I.

Tujuan Praktikum
 Mampu melakukan pemurnian antrakuinon dalam fraksi eter ekstrak metanol
daun senna (Cassia acutifolia L.)
 Mampu melakukan pembuatan lempeng lapis tipis preparatif.
 Mampu melakukan identifikasi antrakuinon hasil isolasi dengan Uji
Borntrager, Kromatografi Lapis Tipis, serta penentuan spektra ultraviolet.

II. Bahan, alat, dan metode

II. 1. Alat dan bahan untuk pembuatan lempeng lapis tipis preparatif
Bahan : Alat :
- Silikagel - Mortir + stamper
- Aquadest - Alat pengoles
- Lempeng KLTP
- Kapas
- Alkohol 96%

II. 2. Alat dan bahan untuk identifikasi

a. Uji Borntrager
Bahan : Alat :
- Sampel - Tabung reaksi
- Larutan benzena - Pipet tetes
- Larutan ammonia
b. Kromatografi Lapis Tipis
Bahan :
- Fase diam : silikagel GF-254
- Fase gerak : n-propanol : etil asetat : air (40 : 40: 30)
- Penampak noda : larutan KOH 5% dalam metanol
- Kertas saring
- Sampel
Alat :
- Chamber
- Pipa kapiler
c. Penentuan Spektra Ultraviolet
Bahan :
- Sampel
- Metanol
- NaOH
Alat :
- Pipet tetes
- Beaker gelas
Instrumen :
- Spektrofotometer-uv-vis

1
 II. 3. Skema pembuatan lempeng lapis tipis preparatif

60 gram silikagel 120 mL aquadest

Dibuat suspensi dalam mortir

Suspensi Alat pengoles, ketebalan 0,5-2,0 mm

dituang

Suspensi dalam alat pengoles 5 buah lempeng kaca 20x20 cm

-dibersihkan dengan kapas

yang dibasahi alkohol 96%
Dioleskan ad rata
Lempeng Kaca Bersih

Lempeng + Suspensi

-dikeringkan di udara terbuka

Oven 100-120 °∁ Lapis tipis kering

-dimasukkan, tunggu ad
60 menit (± 30 menit)

Lapis tipis aktif

-dinginkan dan simpan dalam desikator

Lapis tipis dingin

2
 II. 4. Skema identifikasi antrakuinon

Fraksi eter ekstrak Eter

metanol daun senna

dilarutkan

Larutan Fraksi eter Lempeng Chamber Fase gerak = n- propanol-

ekstrak metanol tipis etil asetat-air
daun senna

- ditotolkan ad -diisi dengan fase gerak

membentuk pita -ditambahkan kertas saring
kemudian dijenuhkan

Lempeng setelah ditotol Chamber jenuh

dieluasi

Lempeng hasil eluasi

-diamati pada UV 254 nm

-dieluasi ganda ad pita antrakuinon terpisah sempurna
-ditutup sebagian besar lempeng dengan kertas,disemprot
bagian yang terbuka dengan penampak noda (KOH 5%
dalam metanol)

Hasil positif (pita warna merah) Hasil Negatif

-dikerok bagian noda pita pada lempeng yang sejajar

dengan warna merah yang timbul,masukkan vial

Vial

3
 Vial
-diambil sedikit nodanya
-dilarutkan dalam benzena

Larutan benzena Larutan ammonia

Uji Borntrager

dikocok
Lapisan ammonia warna merah
(+antrakuinon)

Vial berisi noda Metanol

Penentuan spektra UV

Uji KLT

Sampel

-diamati pada spektro UV

Chamber Fase gerak = n-propanol- -ditambahkan dengan NaOH
etil asetat-air 3 tetes
-diamati lagi pada spektro
UV

-diisi dengan fase gerak

Spektrum serapan UV
kemudian ditambahkan kertas
saring lalu dejenuhkan,
lempeng dieluasi

