Limbah
Limbah
I. PENDAHULUAN
a. Latar Belakang
Mikroba tersebar secara luas di alam. Dalam kehidupannya mereka tidak membatasi diri tinggal
di suatu tempat. Sepanjang tempat tersebut memenuhi persyaratan, maka mikroba tersebut akan
hidup. Salah satu metoda yang dapat digunakan untuk menentukan jumlah sel mikroorganisme
adalah dengan menggunakan ruang hitung (counting chamber) yang digunakan dengan bantuan
mikroskop.
b. Tujuan
a. Umum
Menentukan konsentrasi sel melalui metode penetapan jumlah sel dengan counting chamber
b. Khusus
Setelah melaksanakan praktikum mahasiswa dapat :
1. Menentukan letak ruang hitung pada kaca objek yang diamati
2. Menentukan jumlah sel pada objek yang diamati dengan tepat
3. Menentukan konsentrasi sel dari cuplikan (suspensi) yang ditentukan
Tiap-tiap persegi kecil dibawah kaca tutup tersebut merupakan suatu ruang dengan isi 0,05 x
0,05 x 0,1 mm3 = 25. 10 -5 mm3. Jika di bawah kaca tutup tersebut dimasukan setetes suspensi,
maka dengan mikroskop dapat di hitung jumlah sel dalam tiap-tiap persegi tersebut, sehingga
dapat di hitung pula jumlah sel per ml dari suspensi tersebut.
Untuk menghitung konsentrasi sel dilakukan pengamatan terhadap 5 (lima) persegi besar atau 80
(delapan puluh) persegi kecil. Jumlah sel dalam setiap persegi kecil dihitung kemudian
jumlahkan seluruh hasil perhitungan untuk ke-80 persegi kecil.
Karena letak mikroorganisme hidup tidak teratur, maka dalam menghitung dibuat kesepakatan
agar sel yang terletak pada garis tidak dihitung dua kali, yaitu :
Sel-sel yang terletak pada garis sebelah kanan dan bawah tidak termasuk dalam persegi
kecil yang sedang dihitung selnya. Contoh pada persegi nomor 1 jumlah selnya adalah 6.
Sel-sel yang terletak pada garis sebelah kiri dan atas termasuk dalam persegi kecil yang
sedang dihitung selnya. Contoh pada persegi nomor 2 jumlah selnya adalah 3, pada
persegi nomor 6 jumlah selnya 5.
Dari hasil penentuan tersebut dapat ditentukan konsentrasi sel dengan rumus :
Jumlah sel dalam setiap persegi kecil harus berisi sekitar 10 sel. Bila pada saat pengamatan
diperoleh jumlah sel lebih besar dari 10 (sepuluh) sel dalam setiap persegi kecil, maka perlu
dilakukan pengenceran. Pengenceran harus dilakukan dengan sangat teliti. Konsentrasi sel
sesungguhnya bila dilakukan pengenceran adalah :
Counting chamber memiliki dua saluran yang dalam pada kedua sisi ruang hitungnya yang
berfungsi untuk menampung kelebihan cairan. Kaca tutup yang diletakkan di atas ruang hitung
harus kering agar ketinggian dari ruang hitung tetap terjaga.
Pada counting chamber model baru, diatas satu kaca objek dibuat 2 ruang hitung yang satu sama
lain dipisahkan dengan saluran.
III. PERCOBAAN
a. Susunan Alat dan Bahan yang Digunakan
Alat :
1. Counting chamber
2. Counter
3. Tabung Reaksi
4. Pipet tetes
5. Pipet ukur
6. Mikroskop
7. Kaca preparat dan tutupnya
Bahan :
Deskripsi Alat :
Mikroskop dan Counting chamber
b. Prosedur Kerja
1. Kocok suspensi baik-baik agar sel dapat tersebar sama rata dalam cairan
2. Tutup ruang hitung dengan kaca tutup dan teteskan dengan pipet kecil setetes suspensi
pada pinggir kaca tutup. Tetesan akan mengalir ke bawah kaca tutup dan mengisi ruang
hitung.
