOBt-)
secara kimia. Secara khusus proses (Bulpitt & Aeschlimann, 1999 ; Prestwich
modifikasi tersebut merupakan derivatisasi, et al., 1998) [5], crosslinking dengan
seperti modifikasi rantai linear dan disulfida [28], crosslinking yang dimediasi
pembentukan ikatan kovalen antara rantai oleh karbodiimida dan ko-aktivator 2-kloro-
asam hialuronat dengan proses 1-metilpiridinium iodida (CMPI) [29;30;5].
Crosslinking [5]. Modifikasi tersebut Proses- proses tersebut merupakan langkah-
menghasilkan HA dengan kualitas yang langkah yang melibatkan penambahan
lebih baik. Sebagai contoh, HA berbentuk gugus karboksil pada rantai HA. Langkah
linear yang digunakan untuk injeksi intra- lain dalam membentuk crosslinking yang
dermal akan secara cepat terdegradasi melibatkan penambahan gugus hidroksil
sehingga baru akan menyediakan efek yang meliputi crosslinking dengan divinil
bermafaat setelah periode waktu yang sulfonat [31;32;5] dan diepoksida [33].
signifikan. HA yang dimodifikasi sebagai Berikut adalah tabel yang menunjukkan
perbandingan, bersifat lebih tahan terhadap crosslinking dan produk yang
hidrolisis kimia dan enzimatik, dihasilkannya.
menunjukkan aktivitas yang lebih lama dan
lebih baik secara in vivo [7]. Selain itu,
modifikasi Crosslinking juga menambah
keuntungan properti mekanis spesifik pada
material [7].
Selain melalui senyawa tunggal asam
hialuronat, asam hialuronat umumnya pula
dikombinasikan dengan polimer lain seperti
kondroitin sulfat dan karboksi metil
selulosa. Modifikasi gugus fungsi pada
asam hialuronat umumnya melibatkan
gugus hidroksil atau karboksil. Sulfatasi
yang dilakukan pada gugus hidroksil dari
asam hialuronat menunjukkan produk yang
memiliki aktivitas menyerupai heparin [26].
Esterifikasi yang melibatkan gugus
karboksil pada polimer menyebabkan
penurunan muatan polimer total sehingga
meningkatkan sifat hidrofobik HA [27].
Sebagai konsekuensi, kelarutan HA dalam
air akan menurun, sehingga HA lebih stabil
pada lingkungan. Di antara seluruh turunan
HA, benzil ester HA merupakan produk
yang paling banyak tersebar di pasaran.
Banyak cara yang telah digunakan
untuk memproduksi HA dalam bentuk
crosslinked. Strategi tersebut di antaranya
dengan crosslinking menggunakan bis-
karbodiimida (Sadozai et al.,2005) [5],
crosslinking dengan polivalen hidrazida
(misal : EDC/1-etil-3,3-dimetil amino
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 10

Tabel 2. Agen Crosslinking untuk Modifikasi HA [5]

Gugus HA yang Agen Crosslinking Produk Referensi
dilibatkan

Karboksil Bis-karbodiimida HA yang mengalami Sadozai, et al.,2005

Crosslinking pada N-
glukuronil urea atau O-
glukuronil isourea

Polivalen hidrazida- Crosslink pada ikatan Bulpitt, et al.,1999;

karbodiimida, ko- hidrazida Prestwitch, et al.,1998
aktivator

Karbodiimida+ko- Crosslink pada ikatan Radice et al.,2002 ;

aktivator (sulfo eter Young, et al.,2004
NHS/HOBt) atau CMPI

Ditiobishidrazida- Crosslink disulfida Shu, et al.,2003

karbodiimida melalui oksidasi oleh
udara

Agen metakrilat- PhotoCrosslink setelah Leach, et al.,2003 ;

karbodiimida terpapar cahaya
Park, et al., 2003

hidroksil Diepoksida Crosslink pada ikatan Agerup, et al.,1998

eter
Segura, et al., 2005

Divinil sulfon Crosslink pada ikatan Balazs, et al., 1986

eter
Larsen, et al.,1993
Ibrahim,et al.,2010
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 11

10. Karakterisasi Asam Hialuronat

Setelah asam hialuronat dimurnikan,
maka asam hialuronat perlu diuji kondisi fisik
dan kimianya agar layak digunakan sebagai
bahan industri. Berikut adalah spesifikasi uji
asam hialuronat yang diperoleh dari Brittish
Pharmacopeia 2013 dalam Process for
Production and Purification of High
Molecular Weight Hyaluronic Acid, European
Patent Application (2010) EP 2 216 412 A2
[24].

