Anda di halaman 1dari 14

See

discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/287644094

Produksi dan Pengolahan Asam Hialuronat

Article December 2015

CITATIONS READS

0 117

1 author:

Reynard Bonifasius
Bandung Institute of Technology
1 PUBLICATION 0 CITATIONS

SEE PROFILE

All in-text references underlined in blue are linked to publications on ResearchGate, Available from: Reynard Bonifasius
letting you access and read them immediately. Retrieved on: 23 September 2016
Produksi dan Pengolahan Asam Hialuronat

Reynard*

Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Institut Teknologi Bandung


Jalan Ganesha No. 10, Bandung, Indonesia
*Corresponding Author: reyfasio@students.itb.ac.id

Abstrak
_______________________________________________________________________________________

Asam hialuronat merupakan polisakarida berbentuk linear yang disusun oleh dua unit terulang, terdiri dari
asam (1,4)-glukuranonat (GlcUA) dan (1,3)-N-asetil glukosamin (GlcNAc) dengan rantai polisakarida lebih
panjang dibandingkan glikoprotein, tidak bercabang, tidak memiliki gugus sulfat, serta berikatan dengan
protein inti secara non-kovalen. Asam hialuronat terdapat pada berbagai vertebrata, terutama pada vitreous
humor dan jaringan kartilago. Asam hialuronat terdapat pula pada bakteri patogen, seperti Pasteurella
multocida dan Streptococcus. Asam hialuronat merupakan senyawa yang memiliki penggunaan luas di dunia
medis dikarenakan sifat biokompatibilitasnya yang baik. Ketika asam hialuronat diperoleh dari jaringan
hewan, protein lain dapat terbawa sehingga dapat menyebabkan respon imunologis yang tidak diharapkan.
Isolasi dan purifikasi asam hialuronat dapat berasal dari jaringan hewan ataupun dari hasil fermentasi oleh
bakteri. Isolasi dan purifikasi asam hialuronat yang berasal dari jaringan hewan umumnya dilakukan dengan
digesti enzimatik, sedangkan isolasi dan purifikasi asam hialuronat yang berasal dari fermentasi dapat
dilakukan dengan ekstraksi pelarut organik dan imprinted microbeads. Selain itu, terdapat pula metode isolasi
yang dikembangkan agar spesifik terhadap asam hialuronat yang memiliki berat molekul besar dan asam
hialuronat yang tersulfatasi. Pada umumnya, asam hialuronat yang digunakan berada dalam bentuk linear.
Meskipun demikian, banyak keperluan yang membutuhkan modifikasi secara kimia. Proses modifikasi tersebut
merupakan derivatisasi , seperti modifikasi rantai linear dan pembentukan ikatan kovalen antara rantai asam
hialuronat dengan crosslinking processes. Modifikasi tersebut menghasilkan HA dengan kualitas yang lebih
baik.

Kata kunci : asam hialuronat, fermentasi, purifikasi, biokampatibilitas, modifikasi


_____________________________________________________________________________________

1. Pendahuluan unit disakarida yang sama dengan ikatan


glikosida (-1,4) [3]. Asam hialuronat
Pada tahun 1934, Karl Meyer dan
umumnya memiliki berat molekul antara
John Palmer menulis dalam Journal of
2x105 - 10x107 Da [4]. Pada organisme
Biological Chemistry tentang suatu
hidup, hialuronan disintesis dengan
senyawa polisakarida dengan berat
bantuan enzim hialuronan sintase. Jumlah
molekul besar yang diisolasi dari cairan
unit disakarida terulang umumnya
vitreous mata sapi dan kemudian diberi
mencapai 10.000 unit. Namun demikian,
nama asam hialuronat (HA) [1].
telah dilaporkan terdapat jumlah unit
Asam hialuronat yang dikenal
disakarida terulang mencapai 25000 unit.
sebagai hialuronan merupakan polisakarida
Ukuran massa dari polimer bervariasi dari
berbentuk linear yang disusun oleh dua
satu jaringan ke jaringan lain. Sebagai
unit terulang, terdiri dari asam (1,4)-
contoh, pada umbilikal manusia, ukuran
glukuronat (GlcUA) dan (1,3)-N-asetil
dari hialuronan adalah 3-4 juta Da, dan
glukosamin (GlcNAc). Asam hialuronat
pada cairan sinovial mencapai 6 juta Da.
termasuk jenis glukosaminoglikan
Asam hialuronat terdapat pada berbagai
(mukopolisakarida) dengan rantai
vertebrata. Umumnya asam hialuronat dari
polisakarida lebih panjang dibandingkan
jaringan hewan diekstrak dari pial ayam.
glikoprotein, tidak bercabang, tidak
Pada tahun 1981, Balazs mendapatkan
memiliki gugus sulfat, serta berikatan
paten untuk produksi natrium hialuronat
dengan protein inti secara non-kovalen [2].
yang diekstraksi dari pial ayam dan dapat
Dimer ini dihubungkan oleh ikatan
digunakan untuk kosmetik. Produk tersebut
glikosida (-1,3) membentuk satu unit
mengandung protein 50% - 400%
disakarida, kemudian dihubungkan dengan
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 2