Kromatogram hasil eluasi

-disemprot dengan larutan

KOH 5% dalam metanol
-diamati dengan UV 365 nm
-dihitung Rfnya

Kromatogram

4
III. Hasil dan Pembahasan
1. Perhitungan Rf Antrakuinon Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
 Lempeng I
Rf Pita I = 12,3 / 15,3 = 0,80
Rf Pita II = 14,2 / 15,3 = 0,93

Pita II
Pita I

Lempeng I KLTP pada UV 254

Pita II
Pita I

5
 Lempeng II
Rf Pita I = 12,4 / 15,1 = 0,82
Rf Pita II = 14,1 / 15,1 = 0,93

Pita II
Pita I

Lempeng II KLTP pada UV 254

Pita II
Pita I

6
 Lempeng III
Rf Pita I = 8,7 / 13,3 = 0,65
Rf Pita II = 11,8 / 13,3 = 0,88

Pita II

Pita I

Lempeng III KLTP pada UV 254

Pita II

Pita I

7
 Lempeng IV
Rf Pita I = 8,7 / 13,5 = 0,64
Rf Pita II = 11,8 / 13,5 = 0,87

Pita II

Pita I

Lempeng IV KLTP pada UV 254

Pita II

Pita I

8
2. Perhitungan Rf Antrakuinon hasil Kromatografi Lapis Tipis
Romawi I dan II menunjukkan noda
Huruf a dan b menunjukkan lempeng
I a = noda 1 pada lempeng 1 dan 2
I b = noda 1 pada lempeng 3 dan 4
II a = noda 2 pada lempeng 1 dan 2
II b = noda 2 pada lempeng 3 dan 4 II a II b

Ia Ib
 Noda I a
Rf = 6 / 7,9 = 0,76
 Noda I b
Rf = 6 / 7,9 = 0,76
 Noda II a
Rf = 7,2 / 7,9 = 0,91
 Noda II b
Rf = 7,2 / 7,9 = 0,91

3. Uji Borntrager

Ia II a Ib II b

9
4. Penentuan Spektra Ultraviolet
 Sampel I a

 Sampel I a + NaOH

 Sampel I b

10
 Sampel I b + NaOH

 Sampel II a

 Sampel II a + NaOH

11
 Sampel II b

 Sampel II b + NaOH

12
 PEMBAHASAN

Kuinon adalah senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar seperti kromofor
pada benzokuinon, yang terdiri atas dua gugus karbonil yang berkonjugasi dengan dua
ikatan rangkap karbo-karbon. Untuk tujuan identifikasi kuinon dapat dibagi atas empat
kelompok yaitu : benzokuinon, naftokuinon, antrakuinon dan kuinon isoprenoid. Tiga
kelompok pertama biasanya terhidroksilasi dan bersifat fenol serta mungkin terdapat dalam
bentuk gabungan dengan gula sebagai glikosida atau dalam bentuk kuinol (Harborne,
1987).

Antrakuinon merupakan golongan kuinon terbesar di alam dan keluarga tumbuhan

yang kaya akan senyawa jenis ini adalah Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae.
Antrakuinon juga disebut 9,10-dioxo-dihydro-anthracen dengan rumus C14H8O2 (Merck,
1983; Samuelsson, 1999; Morrison dan Boyd, 1959). Struktur dasar antrakuinon terlihat
sebagai berikut :

Antrakuinon terhidroksilasi tidak sering terdapat dalam tumbuhan secara bebas

tetapi sebagai glikosida. Semua antrakuinon berupa senyawa kristal bertitik leleh tinggi,
larut dalam pelarut organik basa. Senyawa ini biasa berwarna merah, tetapi yang lainnya
berwarna kuning sampai coklat, larut dalam larutan basa dengan membentuk warna violet
merah.

Bentuk senyawa antrakuinon dalam tumbuhan masih rumit karena prazat aslinya
mudah terurai oleh enzim atau cara ekstraksi yang tidak sesuai, sehingga laporan mengenai
adanya antrakuinon bebas harus dipertimbangkan dengan hati-hati. Banyak antrakuinon
yang terdapat sebagai glikosida dengan bagian gula terikat dengan salah satu gugus
hidroksil fenolik (Robinson, 1995).

