Langsung ke konten utama

ANIMAL TECHNOLOGY AND VETERINARY

Translate

IHC PART 1: ANTIBODY & ANTIGEN, FIKSASI, ANTIGEN RETRIEVAL (AR),

ENDOGENOUS BIOTIN, ENDOGENOUS PEROXIDASE

September 26, 2015

Imunohistokimia (IHC) merupakan suatu teknik yang banyak digunakan pada

laboratorium veteriner maupun bidang biomedis untuk kepentingan diagnose

maupun penelitian. Berikut adalah prosedur standar yang biasa digunakan dalam

melakukan IHC (dengan metode avidin biotin complex / ABC method):

Tabel 1. Prosedural standar metode ABC dalam teknik IHC (Ramos-Vara, 2005)

Untuk mempelajari tentang teknik IHC ini kita perlu mengenal lebih lanjut aspek-

aspek yang mempengaruhi keberhasilan seperti ikatan antibody dan antigen serta

faktor-faktor yang menghalang ikatan tersebut dan faktor-faktor yang menghalang

munculnya warna pada jaringan yang diwarnai

ANTIBODY DAN ANTIGEN

Antigen merupakan partikel atau substansi ataupun protein yang ingin kita warnai.

Antigen ini nantinya akan berikatan dengan antibody primer. Antibody primer

tersebut dapat kita dapati dengan memproduksi sendiri atau umumnya dibeli dari

produsen seperti Sigma-Aldrich, Novocastra-Leica biosystems, Thermofisher,

Merck Milipore, Santa Cruz Biotechnology Inc, Abcam, Cellsignal, dan lain-lain.

Antibody primer yang digunakan dapat berbentuk monoclonal antibody ataupun

polyclonal antibody. Monoclonal antibody hanya mengenali satu epitope spesifik,

sedangkan polyclonal antibody mengenali multiple epitope (epitope adalah bagian

pengenalan pada antigen, sedangkan bagian antibody yang mengenali epitope

dikenal sebagai paratope).

Gambar 1. Bagian-bagian antibody (Chemicon International, Inc)

Gambar 2. Polyclonal dan monoclonal antibody (Chemicon International, Inc)

Tabel 2. Perbedaan polyclonal antibody dan monoclonal antibody (Ramos-Vara,

2005)

Pada teknik IHC, antigen di jaringan mungkin dapat tidak terikat dengan antibody

yang kita berikan (antibody diberikan secara ditetesi pada jaringan di slide). Hal ini

dikarenakan adanya faktor-faktor yang menghalang pengenalan antibodi terhadap

antigen. Adanya kesalahan pemilihan antibody dapat menjadi salah satu penyebab

IHC tidak berhasil. Apabila membeli antibody kita harus perhatikan maklumat yang

terdapat pada data sheet antibody. Maklumat yang perlu diperhatikan dari data

sheet antibody primer tersebut antara lain: species reactivity, tested application dan

dilution, detail antibody (monoclonal / polyclonal, host: mouse atau rabbit), storage

buffer dan storage condition (refrigerator 4 ⁰C atau freezer) serta informasi umum

dan metode serta gambaran hasil pewarnaan yang dilampirkan pada data sheet.

Berikut adalah contoh data sheet dari Thermofisher untuk antibody primer mouse

monoclonal MAP-2 (AP18):

Pemilihan antibody primer sangat berpengaruh terhadap pemilihan antibody

sekunder. Apabila antibody primer dalam bentuk mouse monoconal maka antibody

sekunder haruslah anti-mouse. Begitu juga bila antibody primer kita adalah rabbit

polyclonal maka antibody sekunder kita haruslah anti-rabbit.

Gambar 3. Ikatan antibody primer dan antibody sekunder

Pada proses perlakuan pada jaringan seperti pengawetan / fiksasi dan bloking

(dengan paraffin) juga dapat menutupi epitope bahkan merusak epitope antigen

sehingga tidak dapat dikenali oleh antibody. Oleh karena itu, sebelum melakukan

IHC kita harus mengetahui dengan detail apakah antigen pada jaringan yang akan

kita warnai sensitive apabila diberi perlakuan seperti perendaman alcohol, xylene,

dan sebagainya sehingga dapat menyebabkan kerusakan antigen. Dengan begitu

kita dapat memutuskan apakah jaringan yang ingin kita teliti dapat dibloking dengan

paraffin ataupun secara bloking secara frozen. Untuk antigen yang lebih sensitive

terhadap bahan kimia disarankan diblok secara frozen.

