Studi Ekspresi Transforming Growth Factor Beta (TGF-Β) dan Gambaran Histopatologi Ginjal

Tikus (Rattus norvegicus) Model Fibrosis Ginjal Hasil Induksi Streptokinase Pasca Terapi
Pemberian Air Rebusan Kacang Kedelai

Study of The Expression of Transforming Growth Factor Beta (TGF-Β) And Kidney
Histopathologycal In Rats (Rattus norvegicus) Renal Fibrosis Induced by
Streptokinase After Soybean Stew Water Therapy

Fela Kurniawati Susanto, Agung Pramana Warih Marhendra, Aulanni’am

Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya
clarafelasusanto@gmail.com

ABSTRAK

Penyakit ginjal merupakan penyakit yang dapat menyerang manusia dan hewan. Hewan
memiliki prevalensi penyakit ginjal diestimasi sebesar 1,6-20% untuk pet animal. Tujuan penelitian
ini adalah untuk mengetahui penurunan ekspresi TGF- dan perbaikan gambaran histopatologi ginjal
pada tikus (Rattus norvegicus) model fibrosis ginjal yang diinduksi streptokinase pasca pemberian
terapi rebusan kacang kedelai. Pada penelitian ini terdapat empat kelompok perlakuan yaitu kontrol
sehat (A), kontrol sakit (B), terapi air rebusan kacang kedelai dosis 6 g/2 ml/ekor (C), dan terapi air
rebusan kacang kedelai dosis 9 g/2 ml/ekor (D). Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah
ekspresi TGF- yang diamati dengan metode imunohistokimia dan gambaran histopatologi ginjal.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terapi air rebusan kacang kedelai secara signifikan (P<0,05)
mempengaruhi ekspresi TGF-β antar perlakuan. Penurunan rata-rata TGF-β terbaik diketahui terjadi
pada kelompok terapi air rebusan kacang kedelai 9 g/2 ml/ekor yaitu sebesar 71%. Terapi air rebusan
kacang kedelai secara kualitiatif menunjukkan adanya perbaikan pada gambaran histopatologi ginjal
yang ditandai dengan penurunan akumulasi myofibroblas serta penurunan kerusakan epitel tubulus,
perbaikan terbaik terjadi pada kelompok terapi air rebusan kacang kedelai 9 g/2 ml/ekor.

Kata kunci : Fibrosis ginjal, Streptokinase, Transforming Growth Factor (TGF-β), Air rebusan
kacang kedelai, histopatologi ginjal, myofibroblas

ABSTRACT

Renal disease is a disease that can attack human and animal. Animal have prevalence for renal
disease estimated at 1,6-20% for pet animal. The purpose of this study is to determine the decrease in
the expression of TGF-β and the improvement of kidney histopathology in rats (Rattus norvegicus)
renal fibrosis induced by streptokinase after soybean stew water therapy. In this study, there were
four treatment groups, negative control (A), positive control (B), soybean stew water therapy dose 6
g/2 ml/rats (C), and soybean stew water therapy dose 9 g/2 ml/rats (D). Parameters observed in this
study were the expression of TGF-β observed by immunohistochemical methods and an overview of
renal histopathology. The result of this study showed that soybean stew water therapy significantly
(P<0,05) showed differences expression between treatments. The best decreased expression of TGF-β
known at soybean stew water therapy dose 9 g/2 ml/rats. Soybean stew water therapy qualitatively
showed an improvement of kidney hisopathology that characterized by decreased amount of
myofibroblast and decreased in damage of epithelial tubular, the best improvement occured at
soybean stew water therapy dose 9 g/2 ml/rats.