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan
memakai peralatan paling dasar ialah kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). Pada
KLTP, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa pita dengan tidak merusak lapisan
penjerap. Pelat KLTP dapat dibuat sendiri atau dibeli dengan sudah terlapisi penjerap
(biasanya disebut pelat siap pakai atau pelat pra lapis). Ukuran pelat biasanya 20 x 20 cm
atau 20 x 40 cm.

Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang membantu

mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap
sinar UV. Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, pita dapat ditampakkan dengan
menutup plat dengan sepotong kaca menyemprot dengan salah satu sisi dengan pereaksi
semprot atau dengan cara lain dengan menambahkan senyawa pembanding. Pita yang

13
kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat kemudian dilarutkan dengan pelarut polar
(sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap) (Hostettmann, dkk., 1995; Adnan, 1997).

Pada praktikum fitokimia, praktikan melakukan pemurnian antrakuinon dalam

fraksi eter ekstrak metanol daun senna (Cassia acutifolia L.) secara Kromatografi Lapis
Tipis Preparatif (KLTP). Proses pemurnian diawali dengan pembuatan lempeng KLTP,
dibuat lempeng berukuran 20 cm x 20 cm sebanyak empat lempeng dengan menggunakan
silicagel GF 254. Lempeng yang telah jadi didinginkan / diangin-anginkan pada suhu
kamar sehingga memadat dengan sempurna. Setelah lempeng kering, dilakukan aktivasi
lempeng dengan cara dipanaskan dalam oven suhu 100 – 120oC selama 60 menit (15
menit).

Pelaksanaan pemurnian antrakuinon secara KLTP dilakukan dengan menggunakan

fase gerak n-propanol : etil asetat : air (40 : 40 : 30). Pemilihan eluen berdasarkan atas
prinsip like dissolve like dimana antrakuinon memiliki kepolaran yang sama dengan eluen.
Sebelum dilakukan proses eluasi, chamber harus dijenuhkan terlebih dahulu, setelah
chamber jenuh barulah proses eluasi dapat berlangsung untuk keempat lempeng KLTP
yang dibuat.

Lempeng KLTP hasil eluasi diangin-anginkan kemudian ditutup 1/5 bagian

lempeng dengan menggunakan aluminium foil. Bagian lempeng yang terbuka disemprot
dengan penampak noda KOH 5% dalam metanol. Setelah disemprot terlihat dua buah pita
berwarna merah yang artinya positif mengandung antrakuinon. Kemudian aluminium foil
dibuka, pita berwarna jingga yang sejajar dengan warna merah (setelah disemprot KOH
5% dalam metanol) dikerok dan dimasukkan ke dalam vial.

Pada praktikum yang telah praktikan lakukan, karena lempeng satu dan lempeng
dua memberikan nilai Rf yang mirip pada pita nomor satu, maka pita satu dari lempeng
satu dan pita satu dari lempeng dua digabung, lalu dimasukkan ke dalam vial yang sama.
Hal yang sama dilakukan untuk pita nomor dua dari lempeng satu dan lempeng dua.
Sedangkan untuk lempeng nomor tiga dan empat, memiliki nilai Rf yang berbeda dengan
lempeng nomor satu dan dua. Pita nomor satu dari lempeng tiga dan lempeng empat
memberikan hasil Rf yang mirip, sehingga pita satu dapat dikerok dan digabung ke dalam
vial yang sama. Hal yang sama dilakukan untuk pita nomor dua dari lempeng tiga dan
lempeng empat.