Metode yang pernah dilakukan oleh peneliti lain dapat menjadi bahan pertimbangan

dalam memutuskan metode yang ingin digunakan. Kita juga dapat menggunakan

maklumat metode IHC yang tersedia pada data sheet antibody yang akan dibeli

(coba pelajari dari beberapa data sheet yang disediakan di website Sigma-Aldrich,

Novocastra-Leica biosystems, Thermofisher, Chemicon International, Santa Cruz

Biotechnology Inc, dan lain-lain).

PENGARUH FIKSASI TERHADAP ANTIGEN

Fiksasi jaringan merupakan hal yang penting untuk melindungi atau mengawetkan

komponen seluler termasuk protein soluble maupun protein structural, mencegah

autolysis, dan menstabilkan material seluler terhadap efek perlakuan yang akan

diberikan. Namun fiksasi seperti penggunaan formaldehyde dapat menyebabkan

perubahan konformasi makromolekul antigen sehingga bagian pengenalan antigen

tidak dikenali oleh antibody sehingga menjadi factor penyebab kegagalan IHC. Hal

dapat ini berlaku apabila terjadi ikatan formaldehyde dengan antigen. Untuk
memperbaiki keadaan ini kita dapat meleraikan ikatan tersebut dengan penggunaan

antigen retrieval (AR).

Gambar 4. Formaldehyde dan cross-linking fixatives (Ramos-Vara, 2005)

Gambar 5. Reaksi Formaldehyde terhadap protein (D'Amico et al., 2009)

Gambar 6. Fiksasi alcohol. Alkohol akan berinteraksi dengan protein hydrophobic

moieties dan memodifikasi struktur tertiary protein (Ramos-Vara, 2005)

ANTIGEN RETRIEVAL

Berikut adalah beberapa contoh bahan yang dapat digunakan sebagai antigen

retrieval.

Tabel 3. Teknik antigen retrieval IHC (D'Amico et al., 2009)

Some examples of chemical and physical approaches used in antigen retrival

Chemical approach
Enzymatic digestion Proteinase K, trypsin chymotrypsin,
pronase, pepsin, N-glycanase F,
hyaluronidase
Denaturant and chaotropic treatment Formic acid, guanidine hydrochloride,
guanidine thiocyanate, urea, boric acid,
acetic acid, SkipDewaxTM, sodium
dodecyl sulfate, citraconic acid
Bleaching (oxidizing treatment) Periodic acid, hydrogen peroxide,
sodium meta periodate
Etching Sodium (potassium) hydroxide in
(m)ethanol
Detergent treatment Triton X-100
Physical approach
Heat treatment Source: microwave, autoclave, pressure
cooker, steamer, water bath; In solution
of: distilled water, sucrose, EDTA, EGTA,
 TBS, aluminum chloride, zinc sulfate,
lead thiocyanate, citrate buffer, borate
Ultrasound treatment
Such a schematic subdivision is not rigorous, because many approaches result by
the combination of two or more treatment. For example, most chemical treatments
are performed by heat. Furthermore, some substances can show different chemical
effects.

Metode antigen retrieval yang sering digunakan dalam IHC adalah enzimatik dan

juga heat-induced epitope retrieval (HIER) (Ramos-Vara, 2005). HIER memiliki efek

yang baik untuk membantu membuka mask pada epitope (dalam hal mendeteksian

antigen) pada preparat yang difiksasi dengan formaldehyde (cross-linking fixative).

Larutan yang sering digunakan dalam proses HIER seperti TBS dan citrate buffer.

Biasanya slide preparat direndam larutan tersebut dan dipanaskan dengna suhu dan

waktu tertentu baik dengan cara di microwave, boiling, steamer, waterbath,

incubator dan sebagainya.

Gambar 7. Gambaran HIER: Heat induced epitope retrieval (Ramos-Vara, 2005)

Namun penggunaan HIER memiliki kelemahan yaitu dapat meningkatkan ekspresi

endogenous biotin pada sel-sel tertentu pada organ tertentu yang mengandung

banyak mitokondria seperti sel hepar, ginjal, glandula mamae, jaringan adiposa dan
lien, sehingga menimbulkan efek positif palsu. Namun kelemahan ini hanya muncul

pada prosedur tertentu yang dipengaruhi lama dan tingkat suhu yang digunakan

pada organ tertentu. Jadi tidak semua organ yang diwarnai IHC dengan prosedur

HIER akan menyebabkan timbulnya positif palsu.

ENDOGENOUS BIOTIN

Positif palsu dapat terjadi akibat endogenous biotin pada jaringan berikatan dengan

avidin-biotin peroksidase yang diberikan (ABC). Ikatan endogenous biotin-avidin-

biotin-peroksidase selanjutnya bereaksi terhadap kromogen DAB+H 2O2 diberikan.