Keywords : Renal fibrosis, streptokinase, Transforming Growth Factor Beta (TGF-β), soybean
stew water, kidney histopathology, myofibroblast
PENDAHULUAN
Penyakit ginjal merupakan masalah
kesehatan di seluruh dunia karena jutaan
orang telah menjalani terapi untuk
menggantikan fungsi ginjal yang
mengalami gangguan. Hewan memiliki
prevalensi penyakit ginjal diestimasi
sebesar 1,6-20% untuk pet animal
(Francey dan Schweighauser, 2008; Kirk
dan Hickman, 2000).
Penyakit ginjal sering disertai dengan
proses inflamasi jaringan ginjal yang
disebabkan oleh proses imunologis
maupun non-imunologis. Awal penyakit
ginjal kronik adalah terjadi inflamasi
glomerulus yang diikuti dengan kerusakan
pada sel epitel tubulus dan terbentuknya
sel-sel inflamasi. Pembentukan jaringan
sklerotik dan fibrosis adalah proses
selanjutnya setelah terbentuk sel-sel
inflamasi, sehingga akhirnya terjadi gagal
ginjal terminal.
Salah satu pemicu timbulnya penyakit
ginjal adalah penggunaan streptokinase.
Streptokinase secara luas digunakan
sebagai obat trombolitik (Buniya et al.,
2014). Fibrosis ini dapat ditunjukkan
dengan adanya peningkatan ekspresi
Transforming Growth Factor β (TGF-β)
ginjal tikus (Rattus norvegicus) model
fibrosis ginjal yang diinduksi dengan
streptokinase.
Peningkatan ekspresi TGF-β dapat
diakibatkan oleh streptokinase dengan cara
pengaktivasian plasminogen menjadi
plasmin (Trihono, 2011).TGF-β diketahui
merupakan salah satu regulator utama dari
renal fibrosis (Terashima et al., 2014).
Kerusakan glomerulus yang semakin
parah akan diikuti dengan pengaktivasian
sel tubulointerstisial untuk memproduksi
TGF-β. Peningkatan ekspresi TGF-β inilah
yang akan memicu penumpukan matriks
ekstraselular dan dapat menyebabkan
fibrosis ginjal secara progresif (Goumenos
et al., 2002).
Kerusakan glomerulus yang semakin
parah dapat ditekan dengan pemberian
isoflavon yang bersifat menstabilkan
radikal bebas (ROS). Kandungan isoflavon
yang paling banyak terdapat di dalam
kacang kedelai adalah genistein dan
daidzin (Sierens et al., 2002). Pada
beberapa penelitian klinis, genistein
diketahui dapat menekan aktivitas
Transforming Growth Factor β (Xu dan
Raymond, 2006).
MATERI DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian
ini adalah kandang pemeliharaan hewan
coba, peralatan bedah (gunting, scalpel,
dan pinset), cawan petri, vaccutainer,
pisau, talenan, falcon, gelas objek, plastik
klip, aluminium foil, sendok pencampur,
pipet tetes, gelas ukur 100ml, mikro pipet
(10 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL), yellow
tip, spuit insulin 1 ml, spuit 3 ml dan 5 ml,
rak tabung reaksi, penangas air, tabung
appendof, lemari pendingin, pH meter
digital, penjepit, mitokrom, neraca analitik,
oven, termometer raksa, alat sentrifugasi
(Denley tipe BR 401), inkubator
(Memmert), vortex (Guo-Huq), mikroskop
dan autoclave.
Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah hewan coba yaitu
tikus putih (Rattus norvegicus) jantan
strain Wistar berumur 10 minggu dengan
berat 150-250 gram, Streptokinase, kacang
