PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Senyawa fitokimia adalah zat kimia alami yang terdapat di dalam
tanaman yang memberikan cita rasa, aroma, ataupun warna khas pada
tanaman tersebut. Beberapa khasiat senyawa fitokimia adalah antikanker,
antimikroba, antioksidan, antitrombotik, meningkatkan sistem kekebalan,
antiinflamasi, mengaatur tekanan darah, menurunkan kolestrol serta
mengatur kadar gula darah (Astawan, 2008).
Indonesia sebagai salah satu Negara yang memiliki hutan tropis
terluas di dunia, memiliki keunggulan komperatif dari segi sumber daya
alam untuk dikelola dan dimanfaatkan. Tumbuhan hutan tropis Indonesia
lebih unggul dalam merekayasa bahan-bahan kimia daripada tanaman
sejenis di tempat lain. Oleh karena itu penemuan bahan-bahan kimia baru
untuk berbagai keperluan dari tumbuhan tropis Indonesia sangat tinggi
kemungkinannya.
Isolasi merupakan suatu cara untuk mengambil satu senyawa aktif
yang terdapat di dalam tanaman untuk mengetahui senyawa yang
berkhasiat dalam tumbuhan. Untuk dapat melakukan isolasi harus melalui
berbagai tahapan yang cukup panjang hingga kita dapat memperoleh
suatu senyawa murni yang berkhasiat dalam tumbuhan tersebut. Teknik
isolasi di berbagai negara juga berbeda seperti di Indonesia dan jepang
tapi prinsip yang digunakan tetap sama.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II. 1. Uraian Tanaman (Kenikir)
II.1.1. Klasifikasi Tanaman
Berdasarkan taksonominya, tumbuhan kenikir diklasifikasikan
sebagai berikut (Simpson, 2006):
Kerajaan : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Bangsa : Fabales
Suku : Asteraceae
Marga : Cosmos
Jenis : Cosmos caudatus Kunth.
II.1.2 Deskripsi Tanaman
Kenikir (Cosmos caudatus Kunth.) tergolong tumbuhan herba
semusim dengan tinggi berkisar antara 0,5 – 1,5 m (Gambar 4).
Tumbuhan ini tergolong dalam kelas dikotil, yaitu memiliki akar tunggang,
berbatang tegak berwarna hijau terang keunguan, beralur dan memiliki
banyak percabangan. Daunnya tergolong daun majemuk dengan bentuk
lanset, ujung daun meruncing dan tepi daun bergerigi. Bunga tumbuhan
ini tergolong dalam bunga majemuk dengan tangkai berbentuk seperti
cawan berwarna kuning dan memiliki daun pembalut berbentuk lonceng
berwarna hijau. Kenikir memiliki buah dan biji yang keras dan berbentuk
jarum. Bagian ujung buah tampak berambut, biji kenikir berwarna hitam
dengan panjang sekitar 1 cm (Hassan, 2006). Daerah asli Cosmos
caudatus Kunth. adalah daerah tropis di Amerika Tengah dan hampir
sebagian besar daerah beriklim tropis.
Gambar 1. Tumbuhan Kenikir (http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id)
II.1.3 Kandungan Kimia
Berdasarkan hasil skrining fitokoimia, daun kenikir secara umum
mengandung senyawa flavonoid, polifenol, saponin, terpenoid, steroid dan
minyak atsiri. Bagian akar kenikir mengandung hidroksieugenol dan
koniferil alkohol (Sarmoko dan Sulistyorini, 2010; Liliwiarinis et al.,2011).
Bunawan et al. (2014) memaparkan kandungan senyawa aktif
pada
kenikir dalam Tabel berikut :
(Stahl, 1985).
2. Kromatografi Kolom
Kolom kromatografi merupakan cara yang paling lama dari
kromatografi yang ada. Fase diam, baik bahan penjerap atau film
zat cair pada penyangga, ditempatkan didalam tabung kaca
berbentuk silinder, pada bagian bawah tertutup dengan katup atau
keran, dan fase gerak dibiarkan mengalir ke bawah melaluinya
karena gaya berat.
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan
diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang
berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan tabung
plastik. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom
karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong
dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom
dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa
fraksi yang keluar dari atas kolom.
Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran biasanya
terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian
bawahnya untuk mengatur aliran pelarut.
(Gritter, et al. 1991)
Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi
dua macam, yaitu:
a. Cara Basah
Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan
melarutkan fasa diam dalam fasegerak yang akan digunakan.
Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat
merata. Fasegerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan
fase diam yang tetap dan rata, kemudian alirandihentikan (Sarker
et al ., 2006).
b. Cara kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan
cara memasukkan fase diam yangdigunakan ke dalam kolom
kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan
pelarut yangakan digunakan (Sarker et al., 2006).
Prinsip Kerja Kromatografi Kolom
Didasarkan pada absorbsi komponen-komponen campuran
dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam.