Reaksi pada DAB akan menyebabkan sel yang mengandung biotin endogenous

berwarna coklat keemasan. Sel yang memiliki biotin endogenous ini mungkin tidak

mengandung antigen yang ingin kita warnai karena reaksi ABC-DAB dapat terjadi

tanpa ikatan antigen dan antibody (langsung berikatan dengan biotin endogenous).

Gambar 8. Gambaran ikatan antigen-antibody - avidin biotin peroxidase + kromogen

dibandingkan dengan ikatan biotin endogenous - avidin biotin peroxidase +

kromogen.

Positif palsu dapat dikonfirmasi dengan penggunaan kontrol negative (slide yang

diwarnai tanpa antibody primer). Hasil pewarnaan pada kontrol negative yaitu

seharusnya tidak adanya warna coklat keemasan pada jaringan (bila menggunaan
kromogen DAB yang mengikat avidin biotin kompleks). Bila terjadi peningkatan

ekpresi endogenous biotin pada pada control negative juga akan muncul warna

coklat keemasan. Bila hal ini terjadi kita perlu melakukan blok endogenous biotin

atau mencoba metode lain tanpa penggunaan Avidin-biotin peroksidase.

Gambar 9. Gambaran reaksi antigen-tanpa antibodi primer + avidin biotin

peroxidase + kromogen dibandingkan dengan ikatan biotin endogenous-avidin
biotin peroxidase + kromogen.

Blok endogenous biotin dapat dilakukan dengan memberikan avidin dalam jumlah

berlebih pada sampel, dengan harapan endogenous biotin dapat diikat oleh avidin.

Selanjutnya avidin diikat dengan biotin bebas (biotin yang tidak terikat dengan

peroksidase). Hal ini akan mengakibatkan endogenous biotin tidak dapat berikatan

dengan avidin-biotin peroksidase yang kita berikan, sehingga DAB yang diberikan

tidak akan berikatan dan tidak akan bereaksi terhadap endogenous biotin.
Gambar 10. Gambaran reaksi ikatan biotin endogenous-avidin biotin peroxidase +
kromogen dibandingkan dengan ikatan biotin endogenous yang diblok dengan
avidin bebas dan biotin bebas.

Sumber avidin bebas seperti putih telur dan sumber biotin bebas seperti skim milk.

Untuk memblok endogenous biotin juga dapat menggunakan produk dari produsen

antibody seperti dari produk Thermofisher yaitu avidin (Streptavidin atau protein

biotin-binding lainnya yaitu Streptavidin (Product No. 21122, 21125), NeutrAvidin

Protein (Product No. 31000) atau Avidin (Product No. 21121, 21128) untuk mengikat

endogenous biotin. Selanjutya avidin yang telah berikatan dengan endogenous

biotin diikat lagi dengan pemberian Biotin seperti D-Biotin (Product No. 29129).

ENDOGENOUS PEROXIDASE

Positif palsu juga dapat terjadi akibat adanya endogenous peroxidase dimana

peroxidase pada jaringan ini dapat bereaksi dengan H2O2 yang diberikan bersama

DAB sehingga menimbulkan warna coklat pada sel yang mengandung endogenous

perosidase. Endogenous peroxidase banyak terdapat pada hemoproteins seperti

hemoglobin (sel darah merah), myoglobin (sel otot), cytochrome (granulocytes,

monocytes) dan catalases (liver and kidney). Untuk mencegah terjadinya positif

palsu pada tahapan awal pewarnaan IHC kita lakukan blok endogenous peroxidase

dengan pemberian H2O2. Konsentrasi H2O2 yang diberikan sekitar 0.3 – 3%.

Pengencer H2O2 yang sering digunakan adalah distilled water atau aquabidest dan

methanol. Penggunaan distilled water lebih murah dan biasanya konsentrasi H 2O2
yang digunakan adalah 3% dimana slide biasanya direndam dalam jar berisi larutan

ini selam 15-30 menit pada suhu ruang. SEdangkan penggunaan methanol lebih

mahal dan konsentrasi H2O2 yang digunakan adalah 0.3% dengan cara meneteskan

larutan tersebut diatas permukaan jaringan pada slide dan disarankan ditutup

dengan parafilm agar tidak cepat menguap. Biasanya jaringan dibiarkan selama 5-

10 menit pada suhu ruang.