asam glukuronat N-asetil glukosamin

Gambar 1. Struktur Molekul Asam Hialuronat

lebih banyak dibandingkan yang asam hialuronat yang dihasilkan


terekstrak. Dengan pemanasan 100 C, membentuk kompleks dengan proteoglikan
sebagian besar polisakarida rusak dan yang berada pada jaringan hewan. Selain
meninggalkan produk berupa asam hal tersebut, penggunaan asam hialuronat
hialuronat dengan berat molekul tinggi dan yang berasal dari jaringan hewan telah
asam hialuronat dengan berat molekul menimbulkan masalah etika ketika
rendah. Selain berasal dari ekstraksi digunakan sebagai terapi bagi manusia.
jaringan hewan, hialuronan terdapat pula Oleh sebab itu, produksi asam hialuronat
pada kapsul dari beberapa bakteri patogen, melalui bakteri garam negatif, seperti
seperti pada Pasteurella multocida, Streptococcus lebih dipilih saat ini[3].
golongan A dan C dari Streptococcus, Asam hialuronat merupakan senyawa
seperti Streptococcus pyrogenes pada yang memiliki penggunaan luas di bidang
manusia serta Streptococcus equi dan medis. Akibat sifat biokompatibilitasnya
Streptococcus uberis pada hewan [2]. yang tinggi, hialuronan diaplikasikan untuk
Asam hialuronat dengan berat viscosurgery, pengobatan osteoartritis,
molekul rendah ditemukan pada kapsul oftalmologi, serta sebagai material anti
bakteri Streptococcus grup A dan C, dan penuaan pada kosmetik. Selain itu,
Pneumococcus tipe II strain D39R. Secara kombinasi sifat unik dari asam hialuronant
industri, asam hialuronat diproduksi oleh yang menyebabkan asam hialuronat banyak
Streptococcus zooepidemicus dan diterapkan pada dunia medis, antara lain
Streptococcus equi yang menggunakan sifat higroskopis yang tinggi, viskoelastis,
sumber karbon dan nitrogen untuk tidak bersifat imunogen, dan kapasitas
memproduksi pula asam laktat. Bakteri untuk terdegradasi secara aman[5].
tersebut diisolasi dari saluran konjungtivitis Kemampuan yang besar dari polimer untuk
Guinea Pig. S. Zooepidemicus yang telah memerangkap air dikarenakan sifat
diisolasi kemudian dikembangkan pada hidrofilik asam hialuronat. Akibat gugus
tabung Sakaguchi. Pada kondisi titer sel karboksil pada rantai asam hialuronat, asam
maksimum, proses kultur diterminasi dan hialuronat berperilaku sebagai polielektrolit
benzil alkohol ditambahkan untuk pada pKa 2,9 dengan kehadiran air.
sterilisasi. Molekul asam hialuronat dapat
Asam hialuronat yang secara mengembang sampai 1000 kali hingga
konvensional diekstrak dari cairan vitreous membentuk matriks terhidrasi [7;8]. Sifat
mata sapi dan pial ayam sulit untuk viskoelastik dari asam hialuronat
menghasilkan asam hialuronat dengan berat disebabkan oleh perilaiku reologi dari asam
molekul besar. Hal tersebut dikarenakan hialuronat yang menunjukkan elastisitas gel
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 3

yang dikombinasikan dengan viskositas Tabel 1. Nama Dagang Produk yang


fluida. Melalui pengukuran reologi, asam Mengandung HA [12]
hialuronat berperilaku sebagai material
Nama dagang produk mengandung asam hialuronat
pseudo-plastik yang viskositasnya menurun
ketika terjadi kenaikan tegangan geser. AEC Biomatrix Hyaluronic
Sifat reologi dipengaruhi oleh berat Acid SOL
Hyaluronic
molekul dan panjang rantai molekul,
konsentrasi dan kondisi lingkungan seperti Acid
pH [6]. Karena terdapat pada berbagai
Amisil-HA BioCare BHA- BioCare HA-24
jaringan manusia, asam hialuronat memiliki
10 Bio
sifat kompatibilitas yang baik, sehingga
banyak diaplikasikan untuk bidang
biomedik. Selain itu, karena struktur BioCare Polymer BioCare BioCareSA
molekul yang sama untuk semua hewan, BHA-10 Polymer HA-24
molekul asam hialuronat tidak akan
menyebabkan respon sistem imun jika
digunakan pada manusia [8]. Asam Cromoist Glycoderm PC LipoCare HA/E
hialuronat secara in vivo terdegradasi oleh WHYA
hialuronidase menghasilkan produk yang
aman. Kondisi aman tersebut diestimasi Nama dagang produk mengandung Natrium
menggunakan waktu paruh dari asam Hialuronat
hialuronat pada kulit sekitar 24 jam, di mata
sekitar 24-36 jam, di kartilago sekitar 1-3 Actimoist AEC Sodium Avian Sodium
minggu, dan 70 hari di cairan vitreous Hyaluronate Hyaluronate
[9;10;11]. Nilai komersial dari asam Powder
hialuronat melebihi polisakarida lain yang
dihasilkan secara ekstraselular oleh
mikroba. Dengan estimasi nilai jual pasar Hyasol BT LMW Nikkol Sodium
dunia $ US 500 juta, hialuronan terjual $ Hyaluronic Hyaluronate
US 100.000 per kilogram [2]. Pada tabel 1 Acid Na salt
terdapat beberapa nama dagang dari produk
yang mengandung asam hialuronat dan OriStart SH RITA HA C-1C RITA C-1-P
turunannya. Karena sebagian besar
penggunaan asam hialuronat adalah untuk
keperluan medis, maka proses purifikasi
harus menghasilkan asam hialuronat Hylaform Sodium Restylane
dengan kondisi steril. Umumnya metode Hyaluronate
pemurnian yang dilakukan adalah digesti HA-Q
menggunakan protease,presipitasi pasangan
ion, seperti asetil-piridinium klorida, Nama dagang produk mengandung campuran natrium
membran ultrafiltrasi, presipitasi tanpa hialuronat
pelarut, dan liofilisasi [3]. Atecoron Bellsilk HA Biocrystal
Hydalphatine 3P Hydroxan Hydroxan BG
Hydroxan CH Iricalmin Polysin HQ