Tabel 3. Spesifikasi Uji Asam Hialuronat [24]

NO UJI SPESIFIKASI

1 Penampakan larutan Larutan jernih, absorbansi larutan yang diukur pada 600 nm tidak
lebih dari 0,01

2 Spektrofotometri IR Spektrum dari uji substansi memiliki kesesuaian dengan spektrum

referensi natrium hialuronat

3 pH Antara 5,0-8,5

4 Asam nukleat Absorbansi pada 260 nm tidak melebihi 0,5

5 Protein Tidak lebih dari 0,3%. Untuk keperluan parenteral tidak boleh lebih
dari 0,1%

6 Klorida Maksimal 0,5%

7 Hilang massa akibat Tidak boleh lebih dari 20%

pengeringan

8 Kadar logam Tidak boleh lebih dari 95% dan tidak lebih dari 105.0% natrium
hialuronat yang dihitung dengan dasar kering
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015
11. Kesimpulan
Asam hialuronat dapat dihasilkan
melalui fermentasi ataupun melalui purifikasi
jaringan hewan. Asam hialuronat yang berasal
dari proses fermentasi memiliki kualitas yang
lebih baik karena bebas dari protein-protein
yang dapat menyebabkan respon imunologis.
Purifikasi asam hialuroant dapat dilakukan
dengan digesti enzimatik, ekstraksi dengan
pelarut organik-natrium asetat, dan imprinted
microbeads. Proses purifikasi yang dipilih
dapat didasarkan dari proses awal
pembentukan asam hialuroanat, seperti
fermentasi atau isolasi dari jaringan hewan.
Selain itu, berat molekul asam hialuroant
yang ingin diperoleh dapat menentukan proses
yang dipilih dalam pemurnian. Setelah melalui
purifikasi, asam hialuronat yang dihasilkan
perlu diuji kualitasnya dengan standar-standar
yang telah ditentukan. Umumnya, senyawa
turunan asam hialuronat lebih banyak
dimanfaatkan dalam industri. Hal tersebut
menyebabkan perlu dilakukan modifikasi
secara kimia pada asam hialuroanat.
Daftar Pustaka
[1] Selyanin, Mikhail A., Boykov, Petr Ya.,
dan Khabarov, Vladimir N., Hyaluronic
Acid, Wiley, Moscow, 2014.
[2] Boeriu, Carmen G.,et all, Production
Methods for Hyaluronan, International
Jounal of Carbohydrate Chemistry
Volume 2013 (2013)
[3] Reddy, K.J., Karunakaran K.T.,
Purification and characterization of
hyaluronic acid produced by
Streptococcus zooepidemicus strain
35237, J.BioSci.Biotech.2013, 2(3) : 173-
179.
[4] Giji,Sadhasivam dan Arumugam,
Muthuvel, Isolation and Characterization
of Hyaluronic Acid from Marine
Carbohydrates : Fundamentals and
Applications, Part A,2014,pp.61-73.
[5] Chiara Schiraldi, Annalisa La Gatta, dan
Mario De Rosa (2010). Biotechnological
Production and Application of
Hyaluronan, Biopolymers, Magdy
Elnashar (Ed.), ISBN : 978-953-307-109-
1, InTech, Available from : Elsevier-Science Direct, 200, pp.1401-
http://www.intechopen.com/books/biopoly
12
mers/biotechnological-production-
characterization-and-applicationof-
hyaluronan
[6] Lapcik L.,Lapcik L. 1998. Hyaluronan :
Preparation, Structure, Properties, dan
Applications. Chem Rev 98(8) : 2663-
2684.
[7] Brown MB, Jones SA, 2005. Hyaluronic
acid : a unique topical vehicle for the
localized delivery of drugs to the skin.
J.Eur Acad Dermatol Venereol 19(3) :
308-18
[8] Matarasso SL,2004. Understanding and
using hyaluronan. Aesthetic Surg J 24 :
361-364
[9] Murray CA, Zloty D. Warshawski
L.,2005. The evolution of soft tissue fillers
in clinical practice. Dermatol Clin 23 :
343-363.
[10] Stern R, Kogan G, Jedrzejas M, Soltes
L,2007. The many ways to cleave
hyaluronan Adv 25 :537-557.
[11] Laurent UBG, Reed RK, 1991. Turnover
of hyaluronan in the tissues. Adv Drug
Deliv Rev 7 :237-256.
[12] Becker, Lillian C.,et all, Final report of the
Safety Assesment of Hyaluronic Acid,
Potassium Hyaluronate, and Sodium
Hyaluronate, International Journal of
Toxixology 28 (2209) 5-67.
[13] Rangaswamy V dan Jain D.,2008. An
efficient process for production and
purification of hyaluronic acid from
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.
Biotechnol Lett 30 : 493-496.
[14] Vazquez, J.A., Montemayor, M.L.,
Fraguas, J., & Murado, M.A. (2010).
Hyaluronic Acid production by
Streptococcus zooepidemicus in marine
by-products media from mussel
processing wastewaters and tuna peptone
viscera. Microbial Cell Factories,9, 46-56.
[15] Volpi, N, (2003). Milligram-scale
preparation and purification of
oligosaccharides of defined length
possessing the structure of chondroitin
from defructosylated capsular
polysaccharide K4. Glycobiology, 13(9),
635-640.
[16] Akdamar,H.Aelya,et all, Separation and
purification of hyaluronic acid by
glucuronic acid imprinted microbeads, in:
Materials Science and Engineering C,
1408.
 Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 13