kedelai, Aquades, Air, NaCl-fisiologis,
Formaldehid, Xylol, etanol 70%, etanol
80%, etanol 90%, etanol 100%, H2O2,
antibodi anti-rat TGF-β, Dako LSAB +
SA-HRP, larutan PBS, PFA 4%, Mayer
Albumin, Hematoxylen, Eosin, Entellan,
Gliserin, Parafin dan larutan PBS Azida.
Prosedur Kerja
Perlakuan Hewan Model
Hewan model fibrosis ginjal yang
digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus)
jantan strain wistar yang diperoleh dari
Unit Pengembangan Hewan Percobaan
(UPHP) UGM Yogyakarta dengan umur
10 minggu dan berat badan antara 150-200
gram serta telah mendapatkan sertifikat
laik etik dari Komisi Etik Penelitian
Universitas Brawijaya No. 218-KEP-UB.
Induksi Streptokinase
Pada hari pertama, tikus dari
kelompok B, kelompok C, dan kelompok
D diinjeksi dengan sediaan streptokinase
dosis 6000 IU/ekor tikus secara intravena
melalui vena coccygea. Pada hari keenam
dan kesebelas, tikus kelompok B,
kelompok C, dan kelompok D diinjeksi
kembali dengan streptokinase dosis 6000
IU/ekor tikus secara intravena melalui
vena coccygea.
Preparasi Air Rebusan Kacang Kedelai
Kacang kedelai dibersihkan dari kotoran,
kemudian ditimbang sebanyak 75 gram,
lalu dicuci dengan air bersih. Dibagi
menjadi 2 bagian, bagian pertama
sebanyak 30 gram untuk kelompok C dan
bagian kedua 45 gram untuk kelompok D.
Kacang kedelai yang telah dibersihkan dan
dibagi direndam selama 6-8 jam pada suhu
kamar dengan air bersih sebanyak 100 ml,
lalu kedelai dicacah kasar, dimasukkan ke
dalam gelas ukur dan diberi air bersih
sebanyak 75 ml. Kacang kedelai direbus
pada suhu 60-80oC sampai volume air
hanya tersisa 10 ml, kemudian disaring.
Pemberian Terapi Air Rebusan Kacang
Kedelai
Air rebusan kacang kedelai diberikan
setiap hari pada tikus, mulai hari ke-16
sampai dengan hari ke-30 menggunakan
metode sonde lambung setiap harinya
Terapi air rebusan kacang kedelai
diberikan dengan dosis 6 g/2 ml/ekor
untuk kelompok C dan 9 g/2 ml/ekor untuk
kelompok D.
Pengamatan Histopatologi dan
Pewarnaan Imunohistokimia (IHK)
Pengamatan dilakukan pada organ
ginjal hewan model menggunakan
pewarnaan Imunohistokimia untuk
mengetahui ekspresi TGF-β dan
pewarnaan Hematoksilin-Eosin untuk
mengetahui gambaran histopatologi ginjal.
Pengamatan dilakukan menggunakan
mikroskop Olympus BX51 dengan
perbesaran 400x dan 1000x.
Analisa Data
Analisis data yang digunakan dalam
penelitian ini yaitu menggunakan analisa
kualitatif deskriptif untuk gambaran
histopatologi ginjal dan kuantitatif statistik
untuk ekspresi TGF-β dengan uji ANOVA
untuk mengetahui perbedaan antar
perlakuan yang dilanjutkan dengan uji
BNJ α = 5 % untuk melihat dan
menganalisa perbedaan antar kelompok
perlakuan (Kusriningrum, 2008).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Keterangan :
A = ginjal tikus
kontrol negatif
(sehat); B = ginjal
tikus kontrol negatif
(sakit); C = ginjal
tikus perlakuan 1 (air
rebusan kacang
kedelai 3 g/ml); D =
ginjal tikus perlakuan
2 (air rebusan kacang
kedelai 4,5 g/ml).
( ) Ekspresi TGF-β.
Insert : Ekspresi TGF-
β.