Spherica HA Thioglycans Toshiki BINS-3


Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 4

2. Purifikasi Asam Hialuronat dari 3. Isolasi dan Purifikasi Asam


jaringan hewan Hialuronat dari Fermentasi
Streptococcus zooepidemicus
Ketika asam hialuronat diperoleh
dari jaringan hewan, protein lain dapat
terbawa, sehingga dapat menyebabkan fermentasi oleh S.zooepidemicus
respon imunologis yang tidak diharapkan.
Untuk memperoleh HA dengan kemurnian
tinggi, dilakukan depolimerisasi sehingga
menghasilkan produk dengan kualitas
rendah. Sebagai contoh, asam hialuronat
Dilusi biomassa 1:1 v/v dengan air
dari mata sapi (diolah oleh Etapharam, bebas pirogen, lalu sentrifugasi pada
Vienna) mengandung 10% protein dari 17686 g, 4C
keseluruhan makromolekul [12]. Protein
yang terikat pada asam hialuronat
umumnya adalah enzim hialuronidase,
antibodi, proteoglikan, reseptor permukaan
sel, serta protein binding yang terikat pada Supernatant ditambahkan 2-propanol
jaringan dan matriks sel. (1:1 v/v) untuk mempresipitasikan HA
Balazs dalam paten "ultrapure"
tentang asam hialuronat, menyebutkan
bahwa tahap esensial yang dilakukan
dibandingkan dengan proses lain adalah
untuk mengolah asam hialuronat yang Presipitat HA disuspensikan kembali
sebagian besar proteinnya telah dihilangkan dalam 3% w/v Na-asetat
dengan kloroform sampai 5 hari. Hal
tersebut dilakukan dengan tujuan
menghilangkan fraksi kecil senyawa
penyebab inflamasi ketika dilakukan injeksi larutan garam HA diolah secara batch
HA pada mata. Kemurnian asam hialuronat dengan silika gel pada 2% w/v dalam
kondisi diaduk dilanjutkan sentrifugasi
dapat berbeda dari suatu batch komersial ke untuk menghilangkan silika
batch komersial lainnya.
Asam hialuronat yang berasal dari
tali umbilikal manusia umumnya
mengandung protein kurang dari 2% dan
kondroitin sulfat kurang dari 3%. Dengan HA yang telah diklarifikasi dilewatkan
pada charcoal filter
menggunakan kondroitinase dan digesti
protease, dilanjutkan oleh denaturasi
termal, dialisis melawan disosiasi buffer,
dan elektroforesis, dapat dihilangkan semua
fragmen kecil, sehingga dihasilkan asam ultrafiltrasi - diafiltrasi pada
hialuaronat yang homogen [12]. pemotongan 50 kDa dengan membran
polimer sulfon

Sterilisasi dengan mikrofiltrasi 0,22 m

Gambar 2. Diagram Alir isolasi dan


Purifikasi HA secara Umum [5;13]
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 5

Asam hialuronat dapat dihasilkan oleh menggunakan spektrofotometer FTIR dan


bakteri dengan fermentasi dalam kondisi NMR.
anaerobik dengan medium yang diperkaya
oleh glukosa, glikogen, ekstrak ragi, tripton, 4. Ekstraksi Menggunakan Metode
KH2PO4,K2HPO4,MgSO4.7H2O,(NH4)2SO4, Digesti Enzimatik.
dan polistirena [14]. Larutan fermentasi
yang mengandung asam hialuronat lebih Umumnya digesti enzimatik
besar dari 2,0 gram/liter dipresipitasi digunakan untuk mengambil asam
dengan isopropil alkohol (1:3 v/v). Asam hialuronat yang terdapat pada jaringan
hialuronat terpresipitasi kemudian hewan. Pada tahap awal, lemak dari
dilarutkan kembali pada larutan 0,15 M jaringan perlu dihilangkan dengan aseton
natrium klorida untuk menurunkan dan dikeringkan pada suhu 60C selama 24
viskositas dan konsentrasi asam hialuronat jam. Pelet kering kemudian disolubilisasi
(umumnya sampai 0,01 gram HA/liter). dengan 100 mM penyangga natrium asetat
Asam nukleat dan protein lain yang tersisa dengan pH 5,5 yang mengandung 5 mM
kemudian dihilangkan dengan menurunkan EDTA dan sistein. Selanjutnya 100 mg
pH larutan dari 6 menjadi 2 dengan enzim papain ditambahkan untuk tiap gram
penambahan asam trikloroasetat 0,1 % dan jaringan, dan larutan yang terbentuk
dilanjutkan dengan charcoal treatment 1-2 diinkubasi selama 24 jam pada 60C
% selama satu jam. Setelah itu, larutan dengan sebuah stirrer. Setelah dididihkan
disentrifugasi pada 700 rpm, 4C selama 30 selama 10 menit, campuran disentrifugasi
menit. dan ditambahkan campuran jenuh etanol
Setelah sel dan arang disingkirkan, dengan natrium asetat tiga kali campuran
larutan HA dilewatkan melalui filter awal. Campuran kemudian ditambahkan ke
berdiameter 0,45 m (293 mm cassette supernatant dan disimpan pada suhu 4C
holder, Millipore, USA). Larutan HA selama 24 jam. Presipitat diambil dengan
kemudian diencerkan sampai lima kali dan sentrifugasi dan dikeringkan pada 60C
dimurnikan kembali dengan ultrafiltrasi. [15]. Jaringan dapat pula didigesti
Tahap akhir adalah pengubahan konsentrasi menggunakan pepsin (Bychkov &
retentat yang mengandung HA sampai Kolesnikova, 1969), pronase (Sven & Zhag,
diperoleh konsentrasi awal dengan volume 1986), dan tripsin (Ogston & Sherman,
yang sama dengan volum awal (satu liter) 1958) [4].
dan dipresipitasi dengan isopropil alkohol
(1:3 v/v). Penambahan isopropil alkohol 5. Ekstraksi Menggunakan Pelarut
akan menghilangkan berbagai residu Organik dan Natrium Asetat
endotoksin yang tersisa pada tahap filtrasi.
Umumnya, kandungan endotoksin diuji Dengan cara ekstraksi menggunakan
dengan reagen LAL (Charles River pelarut organik, jaringan dihomogenkan
Laboratories, SC , USA). Selain kandungan dengan aseton dan diinkubasi selama 24
endotoksin yang diuji, pada tahap akhir ini, jam pada referigerator. Setelah 24 jam,
diukur pula berat molekul menggunakan aseton disingkirkan dari material dengan
hubungan viskositas intrinsik menggunakan cara memeras jaringan. Pemerasan
viskometer Cannon-Ubbelhodes. Nilai dilakukan 10 kali dengan interval 24 jam.
viskositas intrinsik yang diperoleh Material ini kemudian diekstraksi dengan
disubsitusi pada persamaan Mark Houwink larutan 5% natrium asetat. Ekstraksi
(Martin, 1953; Laurent et al, 1960). Sebagai dilakukan bertahap sehingga dihasilkan
standar, nilai intrinsik yang digunakan cairan kental yang diperas bertahap
didasarkan pada metode dari British menggunakan kain tipis. Etil alkohol
Pharmacopoeia (2003). Karakterisasi dari dengan volum 1,5 kali volum ekstrak
HA dilakukan dengan dua cara, yaitu ditambahkan. Kemudian presipitat
disatukan, disentrifugasi, dilarutkan
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 6