3. Pasang counting chamber pada mikroskop, amati jumlah sel pada setiap persegi kecil.
Jika jumlah sel lebih dari 10 sel, lakukan pengenceran.
4. Hitung jumlah sel dalam lima persegi besar (80 persegi kecil) dengan menghitung sel-sel
yang berada dalam persegi kecil.
5. Tentukan konsentrasi sel dalam setiap ml-nya
6. Pekerjaan tersebut (mengisi ruang hitung dan menghitung jumlah sel) dilakukan tiga kali.
7. Hitung jumlah rata-rata dari tiga penetapan yang dilakukan.
Prosedur pengenceran :
c. Data yang Diambil
Jumlah sel dalam setiap persegi adalah :
Mikroskop dan counting chamber adalah alat yang mudah rusak/pecah bila tidak
digunakan dengan hati-hati.
Wajib mengenakan lab-jas.
Jangan sampai suspensi mikroorganisme tumpah. Bila tumpah segera bersihkan. Cuci
tangan dan semua yang kontak dengan mikroorganisme tersebut.
Disarankan untuk sarapan dan minum susu sebelum melaksanakan praktikum
V. PENGOLAHAN DATA
Kompetensi :
- Mahasiswa dapat melakukan pengukuran sel mikroorganisme
- Mahasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count, MPN dan dengan
haemocytometer
Menentukan jumlah dan ukuran mikroba
a. Menentukan ukuran mikroba
Menggunakan mikrometer
b. Menentukan jumlah mikroba (enumerasi)
b.1.1.2 TPC
b.1.1.3 cara kerja SPC dan TPC
b.1.2 MPN
b.2 penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (penghitungan langsung
dengan haemocytometer
· Menentukan Ukuran Mikroorganisme
Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer. Mikrometer
merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan
mikrometer objektif. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop, sedangkan
micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Jarak antar
garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan
yang menentukan lapang pandang mikroskop. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi
antara mikrometer okuler dan objektif. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui,
menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. 1 skala micrometer
objektif = 0,01 mm / 10 µm.
Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada
perbesaran yang diinginkan. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan
menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut
bertemu/berhimpit kembali. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala
mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada
di antara garis yang berhimpit tadi.
Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu
skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa
1 skala okuler.
Cara Kerja :
Kalibrasi :
· Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung
lensa okuler.
·Tentukan perbesaran yang digunakan, (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar perbesaran
dari skala mikrometer objektif.
·Setelah fokus didapat, kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer objektif dan
okuler.
·Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit lagi.
·Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.
Untuk syarat perhitungan SPC dan semua yang berhubungan, dapat dibaca (di sini)
Cara kerja :
1. Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap
tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di
gambar).
2. Kocok botol yang berisi air sampel.
3. Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3
tabung LBDS), secara aseptis.
4. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung
LBSS), secara aseptis.
5. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung
LBSS), secara aseptis.
6. Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam.
7. Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk
tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu
dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.
Misal :
didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka
jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.
Kotak sedang :
TES JURNAL 6
PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA DENGAN RUANG HITUNG
(Sumber :http://www.samyakinternational.com)
Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan sel
secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah. Hemasitometer pada
mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-Charles
Malassez.
Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung
pada volume dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki persegi-
persegi kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm. Jika di atas bagian yang
diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang tingginya 0,1
mm. Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm3=25.10-5 mm3.
Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat menghitung
jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang digunakan. Misalnya,
bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan
berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat
diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi kontaminasi.(id.wikipedia.org)
Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe Neubauer-Improved.
4. Apa saja kelemahan dan kelebihan dari metode perhitungan bakteri secara langsung ?
Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak
peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:
Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu keduanya
terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam
populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu (misalnya biru
metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan dihitung dapat membedakan sel hidup dari sel
mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan menyerap biru metilen
namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara enzimatik menjadi tidak
berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.
Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri karena ketebalan
hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak, sehingga kalau
tidak teliti tidak terhitung. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi
lebih mudah dilihat.
Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal untuk
bakteri 106 sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat
sejumlah sel yang dapat dihitung
Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak
mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dalam
perhitungan sel.
Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti
bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup
minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat.
Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara
mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan menambahkan bahan
anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1 %.
Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah sel per
ml sampel adalah: 12 × 1,25 × 106 = 1,5 × 107.
7. Apa tujuan dilakukannya scrub pada NA miring yang berisi biakan dan tujuan
penggunaan air steril ?
Hal ini dimaksudkan agar spora Aspergillus niger dapat lepas dan tersuspensi dalam air steril.
Penggunaaan air steril untuk membuat suspensi spora dimaksudkan agar tidak terdapat mikrooba
lain yang terlarut dalam suspensi. Tersuspensinya spora dalam air steril ditandai dengan
berubahnya warna air steril dari jernih menjadi keruh.
9. Mengapa setelah membilas, hemasitometer tidak boleh dilap dengan menggunakan tisu
biasa ?
Setelah dibilas dengan alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan menggunakan tisu lensa.
Pada saat pengeringan, tisu lensa tidak boleh digosok-gosokkan pada permukaan hemasitometer.
Hal ini bertujuan agar garis-garis yang terdapat pada hemasitometer tidak hilang.
10. Setelah dilakukan 2 hal di atas, apa lagi yang harus dilakukan sebelum pengamatan ?
Permukaan lensa objektif dan lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan terlebih dahulu
dengan menggunakan tisu lensa. Hal ini bertujuan untuk membersihkan debu dan kotoran yang
dapat mengganggu proses penghitungan mikroba.
11. Berpakah besar pengamatan yang digunakan untuk pengamatan pada hemasitometer ?
400 kali
12. Apa sebenarnya tujuan dilakukan pengenceran ?
Pengenceran ini dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah mikroba
yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan penghitungan dapat
diminimalkan.
13. Langkah Kerja !
a. Dituangkan air steril sebanyak 5 mL pada media agar miring yang telah ditumbuhi koloni
Aspergilus niger hingga seluruh bagian media agar miring yang ditumbuhi koloni terbasahi.
b. Digaruk (scrubbing) koloni Aspergilus niger pada media agar miring yang telah terbasahi
dengan menggunakan kawat ose hingga air steril dalam tabung terlihat keruh.
c. Dibersihkan permukaan ruang hitung (hemasitometer) dengan secarik kertas lensa yang telah
dibasahi dengan setetes air suling. Dibersihkan juga kaca tutup ruang hitung sampai tidak lagi
tertinggal sisa-sisa minyak pada permukaannya.
d. Diambil suspensi Aspergilus niger secukupnya dengan menggunakan pipet tetes dan diletakkan
pada tepi kaca tutup, maka dengan sendirinya tetesan tersebut akan mengalir ke bawah kaca
tutup dan mengisi ruang hitung.
e. Ditutup ruang hitung dengan kaca penutup dan diletakkan di atas pentas mikroskop dengan hati-
hati
f. Diamati jumlah sel kapang dengan obyektif 400 kali.
g. Dilakukan perhitungan jumlah sel kapang dalam 5 persegi besar (80 persegi kecil) sebanyak dua
kali (duplo), yaitu pada bagian atas dan bawah hemasitometer. Jika jumlah sel kapang dalam 1
persegi kecil > 10 sel dan dalam 1 persegi besar > 100 sel, maka suspensi kapang perlu
diencerkan.
h. Pengenceran 1:10 dilakukan dengan cara 1 mL suspensi Aspergilus niger diambil dengan
menggunakan pipet ukur 1 mL dan diletakkan pada labu takar 10 mL. Kemudian, ditambahkan
air steril hingga batas labu takar dan digoyang hingga suspensi kapang homogen.
i. Langkah 4 sampai 7 diulangi.
j. Dihitung jumlah rata-rata sel kapang dari dua kali perhitungan tersebut.