I.

Judul Praktikum : Kromatografi Kolom

II. Tujuan Praktikum : Mengetahui cara pemisahan zat aktif menggunakan metode

kromatografi kolom
III. Prinsip Kerja : Memisahkan zat- zat aktif
IV. Teori :
4.1 Definisi Kromatografi

Kromatografi terdiri dari dua fase, fase gerak dan fase diam, Menurut Alimin

(2007:115), dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan molekul-

molekul komponen untuk melarut dalam cairan, melekat pada permukaan padatan halus,

bereaksi secara kimia dan terekslusi pada pori-pori fasa diam. Komponen yang dipisahkan

harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan

fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi atau bereaksi secara kimia.

Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil

pemisahan dapat digunakan untuk keperluan analisis kualitatif, analisis kuantitatif dan

pemurnian suatu senyawa. Dalam beberapa hal metode pemisahan kromatografi mempunyai

kemiripan dengan metode pemisahan ekstraksi. Kedua metode ini sama-sama menggunakan

dua fasa, dimana fasa satu bergerak terhadap fasa lainnya, kesetimbangan solut selalu terjadi

di antara kedua fasa.

Ada beberapa pembagian kromatgografi, diantaranya kromatografi cair-cair,

Menurut Khopkar (2008:223), Dalam kromatografi partisi cair-cair, suatu pemisahan

dipengaruhi oleh distribusi sampel antara fase cair diam dan fase cair bergerak dengan

membatasi kemampuan pencampuran. Jika suatu zat terlarut dikocok dalam sistem dua

pelarut yang tidak bercampur atau saling melarutkan maka zat terlarut akan terdistribusi di

antara kedua fase.

Metode pemisahan dalam kimia diantaranya kromatografi, Menurut Hendayana

(2006:127), menyatakan bahwa Metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan

bahan kimia yang cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran
Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 1
kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom

diperlukan waktu yangcukup lama, bias berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran.

Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan

pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan

komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya

dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat

luas permukaan fasa diam relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara

komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel

diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah menyebabkan semakin lambatnya

aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah

terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar

meregenerasi fasa diam.

IV.2 Pemisahan Kromatografi

Pemisahan Kromatografi, Menurut Underwood (2002:224), Pemisahan kromatografi

kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan afinitas

berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom terabsorpsi termasuk pada

cara pemisahan cair padat, substrat padat bertindak sebagai fasa diam yang sifafnya tidak

larut dalam fasa cair, fasa bergeraknya adalah cairan atau pelarut yang mengalir membawa

komponen campuran sepanjang kolom. Pemisahan bergantung pada kesetimbangan yang

terbentuk pada bidang antar muka diantara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta

kelarutan relatif komponen pada fasa bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan

pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan

proses dinamis. Keduanya secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben

dan masuk kembali pada fasa bergerak.

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 2

 Ada beberapa keuntungan dalam kromatografi, Menurut Alimin (2007:116), keuntungan

pemisahan dengan metode kromatografi adalah

a. Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.
c. Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.
d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal

dan rumit.
Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang

dipertimbangkan adalah kapasitas yang mamadai untuk menerima sampel-sampel tanpa

melamapaui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang

kolom harus sekurang-kurangnya sepuluh kali ukuran diameternya. Bahan

pengemasnya, suatu adsorsben seperti alumina atau mungkin suatu resin pertukaran

ion, dimasukkan dalam bentuk suspense ke dalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan

diam di dalam hamparan basah dengan sedikit cairan tetap berada di atas

permukaannya. Keran dibuka, dan permukaan cairan dibiarkan turun sampai mencapai

puncak permukaan hamparan kemudian porsi kecil dari larutan sampel dipipet dengan

hati-hati ke atas puncak permukaan hamparan. Larutan efluen keluaran dikumpulkan

dalam sederatan fraksi volume yang tidak merepotkan. Larutan tersebut dapat menetes

jatuh ke dalam sebuah gelas beker atau tabung uji tiap kali telah terkumpul sejumlah

volume tertentu.

IV.3 Taksonomi Brokoli (Brassica oleracea Var italica)

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 3

 Gambar 1. Brokoli (Brassica oleracea Var italica)

1. Nama Tanaman

Nama Indonesia: brokoli

Nama asing: broccoli, sprouting broccoli (English)

Sinonim: Brassica oleracea var. italica Plenck

2. Klasifikasi Tanaman

Divisio: Spermatophyta

Subdivisio: Magnoliophyta

Kelas: Magnoliopsida

Bangsa: Capparales

Suku : Brassicaceae

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 4

Marga: Brassica

Jenis: Brassica oleracea Var italica

3. Uraian Tanaman

Bagian brokoli yang dimakan adalah kepala bunga berwarna hijau yang tersusun rapat seperti

cabang pohon dengan batang tebal. Sebagian besar kepala bunga tersebut dikelilingi

dedaunan. Brokoli paling mirip dengan kembang kol, namun brokoli berwarna hijau,

sedangkan kembang kol putih.

4. Habitat dan Penyebaran

Brokoli merupakan tanaman yang hidup pada cuaca dingin. Brokoli berasal dari daerah Laut

Tengah dan sudah sejak masa Yunani Kuno dibudidayakan. Sayuran ini masuk ke Indonesia

belum lama (sekitar 1970-an).