kembali pada 5% larutan natrium asetat, etanol, aseton, dan isopropanol dalam
dan disentrifugasi ulang. Protein jumlah yang banyak [17;18]. Selain itu,
dihilangkan dari supermatant dengan proses yang rumit dan waktu yang lama
pengadukan menggunakan kloroform empat akan menghasilkan biaya yang tinggi.
kali. Pada tahap selanjutnya, ditambahkan Teknologi membran yang dimanfaatkan
kembali campuran kloroform - amil alkohol pada proses tersebut [19;20] umumnya
(1:4 terhadap 1:2) sampai tidak terbentuk berfungsi untuk memekatkan HA atau
gel. Larutan terakhir didialisis dengan menyingkirkan sejumlah kecil molekul
tambahan kristal natrium asetat (untuk terlarut.
membentuk larutan Natrium asetat 5%). Dengan molecular imprinting, dibuat
Selanjutnya, larutan diasamkan sampai pH suatu lokus yang selektif terhadap polimer
4,0 dan dipresipitasi menggunakan etil sintetik menggunakan suatu template
alkohol. Presipitat didesikasi dalam kondisi molekul. Molekul target, yaitu asam
vakum menggunakan kalsium klorida hialuronat dapat digunakan sebagai
hingga terbentuk material akhir berwarna template untuk imprinting polimer dengan
putih dan berserabut (Boas, 1949) [4]. membentuk cross-link. Setelah template
awal disingkirkan, polimer yang tersisa
6. Glucuronic Acid Imprinted Microbeads akan bersifat lebih selektif. Selektivitas
dari polimer bergantung pada berbagai
Kebanyakan dari metode digesti faktor, seperti ukuran serta bentuk dari
dengan endohidrolase yang dilanjutkan ruang dan interaksi antar ikatan [16].
kromatografi berdasarkan ukuran partikel, Interaksi kovalen, non-kovalen, dan
pertukaran ion, dan HPLC berfungsi koordinasi ion metal dapat pula berfungsi
dengan baik untuk oligosakarida yang untuk mengorganisasikan gugus-gugus
terdiri dari minimal dua buah dimer asam fungsi di sekitar template.
hialuronat (HA4) dan kelipatannya [16].
Pemisahan dan pemurnian tersebut
membutuhkan pelarut organik seperti

Gambar 3. Formasi Template Asam D-Glukuronat [16]


Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 7

Dilihat dari segi kekuatan, rpm dan ditempatkan dalam bak air
spesifitas, dan pengarahan ikatan, termostatik. Reaktor kemudian dibilas
koordinasi ion metal lebih bersifat kovalen dengan nitrogen berbuih dan kemudian
[21]. Hal ini menyebabkan koordinasi ion ditutup. Temperatur reaktor dijaga konstan
metal memberikan peluang bagi penyiapan 75C selama 6 jam, dan polimerisasi
template polimer yang spesifik terhadap dirampungkan pada 90C selama 3 jam.
protein melalui pengaturan ligan Residu - residu seperti monomer yang tidak
permukaan. terkonversi, inisiator, dan pelarut yang
Molekul asam D-glukuronat (DGA) tersisa dihilangkan dengan campuran 60/40
dan N-asetil glukosamin membentuk metanol/air selama 24 jam, dan p(EDMA-
struktur asam hialuronat (HA). Gugus MAH-Cu2+-DGA), lalu dikeringkan dalam
hidroksil pada DGA berinteraksi dengan oven vakum selama 70 C. Dengan cara
ion metal serta menunjukkan interaksi yang yang sama, non-imprinted polymer (NIP)
mampu mengelat ion metal [22]. Dari hal microbeads disiapkan dengan prosedur
tersebut, dapat dikatakan, DGA berfungsi polimerisasi.
sebagai molekul template, dan N- Sebagai langkah untuk
metakriloilamido-L-histidin tembaga (II) menghilangkan monomer yang tidak
(MAH-CU(II)) merupakan kompleks yang bereaksi dan komposisi lain dari MIP dan
bergabung dengan DGA serta berfungsi NIP, maka MIP dan NIP dibilas secara
sebagai monomer pengelat metal. Molekul ekstensif dengan campuran metanol/air
DGA sebagai imprinted microbeads (60/40 %v/v) selama 24 jam pada
disiapkan bersama kompleks monomer dan temperatur ruang. Setelah pencucian,
digunakan sebagai absorben yang selektif template disingkirkan dari microbeads
untuk purifikasi asam hialuronat. menggunakan larutan 5 M KOH dalam
metanol selama 48 jam sampai tidak ada
6.1 Pembentukan Microbeads DGA yang tersisa dari larutan sisa.

Berdasarkan Akdamar, H.Aelya, et 6.2 Langkah Purifikasi dengan DGA


all dalam Separation and Purification of imprinted microbeads
Hyaluronic Cid by Glucuronic Acid
Imprinted Microbeads, DGA yang Purifikasi didahului oleh penambahan
berfungsi sebagai template adalah sebanyak natrium dodesil sulfat (SDS) 0,01 % ke
1,0 mmol, dan ligan fungsional MAH-Cu2+ dalam kultur untuk mengeluarkan asam
sebanyak 1,0 mmol dilarutkan pada 3,0 mL hialuronat dari dalam sel. Setelah 15 menit,
etanol. Campuran kemudian dirotasi selama campuran ditambah larutan 10 % heksadesil
1 jam untuk mengorganisasikan DGA dan trimetil amonium bromida hingga terbentuk
MAH-Cu2+. flok. Presipitat kemudian disolubilisasi
DGA-imprinted microbeads dalam larutan 2 M CaCl2. Suspensi
disiapkan dengan bentuk suspensi kemudian disentrifugasi sampai diperoleh
menggunakan teknik polimerisasi supernatant. Setelah tahap pra-purifikasi
berdasarkan prosedur berikut : Pertama, selesai, asam hialuronat dipisahkan dari
medium pendispersi disiapkan dengan supernatant. Kemudian, larutan
melarutkan 0,2 gram polivinil alkohol supernatant digunakan sebagai sumber
dengan 60 mL air distilasi. Setelah itu, asam hialuronat. Partikel DGA sebanyak
kompleks monomer MAH-Cu2+ - DGA 100 mg kemudian diolah dengan 10 mL
dicampurkan ke larutan 8,0 mL / 12,0 mL supernatant selama 2 jam disertai magnetic
EDMA / campuran toluen dan 0,09 gram stirrer pada laju pengadukan 150 rpm.
AIBN dilarutkkan bersama campuran Partikel kemudian disentrifugasi dan dibilas
tersebut [23]. Larutan tersebut kemudian untuk menghilangkan molekul yang tidak
dipindahkan ke medium pendispersi yang terikat. Jumlah molekul asam hialuronat
ditempatkan di magnetically stirrer glass yang teradsorb pada DGA ditentukan
polymerization reactor 100 mL pada 600 berdasarkan konsentrasi awal dan akhir
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 8