Gambar 1. Ekspresi Transforming Growth Factor-β (TGF-β) pada Hewan Model Fibrosis
Ginjal yang Diinduksi Streptokinase (Perbesaran 1000x)
iii
 Bintik berwarna kecoklatan pada
semua preparat imunohistokimia
menunjukkan ekspresi TGF-β. Adanya
bintik berwarna coklat ini merupakan
gambaran dari ekspresi TGF-β yang
diakibatkan adanya ikatan antara antigen
jaringan dengan antibodi yang diberikan
dalam proses pembuatan preparat
imunohistokimia untuk mengamati
ekspresi TGF-β (Gambar 1).
Hasil uji statistik (One-Way ANOVA)
menggunakan SPSS 16.0 for Windows
menunjukkan adanya perbedaan yang
nyata antara kelompok perlakuan A, B,
dan C (p<0,05), tetapi tidak menunjukkan
perbedaan yang nyata pada kelompok D.
Hal ini menunjukkan adanya pengaruh
pada masing-masing perlakuan yang
diberikan pada setiap kelompok perlakuan.
Pemberian terapi air rebusan kacang
kedelai menyebabkan penurunan jumlah
rata-rata ekspresi TGF-β dibandingkan
dengan kontrol positif tiap kelompok
perlakuan berbeda-beda. Terapi pemberian
air rebusan kacang kedelai yang
mengandung isoflavon menekan
peningkatan produksi TGF-β dengan cara
mendonorkan ion hidrogen dalam
ikatannya sehingga ROS yang terbentuk
ketika terjadi reaksi tubuh hewan model
akibat diinduksi dengan streptokinase akan
mengalami penurunan karena distabilkan
oleh ion hidrogen yang berasal dari
isoflavon. Permeabilitas membran yang
iv
Transforming Growth Factor-β (TGF-
β) diketahui merupakan salah satu
regulator utama dari renal fibrosis
(Terashima et al., 2014). TGF-β
merupakan penginduksi EMT yang
merupakan salah satu penyebab utama dari
fibrosis ginjal (Kalluri, 2003). TGF-β
diketahui akan mengalami peningkatan
ketika terjadi fibrosis ginjal.
awalnya meningkat pasca diinduksi
dengan streptokinase secara perlahan akan
mengalami penurunan sehingga Ca2+
intraseluler juga mengalami penurunan.
Penurunan kadar Ca2+ intraseluler
menyebabkan aktivitas enzim protease
menurun yang diikuti dengan penurunan
sitokin-sitokin pro-inflamatori yang salah
satunya adalah TGF-β.
Persentase penurunan ekspresi TGF-β
didapatkan dengan cara konversi dari rata-
rata ekspresi TGF-β dan diubah dalam
bentuk persentase. Kelompok C
menunjukkan penurunan ekspresi TGF-β
sebesar 59% dibandingkan dengan
kelompok kontrol positif dan kelompok D
menunjukkan penurunan ekspresi TGF-β
sebesar 71% dibandingkan dengan
kelompok kontrol negatif (Tabel 1).