Kromatografi kolom terbagi menjadi :
1. Kromatografi Kolom Konvensional
Kromatografi kolom konvensional adalah metode
kromatografi klasik yang sampai saat ini masih banyak
digunakan. Kolom konvensional digunakan untuk memisahkan
senyawa-senyawa dalam jumlah banyak. Prinsip dari
kromatografi kolom jenis ini adalah kecendrungan komponen
kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak
dengan proses elusi berdasarkan gaya grafitasi (Raymond et
al, 2006).
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan
dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas penjerat
yang berada pada kolom kaca, logam atau bahkan plastic.
Eluen (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui fase diam dalam
kolom dan hanya disebabkan oleh gaya gravitasi (Raymond et
al, 2006).
Pita senyawa linarut bergerak bergerak melalui kolom
dengan laju yang berbeda dan memisah berdasarkan sifat
kepolarannya. Pita-pita hasil isolasi dikumpulkan dalam vial
berupa fraksi ketika keluar dari kolom. Metode ini merupakan
contoh kromatografi cair karena linarut dielusi dalam kolom
menggunakan eluen (Sudjadi, 1986).
Untuk kromatografi kolom, kolom tertentu diisi dengan
bahan penjerat/sorpsi dan pelarut pengembang dengan tingkat
kepolaran yang berbeda. Kolom yang diisi dengan bahan
penjerat/sorpsi yang disebut kolom pemisah. Penggunaan
kolom tergantung dari masalah pemisah yaitu kolom berfilter
dengan gelas berpori, yang pada ujung bawah menyempit
(tabung Allihn) atau tabung gelas yang pada bagian bawah
menyempit dan dilengkapi dengan kran sedangkan tabung bola
jarang digunakan. Perbandingan panjang tabung terhadap
diameter pada umumnya ialah 40 : 1. Pengisian kolom dengan
absorben yang juga disebut pengemasan kolom, harus
dilakukan secara hati-hati dengan permukaan yang rata.
Aluminium oksida atau silica gel dapat dikemas dengan metode
kering ke dalam kolom. Agar pengisian rata, tabung diisi sambil
diketuk-ketuk menggunakan tangan atau benda lunak lainnya
pada dinding kolom (Stahl, 1991).
(Anonim. 2011)
II.2.7. Purifikasi
Pemurnian merupakan suatu proses memurnikan suatu
campuran larutan untuk mendapatkan zat-zat murni. Sedikit
ditemukan reaksi organik yang dapat memberikan hasil yang
murni, yaitu satu senyawa yang antara lain adalah hasil
sampingan bahan baku yang tidak larut atau tidak ikut bereaksi
yang berfungsi sebagai pelarut katalisator dalam suatu reaksi
untuk menghasilkan senyawa yang dimaksud maka diperlukan
senyawa pemisahan dan pemurnian. Berbagai zat harus
dipisahkan untuk mendapatkan zat-zat murni dengan berbagai
cara seperti filtrasi, sentrifugasi, ekstraksi dan reakristalisasi
(Sudjadi. 1998).
• Kristalisasi & Rekristalisasi
A. Kristalisasi
Kristalisasi merupakan teknik pemisahan kimia antara
bahan padat-cair, di mana terjadi perpindahan massa
(mass transfer) dari suat zat terlarut (solute) dari cairan
larutan ke fase kristal padat. Pemisahan secara kristalisasi
dilakukan untuk memisahkan zat padat dari larutannya
dengan jalan menguapkan pelarutnya. Zat padat tersebut
dalam keadaan lewat jenuh akan bentuk kristal. Kristal
kristal dapat terbentuk bila uap dari partikel yang sedang
mengalami sublimasi menjadi dingin. Selama proses
kristalisasi, hanya partikel murni yang akan mengkristal.
B. Rekristalisasi
Rekristalisasi adalah pemurnian suatu zat padat dari
campuran atau pengotornya dengan cara mengkristalkan
kembali zat tersebut setelah dilarutkan dalam pelarut yang
cocok. Prinsip rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan
antara zat yang akan dimurnikan dengan kelarutan zat
pencampur atau pencemarnya. Larutan yang terjadi
dipisahkan satu sama lain, kemudian larutan zat yang
diinginkan dikristalkan dengan cara menjenuhkannya.
• KLT 2 Dimensi
KLT dua dimensi merupakan metode pemisahan yang
pada umunya cukup sering digunakan. Namun kebanyakan
pemisahan dengan metode dua dimensi memakan waktu
seharian untuk melakukannya dan hanya satu sampel per
lempeng yang bisa dianalisa dalam satu Waktu. Hasilnya
adalah suatu kromatogram seperti cetakan jari,
mengidentifikasi noda dengan membandingkannya dengan
standar sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah
pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk
mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua
campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan
pelarut yang sama (Ibnu Gholib. 2008).
KLT dua dimensi memiliki prinsip yaitu adsorbsi dan
partisi, pada KLT dua dimensi didasarkan pada proses elusi
yang bertujuan untuk memperpanjang jarak lintasan noda
untuk memperoleh senyawa tunggal.
KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan
resolusi sampel ketika komponen-komponen solute
mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya
nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam
amino. Selain itu, sistem dua fase gerak yang sangat berbeda
dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran
sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit
yang mempunyai tingkat polaritas (Ibnu G.2008).
Ekstrak murni yang diperoleh, ditotolkan pada lempeng
KLT PF 254 nm, dielusi menggunakan 2 eluen dengan tingkat
kepolaran dan arah yang berbeda dengan cara lempeng yang
telah dielusi pada fase gerak pertama diputar 90°, dan
diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak
kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan
pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu
dikromatografi lagi. Hasil elusi diamati menggunakan
penampak noda sinar ultra violet 254 nm dan 366 nm. Hasil
pengamatan yang menunjukkan satu spot atau bercak tunggal
menandakan senyawa ekstrak yang diperoleh merupakan
senyawa kimia tunggal atau murni (Harborne, J.B.1984).
• KLTP
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan metode
yang relatif sederhana, murah, cepat dan memiliki daya pisah
yang cukup baik. Metode ini tidak dianjurkan untuk pemisahan
awal, tetapi digunakan untuk pemurniaan akhir dalam
prosedur isolasi senyawa (Harborne, 1987).
Hal yang harus diperhatikan pada Kromatografi Lapis
Tipis Preparatif (KLTP) adalah penyaputan pelat kaca dengan
penyerap. Pelat kaca harus dibersikan hati-hati dengan aseton
untuk menghilangkan lemak. Kemudian bubur silica gel atau
penyerap lainnya dalam air harus dikocok kuat-kuat selam
jangka waktu tertentu (misalnya 90 detik) sebelum
penyaputan. Apabila diperlukan, penambahan kalsium sulfat
hemihidrat (15%) untuk membantu melekatkan penyerap pada
plat kaca. Setelah penyaputan, plat harus dikeringkan pada
suhu kamar dan kemudian diaktifkan dengan pemanasan
dalam tanur pada suhu 100 – 110⁰ C selama 30 menit
(Harborne, 1987)
Prinsip dari kromatografi lapis tipis preparatif yaitu
adsorpsi dan partisi, adsorpsi yaitu penyerapan pada
permukaan oleh adanya fase diam (silica) sedangkan partisi
yaitu pemisahan oleh adanya fase gerak(eluen).
Tujuan dilakukannya kromatografi lapis tipis preparatif
yaitu untuk mendapatkan isolat aktif dari suatu sampel.
• KLT Multi Eluen
Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak
yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan
berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda (Ibnu G.2008).
KLT multi eluen memiliki prinsip yaitu adsorbsi dan
partisi, pada KLT multi eluen jumlah totolannya yang berbeda
yaitu berupa cuplikan yang berkesinambungan dan
menghasilkan hasil elusi berupa pita (Ibnu G.2008).
Pada pengerjaan KLT Multi Eluen, ekstrak ditotolkan
pada lempeng KLT, dielusi dengan menggunakan dua atau
tiga fase gerak dengan perbandingan yang berbeda. Spot
atau noda tunggal yang tampak menandakan bahwa senyawa
ekstrak yang diperoleh merupakan senyawa kimia tunggal
atau murni (Mathias, O. 1987).
Adapun keuntungan digunakan metode KLT 2 dimensi
dan multieluen ini adalah untuk mendapatkan resolusi yang
baik dari hasil KLT, dan memfokuskan zona pemisahan. KLT 2
dimensi memiliki potensi pemisahan 150-300 komponen
senyaa kimia. Sedangkan untuk multi eluen, baik digunakan
untuk sampel yng memiliki spot dengan nilai Rf di bawah 0.5
(Mona Z, 1983).
II.3. Karakterisasi
Proses karakterisasi material sangat diperlukan dalam
menginvestigasi suatu bahan atau material, baik secara kualitatif
maupun kuantitatif. Berbagai prinsip dalam proses investigasi ini
menjadi dasar dalam menjalankan fungsi dari alat spektroskopi
seperti, Uv-Vis, FT-IR, NMR dan GC-MS.
II.3.1. Spektrofotometer UV
Berbeda dengan spektrofotometri Visible, spektrofotometri
UV berdasarkan interaksi sampel dengan sinar UV. Sinar UV
memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar
dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy
hidrogen yang merupakan isotop hidrogen yang stabil yang
terdapat berlimpah di laut dan di daratan. Inti atom deuterium
mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hydrogen
hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama
deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti
“dua”, mengacu pada intinya yang menjadi dua partikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata manusia
maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini merupakan
senyawa yang tidak memiliki warna bening dan transparan.
Prinsip Kerja
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun
wolfram yang bersifat polikromatis di teruskan melalui lensa
menuju ke monokromator pada spektrofotometer dan filter
cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan
mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis
(tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu
kemudian akan dilewatkan pada sampel yang mengandung
suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat
cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan.
Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di terima oleh detector.
Detector kemudian akan menghitung cahaya yang diterima dan
mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang
diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung
dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam
sampel secara kuantitatif (Triyati, 1985).