asam hialuronat pada medium. Selanjutnya, garam natrium saat ini menggunakan
DGA ditempatkan pada medium penambahan 3% natrium asetat, lalu
pendesorpsi, serta diaduk selama 2 jam dihomogenkan sampai larut sempurna.
pada 25C dan 600 rpm. Desorpsi asam Metode purifikasi dengan menggunakan
hialuronat dari microbead p(EDMA-MAH- silika gel dapat menghilangkan 68%-70%
Cu2+) dilakukan dengan larutan 1 M kandungan protein. Setelah silika gel
NaOH. Determinasi dari asam hialuronat disingkirkan dengan sentrifugasi, HA
terdesorpsi dilakukan dengan dengan berat molekul besar diolah
spektrofotometer pada panjang gelombang mengguankan karbon aktif yang mampu
232 nm dengan penambahan enzim menghilangkan protein sampai 85%-90%.
hialuronidase. Satu unit aktivitas Campuran kemudian melalui pengolahan
hialuronidase didefinisikan sebagai jumlah tahap lanjut dengan diafiltrasi. Pada
enzim yang menyebabkan kenaikan diafiltrasi, terjadi pelarutan HA dengan
densitas optik sebasar 0,001 per menit pada solven seperti air bebas pirogen dengan
25C dan pH 7. jumlah yang lebih sedikit. Proses yang
melibatkan purifikasi molekul HA dengan
7. Isolasi dan Purifikasi Asam berat molekul besar sangat signifikan dalam
Hialuronat dengan Berat Molekul Besar menyebabkan penurunan volume.
secara Spesifik Diafiltrasi dengan sistem kontinu perlu
melibatkan dilusi yang steril, air bebas
Asam hialuronat dengan berat pirogen, filter dengan diameter pori 0,22
molekul besar merupakan terminologi yang m, dan filtrasi aseptik. Sebagai alternatif
digunakan untuk asam hialuroant dari tambahan, natrium hialuronat dapat
garam hialuronat yang memiliki berat dipresipitasi ulang dengan isopropanol
molekul minimal 1000 kDa [24]. Metode untuk menghasilkan HA dengan berat
purifikasi yang melibatkan penyingkiran molekul besar. Selanjutnya, HA dapat
pengotor protein dari asam hialuronat diliofilisasi sampai diperoleh kandungan air
menggunakan filtrasi dengan silika gel dan kurang dari 5 %. Proses tersebut tidak
pengolahan karbon aktif. Selain membutuhkan penurunan pH sampai
menggunakan filtrasi dengan silika, dapat kondisi asam, penggunaan surfaktan, atau
digunakan filtrasi menggunakan diafiltrasi. pun detergen. Selain itu, proses
Diafiltrasi merupakan sebuah proses yang penghilangan protein tidak melibatkan
menggunakan filtrasi crossflow yang bahan kimia berbahaya seperti formalin.
menyebabkan spesi molekul dengan berat Penggunaan solven dengan jumlah sedikit
molekul rendah, air, dan solven dapat mengurangi pula beban masukan pada alat
keluar dari membran secara lebih cepat dan liofilisasi [24].
mudah tanpa mengubah volum larutan,
serta menyisakan molekul asam hialuronat 8. Metode Lain
dengan berat molekul besar [24].
Berdasarkan EP 2 216 412 A2, dengan Pemisahan asam mukopolisakarida
diafiltrasi, maka jumlah solven yang menjadi fraksi yang memiliki gugus sulfat
digunakan dalam proses akan berkurang. dan tidak memiliki gugus sulfat diperoleh
Setelah inkubasi, kaldu fermentasi didilusi dengan menggunakan kompleks setil
dengan air dan diklarifikasi. Selanjutnya, piridium (Scott,1960) [4]. Purifikasi akhir
HA yang terdapat pada kaldu dipresipitasi dilakukan dengan menggunakan DEAE-
ulang dengan volume yang sama dengan Sephadex anion exchanger A-25
pelarut yang sesuai, namun tidak terbatas (Schmidt,1962)[4]. Presipitasi kromatograsi
pada isopropanol. Molekul HA dengan sentrifugal (Shinomiya, Kabasawa, Toida,
berat molekul besar yang terpresipitasi Imanari, dan Ito, 2001)[4], elektrodeposisi,
kemudian dikonversi menjadi garam ultrafiltrasi-diafiltrasi [25] merupakan
hialuronat. Selanjutnya, garam hialuronat piranti-piranti lain yang memiliki arti
dapat disolubilisasi pada prosedur purifikasi penting dalam memisahkan segmen asam
selanjutnya. Pengubahan HA menjadi hialuronat.
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 9

9. Modifikasi Asam Hialuronat

Pada umumnya, asam hialuronat propil karbodiimida) dengan tambahan ko-


yang digunakan berada dalam bentuk aktivator seperti N-
linear. Meskipun demikian, banyak hidroksisulfosuksinimida (-sulfo-NHS-)
keperluan yang membutuhkan modifikasi atau 1-hidroksibenzotriazol (-HOBt-)
secara kimia. Secara khusus proses (Bulpitt & Aeschlimann, 1999 ; Prestwich
modifikasi tersebut merupakan derivatisasi, et al., 1998) [5], crosslinking dengan
seperti modifikasi rantai linear dan disulfida [28], crosslinking yang dimediasi
pembentukan ikatan kovalen antara rantai oleh karbodiimida dan ko-aktivator 2-kloro-
asam hialuronat dengan proses 1-metilpiridinium iodida (CMPI) [29;30;5].
Crosslinking [5]. Modifikasi tersebut Proses- proses tersebut merupakan langkah-
menghasilkan HA dengan kualitas yang langkah yang melibatkan penambahan
lebih baik. Sebagai contoh, HA berbentuk gugus karboksil pada rantai HA. Langkah
linear yang digunakan untuk injeksi intra- lain dalam membentuk crosslinking yang
dermal akan secara cepat terdegradasi melibatkan penambahan gugus hidroksil
sehingga baru akan menyediakan efek yang meliputi crosslinking dengan divinil
bermafaat setelah periode waktu yang sulfonat [31;32;5] dan diepoksida [33].
signifikan. HA yang dimodifikasi sebagai Berikut adalah tabel yang menunjukkan
perbandingan, bersifat lebih tahan terhadap crosslinking dan produk yang
hidrolisis kimia dan enzimatik, dihasilkannya.
menunjukkan aktivitas yang lebih lama dan
lebih baik secara in vivo [7]. Selain itu,
modifikasi Crosslinking juga menambah
keuntungan properti mekanis spesifik pada
material [7].
Selain melalui senyawa tunggal asam
hialuronat, asam hialuronat umumnya pula
dikombinasikan dengan polimer lain seperti
kondroitin sulfat dan karboksi metil
selulosa. Modifikasi gugus fungsi pada
asam hialuronat umumnya melibatkan
gugus hidroksil atau karboksil. Sulfatasi
yang dilakukan pada gugus hidroksil dari
asam hialuronat menunjukkan produk yang
memiliki aktivitas menyerupai heparin [26].
Esterifikasi yang melibatkan gugus
karboksil pada polimer menyebabkan
penurunan muatan polimer total sehingga
meningkatkan sifat hidrofobik HA [27].
Sebagai konsekuensi, kelarutan HA dalam
air akan menurun, sehingga HA lebih stabil
pada lingkungan. Di antara seluruh turunan
HA, benzil ester HA merupakan produk
yang paling banyak tersebar di pasaran.
Banyak cara yang telah digunakan
untuk memproduksi HA dalam bentuk
crosslinked. Strategi tersebut di antaranya
dengan crosslinking menggunakan bis-
karbodiimida (Sadozai et al.,2005) [5],
crosslinking dengan polivalen hidrazida
(misal : EDC/1-etil-3,3-dimetil amino
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 10