Gambaran histopatologi ginjal hewan
model fibrosis ginjal yang diinduksi
streptokinase pasca terapi pemberian air
rebusan kacang kedelai menunjukkan
adanya perbedaan gambaran pada setiap
kelompok perlakuan. Akumulasi
myofibroblas pada pengamatan kualitatif
terdapat pada kelompok perlakuan B dan
kelompok perlakuan C, akumulasi
myofibroblas terbanyak terdapat pada
kelompok perlakuan B. Kelompok
perlakuan B juga menunjukkan kerusakan
epitel tubulus paling banyak, yang
menunjukkan bahwa tingkat kerusakan
ginjal pada hewan model kelompok B
paling parah. Kelompok perlakuan D yang
mendapatkan terapi air rebusan kacang
kedelai dengan dosis 9 g/2 ml/ekor
menunjukkan hasil bahwa kerusakan epitel
tubulus lebih sedikit daripada kelompok
perlakuan C yang mendapatkan terapi air
rebusan kacang kedelai dengan dosis 6 g/2
ml/ekor, hal ini menunjukkan bahwa terapi
air rebusan 9 g/2 ml/ekor memberikan
hasil yang baik pada perbaikan
histopatologi ginjal hewan model tikus
(Rattus norvegicus) yang diinduksi oleh
streptokinase (Gambar 2).
v
Keterangan :
A = ginjal tikus
kontrol negatif (sehat)
B = ginjal tikus
kontrol negatif (sakit)
C = ginjal tikus
perlakuan 1 (air
rebusan kacang
kedelai 6 g/2 ml)
D = ginjal tikus
perlakuan 2 (air
rebusan kacang
kedelai 9 g/2 ml).
Air rebusan kacang kedelai diketahui
mengandung isoflavon yaitu genistein
dengan berat molekul 270 kDa setelah
dilakukan uji LCMS. Isoflavon akan
bertindak sebagai donor hidrogen pada
ROS bersifat tidak stabil yang dihasilkan
dari proses oksidasi lipid pada membran
sel, pembentukan ROS merupakan salah
satu efek samping dari induksi
streptokinase. Isoflavon pada air rebusan
kacang kedelai akan membentuk sebuah
kompleks ROS-isoflavon yang bersifat
lebih stabil. Pengikatan ROS oleh
isoflavon akan menghambat dari
perkembangan fibrosis ginjal menuju tahap
selanjutnya.
Pemberian air rebusan kacang kedelai
dengan dosis 9 g/2 ml/ekor pada kelompok
perlakuan D dengan pengamatan secara
kualitatif mampu menghambat fibrosis
ginjal menuju tahap yang lebih lanjut.
Terjadi perbaikan dari epitel tubulus yang
rusak pasca induksi streptokinase dan
penurunan secara kualitatif dari deposisi
myofibroblas yang merupakan bentuk aktif
dari fibroblas secara signifikan pada
kelompok perlakuan terapi air rebusan
kacang kedelai dengan dosis 9 g/2 ml/ekor
apabila dibandingkan dengan kelompok
perlakuan tanpa terapi.
Kerusakan sel epitel tubulus terjadi
karena adanya pengaruh dari enzim
degradasi membran yang menyebabkan
kerusakan dari nefron tubular. Kerusakan
dari nefron tubular menyebabkan lepasnya
epitel dan dibawa oleh proses EMT
menuju ke rongga interstisial ginjal dan
diubah menjadi jaringan fibroblas.
Rongga interstisial ginjal normal
terdiri atas sparse cell, terutama fibroblas
dan sel dendrit yang terdapat di dalam
jaringan matriks ekstraselular (ECM) yang
terdiri atas kolagen tipe I, III, VII,
fibronektin, dan tenascin (Alexakis et al.,
2006). Pada fibrosis ginjal interstisial,
dikarakteristikkan dengan akumulasi dari
fibroblas aktif dan protein matriks baru
yang dibatasi oleh membran basement
(kolagen tipe IV dan laminin). Akumulasi
fibroblas aktif pada jaringan yang
mengalami kerusakan berhubungan
dengan resiko perkembangan menjadi
fibrosis.
Yang et al., (2010) menunjukkan
bahwa perubahan dari ginjal normal yang
mengalami luka yang diperbaiki menjadi
fibrosis ginjal terjadi ketika sel epitel
tubular berada pada fase G2/M siklus sel,
sebuah fase yang bersamaan dengan
perubahan dari interfase menuju mitosis.