Isolat yang didapat dari hasil KLTP diidentifikasi dan dilakukan uji borntrager.
Isolat dilarutkan dalam benzena kemudian ditambahkan dengan larutan ammonia lalu
dikocok. Lapisan ammonia akan menunjukkan warna merah dimana antrakuinon yang
ditambah dengan basa akan memberikan warna merah karena memiliki gugus hidroksi
benzene (fenolik). Identifikasi dilanjutkan dengan melakukan KLT, digunakan eluen yang
sama dengan eluen untuk KLTP yaitu n-propanol : etil asetat : air (40 : 40 : 30). Setelah
noda ditotol pada lempeng KLT, noda diamati pada UV λ 254 nm. Jika senyawa yang
diteliti mengandung ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik, noda akan tampak

14
gelap dengan latar belakang bersinar pada UV λ 254 nm. Pada UV 365 nm (diamati setelah
lempeng dieluasi), noda yang sama akan tampak berpendar.

Lempeng KLT yang telah diamati pada UV λ 254 nm dilakukan eluasi dengan
eluen yang sudah disiapkan. Kromatogram hasil eluasi disemprot dengan penampak noda
KOH 5% dalam metanol, lalu noda diamati di bawah sinar UV λ 365 nm. Noda tidak
teramati dengan jelas di bawah sinar UV λ 365 nm tetapi memberikan noda berwarna
merah setelah disemprot dengan KOH. Hal ini berarti isolat positif mengandung
antrakuinon.

Langkah berikutnya, isolat dilarutkan dalam metanol kemudian diamati panjang

gelombangnya pada spektrofotometer uv-vis dengan λ 300 – 600 nm. Pada umumnya
spektrum ultraviolet / visibel senyawa antrakuinon terjadi pada serapan 224, 246 dan 394
nm atau 206, 282 dan 448 nm (Nawawi, dkk., 2010; Kristanti, dkk., 2006). Berikut
merupakan hasil identifikasi dengan menggunakan spektrofotometer uv-vis :

Panjang Gelombang (nm) Pergeseran (nm)

Sampel
Pita I Pita II Pita I Pita II
Ia 431,467 nm 344 nm
83,1 nm
I a + NaOH 514,567 nm -
Ib 431,467 nm 348,123 nm
83,1 nm -16,923 nm
I b + NaOH 514,567 nm 331,2 nm
II a 427,2 nm -
85,333 nm
II a + NaOH 512,533 nm 346,133 nm
II b 427,2 nm -
83,2 nm
II b + NaOH 510,4 nm 395,2 nm

Berdasarkan data yang didapat dari spektrofotometer uv-vis, dapat dilihat terjadi
pergeseran merah / efek batokromik (pergeseran pita serapan ke panjang gelombang yang
lebih besar) setelah penambahan NaOH. Hal ini dapat terjadi karena antrakuinon dan
turunannya dapat memiliki gugus kromofor seperti C = C, karbonil dan benzena yang
mengabsorpsi pada λ 220 – 350 nm dan gugus –OH, –OR, –NH2, dan –NR2, yang
mengabsorpsi pada λ mendekati 400 nm sehingga λ yang didapatkan berkisar antara
rentang tersebut.

15
 KESIMPULAN

 Fraksi eter ekstrak metanol daun senna (Cassia acutifolia L.) positif mengandung
antrakuinon berdasarkan uji borntrager, KLT, dan penentuan spektra UV.
 Penambahan NaOH pada isolat yang diamati pada spektrofotometer memberikan
efek batokromik pada serapan spektrum uv.
 Antrakuinon dapat bereaksi dengan penambahan basa dan menghasilkan warna
merah (uji borntrager).
 Antrakuinon yang didapat dari fraksi eter ekstrak metanol daun senna (Cassia
acutifolia L.) belum murni.

DAFTAR PUSTAKA

Septyaningsih, Dyah. 2010. Isolasi dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak Biji Buah
Merah (Pandanus conoideus Lamk.). Fakultas Matematika dan IPA, Universitas Sebelas
Maret.

www. repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/24745/4/Chapter%20II.pdf (diakses pada

tanggal 27 November pukul 18.32)

16