Tabel 2. Agen Crosslinking untuk Modifikasi HA [5]


Gugus HA yang Agen Crosslinking Produk Referensi
dilibatkan

Karboksil Bis-karbodiimida HA yang mengalami Sadozai, et al.,2005


Crosslinking pada N-
glukuronil urea atau O-
glukuronil isourea

Polivalen hidrazida- Crosslink pada ikatan Bulpitt, et al.,1999;


karbodiimida, ko- hidrazida Prestwitch, et al.,1998
aktivator

Karbodiimida+ko- Crosslink pada ikatan Radice et al.,2002 ;


aktivator (sulfo eter Young, et al.,2004
NHS/HOBt) atau CMPI

Ditiobishidrazida- Crosslink disulfida Shu, et al.,2003


karbodiimida melalui oksidasi oleh
udara

Agen metakrilat- PhotoCrosslink setelah Leach, et al.,2003 ;


karbodiimida terpapar cahaya
Park, et al., 2003

hidroksil Diepoksida Crosslink pada ikatan Agerup, et al.,1998


eter
Segura, et al., 2005

Divinil sulfon Crosslink pada ikatan Balazs, et al., 1986


eter
Larsen, et al.,1993
Ibrahim,et al.,2010
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 11

10. Karakterisasi Asam Hialuronat


Setelah asam hialuronat dimurnikan, Pharmacopeia 2013 dalam Process for
maka asam hialuronat perlu diuji kondisi fisik Production and Purification of High
dan kimianya agar layak digunakan sebagai Molecular Weight Hyaluronic Acid, European
bahan industri. Berikut adalah spesifikasi uji Patent Application (2010) EP 2 216 412 A2
asam hialuronat yang diperoleh dari Brittish [24].

Tabel 3. Spesifikasi Uji Asam Hialuronat [24]


NO UJI SPESIFIKASI

1 Penampakan larutan Larutan jernih, absorbansi larutan yang diukur pada 600 nm tidak
lebih dari 0,01

2 Spektrofotometri IR Spektrum dari uji substansi memiliki kesesuaian dengan spektrum


referensi natrium hialuronat

3 pH Antara 5,0-8,5

4 Asam nukleat Absorbansi pada 260 nm tidak melebihi 0,5

5 Protein Tidak lebih dari 0,3%. Untuk keperluan parenteral tidak boleh lebih
dari 0,1%

6 Klorida Maksimal 0,5%

7 Hilang massa akibat Tidak boleh lebih dari 20%


pengeringan

8 Kadar logam Tidak boleh lebih dari 95% dan tidak lebih dari 105.0% natrium
hialuronat yang dihitung dengan dasar kering
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 12

11. Kesimpulan
mers/biotechnological-production-
Asam hialuronat dapat dihasilkan characterization-and-applicationof-
melalui fermentasi ataupun melalui purifikasi hyaluronan
jaringan hewan. Asam hialuronat yang berasal [6] Lapcik L.,Lapcik L. 1998. Hyaluronan :
dari proses fermentasi memiliki kualitas yang Preparation, Structure, Properties, dan
lebih baik karena bebas dari protein-protein Applications. Chem Rev 98(8) : 2663-
yang dapat menyebabkan respon imunologis. 2684.
Purifikasi asam hialuroant dapat dilakukan [7] Brown MB, Jones SA, 2005. Hyaluronic
dengan digesti enzimatik, ekstraksi dengan acid : a unique topical vehicle for the
localized delivery of drugs to the skin.
pelarut organik-natrium asetat, dan imprinted
J.Eur Acad Dermatol Venereol 19(3) :
microbeads. Proses purifikasi yang dipilih 308-18
dapat didasarkan dari proses awal [8] Matarasso SL,2004. Understanding and
pembentukan asam hialuroanat, seperti using hyaluronan. Aesthetic Surg J 24 :
fermentasi atau isolasi dari jaringan hewan. 361-364
Selain itu, berat molekul asam hialuroant [9] Murray CA, Zloty D. Warshawski
yang ingin diperoleh dapat menentukan proses L.,2005. The evolution of soft tissue fillers
yang dipilih dalam pemurnian. Setelah melalui in clinical practice. Dermatol Clin 23 :
purifikasi, asam hialuronat yang dihasilkan 343-363.
perlu diuji kualitasnya dengan standar-standar [10] Stern R, Kogan G, Jedrzejas M, Soltes
L,2007. The many ways to cleave
yang telah ditentukan. Umumnya, senyawa
hyaluronan Adv 25 :537-557.
turunan asam hialuronat lebih banyak [11] Laurent UBG, Reed RK, 1991. Turnover
dimanfaatkan dalam industri. Hal tersebut of hyaluronan in the tissues. Adv Drug
menyebabkan perlu dilakukan modifikasi Deliv Rev 7 :237-256.
secara kimia pada asam hialuroanat. [12] Becker, Lillian C.,et all, Final report of the
Safety Assesment of Hyaluronic Acid,
Potassium Hyaluronate, and Sodium
Daftar Pustaka Hyaluronate, International Journal of
Toxixology 28 (2209) 5-67.
[1] Selyanin, Mikhail A., Boykov, Petr Ya., [13] Rangaswamy V dan Jain D.,2008. An
dan Khabarov, Vladimir N., Hyaluronic efficient process for production and
Acid, Wiley, Moscow, 2014. purification of hyaluronic acid from
[2] Boeriu, Carmen G.,et all, Production Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.
Methods for Hyaluronan, International Biotechnol Lett 30 : 493-496.
Jounal of Carbohydrate Chemistry [14] Vazquez, J.A., Montemayor, M.L.,
Volume 2013 (2013) Fraguas, J., & Murado, M.A. (2010).
[3] Reddy, K.J., Karunakaran K.T., Hyaluronic Acid production by
Purification and characterization of Streptococcus zooepidemicus in marine
hyaluronic acid produced by by-products media from mussel
Streptococcus zooepidemicus strain processing wastewaters and tuna peptone
35237, J.BioSci.Biotech.2013, 2(3) : 173- viscera. Microbial Cell Factories,9, 46-56.
179. [15] Volpi, N, (2003). Milligram-scale
[4] Giji,Sadhasivam dan Arumugam, preparation and purification of
Muthuvel, Isolation and Characterization oligosaccharides of defined length
of Hyaluronic Acid from Marine possessing the structure of chondroitin
Carbohydrates : Fundamentals and from defructosylated capsular
Applications, Part A,2014,pp.61-73. polysaccharide K4. Glycobiology, 13(9),
[5] Chiara Schiraldi, Annalisa La Gatta, dan 635-640.
Mario De Rosa (2010). Biotechnological [16] Akdamar,H.Aelya,et all, Separation and
Production and Application of purification of hyaluronic acid by
Hyaluronan, Biopolymers, Magdy glucuronic acid imprinted microbeads, in:
Elnashar (Ed.), ISBN : 978-953-307-109- Materials Science and Engineering C,
1, InTech, Available from : Elsevier-Science Direct, 200, pp.1401-
http://www.intechopen.com/books/biopoly 1408.
Reynard, Produksi dan Pengolahan Hilir Asam Hialuronat, 2015 13