5. Kandungan Tanaman

Brokoli banyak mengandung Sulforapan (SFN). Selain itu dari proses biosintesis di dalam

brokoli juga dihasilkan 3,3-diindolilmetana (DIM). Juga terdapat kandungan lemak, protein,

karbohidrat, serat, air, zat besi, kalsium, mineral, dan bermacam vitamin (A, C, E, Vitamin,

ribofalvin, nikotinamide).

6. Manfaat Tanaman

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 5

Brokoli berkhasiat mempercepat penyembuhan penyakit serta mencegah dan menghambat

perkembangan sel-sel kanker di dalam tubuh. Terutama penyakit kanker yang berkaitan

dengan hormon, seperti kanker payudara pada wanita, dan kenker prostat yang mengancam

pria.

Manfaat lain, brokoli mampu mencegah serangan stroke. Ini terbukti melalui penelitian yang

dilakukan tim epidemologi dari Harvard University. Tanaman ini sangat baik dikonsumsi

penderita kencing manis. Kandungan chromium dan seratnya dapat mengatur kadar gula

darah. Brokoli memperkuat sel-sel tulang. Mengkonsumsinya sejak muda, mencegah

penyakit pengeroposan tulang (osteoporosis) di usia tua (Dalimartha, )

V. Alat Dan Bahan

Alat :
- Kolom Kromatografi - Kertas Saring
- Statip dan klem - Pipet tetes
- Tabung Reaksi (10 buah ) - Botol selai (3 buah)
- Beaker glass - Kapas
- Batang pengaduk - Kertas Alumunium foil
- Cawan penguap - TLC
- Corong kaca - Botol Penyemprot
- Pipa kapiler - Oven

Bahan :
Simplisia yang sudah kering dan dibuat serbuk

VI. Prosedur Kerja

A. Pembuatan Ekstrak
Serbuk ± 100g + pelarut (n-heksan/aseton),rendam selama ± 1 minggu

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 6

 1. Siapkan kolom kromatografi,bersihkan dengan tissue.
2. Pasang kolom kromatografi pada statip.
3. Siapkan 10 tabung reaksi dan raknya untuk menampung hasil.
4. Siapkan 3 botol selai.
5. Ektrak yang sudah dibuat 1 minggu yang lau,disaring dengan kertas saring (3X).
6. Tuang ke dalam cawan penguap dan diuapkan sampai kental.
7. Lakukan orientasi dengan TLC (eluen = n-heksan : Etil Ac.)

Orientasi dengan TLC :

 Dalam botol selai

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 7
  Eluen ------- Campuran n-Heksan : Etil Acetat ( 9 : 1 , 8 : 2 dan 7 : 3 ) sebanyak ±

10ml
 Jenuhkan selama 15 menit

 Penotolan harus ditiup agar tidak melebar

 Penotolan dibuat 3X dengan pipa kapiler yang ujungnya di bakar sampai lancip
 Masukkan dalam botol selai yang sudah jenuh.
 Batas penotolan jangan sampai terendam.
 Plat KLT harus sering dilihat , agar eluennya tidak melewati tanda batas ( di atas).
 Setelah eluen terlihat sudah naik mendekati garis batas ,maka di angakat.

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 8

  Hasil KLT dilihat dengan mata telanjang,lalu dengan UV , lalu di semprot dengan

H2SO4 pekat (10%) dalam methanol (penyemprotan diruang asam ),lalu dipanskan

dalam oven (100°C) atau dengan hair dryer,kemudian amati lagi.

 Dari ke 3 botol selai diatas,amati mana yang lebih baik hasilnya.
 Jika yang baik adalah perbandingan 7 : 3 (misalnya), maka buatlah lebih banyak

(mis.100ml ).
 Kolom di bilas dengan n-Heksan sampai kering (jika aseton dapat mempengaruhi

tingkat kepolaran).
 Siapkan lidi bersih sepanjang kolom.
 Buat silica gel (± 15g ),cara :
Dalam beaker glass masukkan silica gel + n-Heksan,aduk sampai seperti bubur,lalu

masukkan kedalam kolom sedikit- sedikit,jika penuh buka kran kolom dan tampung

 Pembuatan bahan (*) :

Ektrak + beberapa tetes n-Heksan/Aseton + silica gel 1 spatel, lalu aduk sampai

kering seperti serbuk (Ektrak mengandung heksan/aseton) dan berwarna hijau

kehitaman.

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 9

  Setelah (*) dimasukkan , lalu masukkan pula eluen hasil orientasi (n-Heksan : Etil

Asetat).
 Jika terjadi pemisahan dalam kolom kromatografi, dicatat karena warnanya berbeda-

beda,lalu tamping dalam tabung reaksi (3 fraksi ).

 Setiap fraksi diuapkan (Water Bath ) sampai kental.
 Buat penotolan seperti pada orientasi dengan eluen terbaik.
 Bandingkan bercaknya.

B. Pembuatan Kolom Kromatografi

VII. Pengamatan dan Hasil

No Keterangan Hasil
1. - .
2. -

VIII. Pembahasan

Laporan Praktikum Fitokimia, Kelas K, Kelompok 14 “Kromatografi Kolom” Page 10