[17] K.K. Brown, L.L.C. Ruiz, r.Ivo, ologomer content on physical, mechanical,
N.D.Greenner, Patent US5316926 (1994). and biologic properties of divinyl sulfone-
[18] G.Westphal,M.Hahn,E.Lippert,K.Hoffma Crosslinked hyaluronic acid hydrogels.
nn,P.Kaukel, Patent DE10019868 (2002). J.Biomed.Mater.res.94A:355-370.
[19] D.C.Ellwood,C.G.Evans,G.M.Dunn,N,Mc [32] Larsen, N.E., Pollak, C.T., Reiner, K.,
Innes,R.G.Yeo,K.J.Smith,C.Evans,R.Yeo, Leshchiner, E., Balazs, E.A., 1993. Hylan
C.G.T.Evans, Patent USS6660853 (1996). gel biomaterial : dermal and immunologic
[20] A.Presscott, M.Groton, Patent US5563051 compatibility. J. Biomed.Mater.Res.27 (9)
(1996). : 1129-1134.
[21] A.A. zcan, R.Say, A.Denizli, A.Ersz, [33] Segura,T.,Anderson,B.C.,Chung,P.H.,We
Anal.Chem.78(2006) 7253. bber,R.E.,Shull,K.R.,Shea,L.D.,2005.Cros
[22] A.Denizli, B.Garipcan, A.Karabakan, slinked hyaluronic acid hydrogels : a
R.Say, S.Emir, S.Patir, strategy to functionalize and pattern.
Sep.Purif.Technol.30(2003) 3. Biomaterials 26 : 359-371.
[23] nler, zlem Bien, et all, Separation
and purification of hyaluronic acid by
embedded glucuronic acid imprinted
polymers into cryogel, in : Jounal of
Chromatography B : Biomedical Sciences
and Applications, Elsevier-Science Direct,
2013, pp.46-52.
[24] Process for Production and Purification of
High Molecular Weight Hyaluronic Acid,
european Patent Application 92010) EP 2
216 412 A2
[25] Murado,M.A., Montemayor, M.L., Cabo
M.P. (2012). Optimization of extraction
and purification process of hyaluronic acid
from fish eyeball. Food and Bioproducts
Processing, 90(3), 491-498.
[26] Magnani A.,Albanese A.,Lamponi S.,
Barbucci R.,1996. Blood-interaction
performance of differently sulphated
hyaluronic acids. Thromb Res 81(3) :383-
395.
[27] Vindigni V., Cortivo R., Iacobellis
L.,Abatangelo G., Zavan B.,
2009.Hyaluronan benzyl ester as a
scaffold for tissue engineering.
Int.J.Mol.Sci.10 : 2972-2985.
[28] Shu, X.Z., Liu, Y., Palumbo F.,
Prestwich G.D., 2003. Disulfide-
Crosslinked hyaluronan-gelatin hydrogel
films : a covalent mimic of the
extracellular matrix for in vitro cell
growth. Biomaterials 24 : 3825-3834.
[29] Young, J.J., Cheng, K.M., Tsou, T.L.,
Liu,H.W., Wang, H.J.,2004. Preparation
of Crosslinked hyaluronic acid film using
2-chloro-1-methylpyridinium iodide or
water-soluble 1-ethyl-(3,3-dimethyl
aminopropyl) carbodiimide. J . Biomater.
Sci. polymer Ed. 15(6) : 767-780.
[30] Radice, M., Postorello, A., Pavesio, A.,
Callegaro R.,2002. Injectable hyaluronic
acid derivative with pharmaceuticals
cells.USP 00768110.
[31] Ibrahim S., Kang O.K., Ramamurthi,
A.,2010.The impact of hyaluronic acid