[17] K.K. Brown, L.L.C. Ruiz, r.Ivo, ologomer content on physical, mechanical,
N.D.Greenner, Patent US5316926 (1994). and biologic properties of divinyl sulfone-
[18] G.Westphal,M.Hahn,E.Lippert,K.Hoffma Crosslinked hyaluronic acid hydrogels.
nn,P.Kaukel, Patent DE10019868 (2002). J.Biomed.Mater.res.94A:355-370.
[19] D.C.Ellwood,C.G.Evans,G.M.Dunn,N,Mc [32] Larsen, N.E., Pollak, C.T., Reiner, K.,
Innes,R.G.Yeo,K.J.Smith,C.Evans,R.Yeo, Leshchiner, E., Balazs, E.A., 1993. Hylan
C.G.T.Evans, Patent USS6660853 (1996). gel biomaterial : dermal and immunologic
[20] A.Presscott, M.Groton, Patent US5563051 compatibility. J. Biomed.Mater.Res.27 (9)
(1996). : 1129-1134.
[21] A.A. zcan, R.Say, A.Denizli, A.Ersz, [33] Segura,T.,Anderson,B.C.,Chung,P.H.,We
Anal.Chem.78(2006) 7253. bber,R.E.,Shull,K.R.,Shea,L.D.,2005.Cros
[22] A.Denizli, B.Garipcan, A.Karabakan, slinked hyaluronic acid hydrogels : a
R.Say, S.Emir, S.Patir, strategy to functionalize and pattern.
Sep.Purif.Technol.30(2003) 3. Biomaterials 26 : 359-371.
[23] nler, zlem Bien, et all, Separation
and purification of hyaluronic acid by
embedded glucuronic acid imprinted
polymers into cryogel, in : Jounal of
Chromatography B : Biomedical Sciences
and Applications, Elsevier-Science Direct,
2013, pp.46-52.
[24] Process for Production and Purification of
High Molecular Weight Hyaluronic Acid,
european Patent Application 92010) EP 2
216 412 A2
[25] Murado,M.A., Montemayor, M.L., Cabo
M.P. (2012). Optimization of extraction
and purification process of hyaluronic acid
from fish eyeball. Food and Bioproducts
Processing, 90(3), 491-498.
[26] Magnani A.,Albanese A.,Lamponi S.,
Barbucci R.,1996. Blood-interaction
performance of differently sulphated
hyaluronic acids. Thromb Res 81(3) :383-
395.
[27] Vindigni V., Cortivo R., Iacobellis
L.,Abatangelo G., Zavan B.,
2009.Hyaluronan benzyl ester as a
scaffold for tissue engineering.
Int.J.Mol.Sci.10 : 2972-2985.
[28] Shu, X.Z., Liu, Y., Palumbo F.,
Prestwich G.D., 2003. Disulfide-
Crosslinked hyaluronan-gelatin hydrogel
films : a covalent mimic of the
extracellular matrix for in vitro cell
growth. Biomaterials 24 : 3825-3834.
[29] Young, J.J., Cheng, K.M., Tsou, T.L.,
Liu,H.W., Wang, H.J.,2004. Preparation
of Crosslinked hyaluronic acid film using
2-chloro-1-methylpyridinium iodide or
water-soluble 1-ethyl-(3,3-dimethyl
aminopropyl) carbodiimide. J . Biomater.
Sci. polymer Ed. 15(6) : 767-780.
[30] Radice, M., Postorello, A., Pavesio, A.,
Callegaro R.,2002. Injectable hyaluronic
acid derivative with pharmaceuticals
cells.USP 00768110.
[31] Ibrahim S., Kang O.K., Ramamurthi,
A.,2010.The impact of hyaluronic acid