Jumlah sel epitel tubulus proksimal yang
berada di dalam fase G2/M menunjukkan
hubungan dengan perkembangan fibrosis,
dan sel ini akan memproduksi TGF-β
dalam jumlah tinggi serta connective tissue
growth factor yang menunjukkan bahwa
siklus sel ini mengubah epitel normal sel
menuju ke pertumbuhan fibrosis.
KESIMPULAN
1. Terjadi penurunan level ekspresi TGF-β
pada tikus (Rattus norvegicus) model
fibrosis ginjal yang diinduksi
streptokinase setelah pemberian terapi
air rebusan kacang kedelai. Penurunan
level ekspresi TGF-β pada kelompok
perlakuan terapi air rebusan kacang
kedelai dosis 6 mg/2 ml/ekor sebesar
59% dan penurunan level ekspresi
vi
TGF-β pada kelompok perlakuan terapi
air rebusan kacang kedelai dosis 9 mg/2
ml/ekor sebesar 71%.
2. Terjadi perbaikan gambaran
histopatologi ginjal pada tikus (Rattus
norvegicus) model fibrosis ginjal yang
diinduksi streptokinase setelah
pemberian terapi air rebusan kacang
kedelai. Perbaikan gambaran
histopatologi ginjal ditandai dengan
penurunan akumulasi myofibroblas
serta berkurangnya kerusakan epitel
tubulus.
SARAN
Perlu dikaji lebih lanjut mengenai
mekanisme genistein yang berasal dari
kacang kedelai dalam peranannya sebagai
antioksidan.
DAFTAR PUSTAKA
Alexakis C., P. Maxwell., and G. Bou-
Charlos. 2006. Organ-specific
Collagen Expression:
Implications for Renal Disease.
Nephron Exp Nephrol (102):71-
75.
Buniya, H.K., Murugan V., and
Thangadurai, C. 2014. Cloning
And Expression of Hybrid
Streptokinase Towards Clot-
Specific Activity. Journal of
Microbiological Methods 98
(14):84–88.
Francey and A. Schweighauser. 2008.
Clinical Epidemiology Of Kidney
Diseases In The Cat. Veterinary
Focus 18(2):02-08.
Goumenos, D.S., S. Tsakas, A.M. El-
Nahas, S. Alexandri, S. Oldroyd,
and P. Kalliakmani. 2002.
Transforming Growth Factor-β1
in the Kidney and Urine of
Patients with Glomerular Disease
and Proteinuria. Journal of
Nephrol Dial Transplant
17:3145-2152.
Kalluri, R. and E.G. Neilson. 2003.
Epithelial-Mesenchymal
Transition and Its Implications for
 Fibrosis. The Journal of Clinical
Investigation 112:1776-1784.
Kirk, C.A. and M.A. Hickman. 2000.
Dietary Protein Requirement of
Cats With Spontaneous Renal
Disease. J Vet Intern Med 13:351.
Kusriningrum. 2008. Dasar Perancangan
Percobaan dan Rancangan Acak
Lengkap. Fakultas Kedokteran
Hewan. Universitas Airlangga.
Surabaya.
Sierens, J., J.A. Hartley, M.J. Campbell,
A.J. Leathern, and J.V. Woodside.
2002. In Vitro Isoflavone
Supplementation Reduces
Hydrogen Peroxide-Induced DNA
Damage in Sperm. Teratog
Carcinog Mutagen (22):227-234.
Terashima, H., M. Kato, M. Ebisawa, H.
Kobayashi, K. Suzuki, Y. Nezu,
and T. Sada. 2014. R-268712, an
Orally Active Transforming
Growth Factor-β Type 1 Receptor
Inhibitor, Prevents Glomerular
Sclerosis in a Thy1 Nephritis
Model. Eur J Pharmacol 3(45):1-
7.
Trihono, P.P. 2011. Peran Transforming
Growth Factor- β1 Pada Penyakit
Ginjal. Sari Pediatri 13(1):49-54.
Xu, Li and R.C. Bergan. 2006. Genistein
Inhibits Matrix Metalloproteinase
Type 2 Activation and Prostate
Cancer Cell Invasion by Blocking
the Transforming Growth Factor
β-Mediated Activation of
Mitogen-Activated Protein
Kinase-Activated Protein Kinase
2-27-kDa Heat Shock Protein
Pathway. Division of
Hematology/Oncology,
Northwestern University Medical
School, Illinois. 70(3):869-877.
Yang, L., T.Y. Besschetnova, C.R.
Brooks, J.V. Shah, and J.V.
Bonventre. 2010. Ephitelial Cell
Cycle Arrest in G2/M Mediated
Kidney Fibrosis After Injury. Nat
Med 16:535-543.

vii