Gambar 11. Reaksi Peroxidase terhadap H2O2 (Warthington Biochemical

Corporation 2015)

Gambar 12. Bloking endogenous peroxidase

Daftar Pustaka

Chemicon International, Inc., Introduction to antibodies 2nd edition

D'Amico .F., Evangelia Skarmoutsou, Franca Stivala, 2009. State of the art in antigen
retrieval for immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods, 341:1–18
Ramos-Vara, J.A., 2005. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol.,
42:405–426

Thermo fisher scientific, MAP-2 AP18 datasheet. Thermoscientific.com/pierce

Worthington Biochemical Corporation 2015

http://www.worthingtonbiochem.com:8080/resources/images/enzyme-
manual/HPO/reaction.jpg

BIOTECHNOLOGY IMMUNOLOGY RESEARCH METHODS

Postingan populer dari blog ini

MEKANISME KERJA OBAT CACING SERTA PERBANDINGAN APLIKASINYA PADA

TERNAK (SAPI, KAMBING DAN DOMBA)

Februari 25, 2016

Pemberian obat cacing merupakan salah satu prosedur rutin yang dilakukan dalam
mengobati serta mencegah infestasi cacing pada ternak terutama pada atau
menjelang musim hujan. Pemberian obat cacing harus memperhatikan faktor-faktor
seperti: jenis obat cacing yang akan diberikanumur ternak (anak atau
dewasa)kondisi ternak (bunting, laktasi)jenis obat cacing disesuaikan dengan jenis
cacing yang menginfestasi ternakvolume dosis obat cacing (disesuaikan dengan
berat badan ternak)
Mekanisme Kerja Obat Cacing
Mempelajari mekanisme obat adalah hal yang sangat penting. Dengan mengetahui
cara kerja obat kita dapat mengetahui interaksi obat dengan reseptornya maupun
interaksi obat dengan obat lain yang dikombinasi sehingga kita dapat mengetahui
apakah ada efek kompetitif, antagonis, atau menguatkan serta melemahkan salah
satu efek obat yang diberikan.
Bahan aktif yang terkandung dalam obat cacing dalam tiap produk berbeda-beda
sehingga harus menjadi perhatian. Pada artikel ini akan dibahas mekanisme…
Baca selengkapnya

ULTRASONOGRAPHY (USG) DAN APLIKASINYA PADA PEMERIKSAAN ORGAN

REPRODUKSI SERTA DIAGNOSA KEBUNTINGAN & FOETAL SEXING PADA TERNAK

Mei 18, 2016

Ultrasonography (USG) digunakan sebagai alat diagnose pada sistem reproduksi
betina dan memiliki nilai ekonomis untuk menentukan kebuntingan awal pada ternak
(DesCôteaux et al., 2006a). Pada artikel ini dibahas tentang prinsip dasar USG, tipe
USG, komponen USG, gambaran USG dari organ reproduksi serta diagnose
kebuntingan & foetal sexing pada ternak.
PRINSIP DASAR USG Gambaran USG terbentuk dari intensitas gelombang suara
yang dipantulkan kembali oleh jaringan kepada probe (transducer). Berdasarkan
kekuatan intensitas tersebut dapat dievaluasi bentuk, kontur, ukuran serta posisi
dari struktur yang dipelajari. Struktur echogenic terbentuk dari pantulan gelombang
suara yang tervisualisasi sebagai warna putih hingga abu-abu pada monitor,
sedangkan struktur yang tidak bersifat echoes (anechogenic) seperti cairan folikel
akan mentransmisikan gelombang sehingga tervisualisasikan sebagai warna hitam
(DesCôteaux et al., 2006a).
Gambar 1. Terminologi echotexture. Jaringan yang memantulan gel…
Baca selengkapnya

TOKSISITAS PARACETAMOL (ACETAMINOPHEN) DAN TREATMENT: PADA KUCING

DAN ANJING

Maret 13, 2016

Paracetamol (acetaminophen) merupakan obat yang sering digunakan pada

manusia sebagai analgesic dan antipyretic, namun obat ini bersifat toksik pada
kucing (tanpa adanya dosis aman) serta pada anjing (bila overdosis). Pada artikel ini
dibahas mengenai paracetamol dan metabolismenya, mekanisme toksisitas
paracetamol, diagnose (anamnesa, gejala klinis, perubahan patologi klinis dan
anatomi), serta treatment.

PARACETAMOL
Paracetamol atau acetaminophen merupakan derivate sintetik nonopiate dari p-
aminophenol (Steenbergen, 2003). Paracetamol merupakan nonsteroidal anti
inflamasi yang sering digunakan sebagai analgesic (obat penghilang rasa sakit) dan
antipyretic (obat anti demam, untuk menurunkan suhu tubuh) dengan efek anti
inflamasi yang lemah. Obat ini dapat meningkatkan ambang batas rasa sakit
(Richardson, 2000) dengan cara menghambat aktivitas enzim cyclooxygenase
(Botting, 2000) serta menghambat efek pyrogen dengan cara memblok sintesis
prostaglandin (Aronoff et al., 2006).
Paracetamol …
Baca selengkapnya
Diberdayakan oleh Blogger

Vidya Irawan DVM MSc

Kunjungi profil