www.nature.

com/scientificreports

OPEN EKSPRESI PD-L1 OLEH SEL-SEL IMUNITAS,

BUKAN OLEH SEL-SEL TUMOR, ADALAH
FAKTOR PROGNOSTIK YANG BAIK UNTUK
PASIEN-PASIEN KANKER KEPALA-LEHER
Hye Ryun Kim1, Sang-Jun Ha2, Min Hee Hong1, Su Jin Heo1,Yoon Woo Koh3, Eun
Received: 08 June 2016 Chang Choi3, Eun Kyung Kim4, Kyoung Ho Pyo5, Inkyung Jung6, Daekwan Seo7,
accepted: 24 October 2016 Jaewoo Choi7, Byoung Chul Cho1,5,*, & Sun OchYoon4,*
Published: 14 November 2016
Untuk menginvestigasi ekspresi PD-L1 (Programmed death-ligand 1) dan immune checkpoint dan nilai
prognostiknya pada kanker sel skuamous kepala-leher (resected head and neck squamous cell cancer
(HNSCC)). Peneliti menginvestigasi ekspresi PD-L1 pada sel tumor (tumor cells (TC)) dan sel imun yang
menginfiltrasi tumor (tumor-infiltrating immune cells (IC)), penuhnya sebukan limfosit yang menginfiltasi
tumor (tumor-infiltrating lymphocytes (TILs)), dan ekspresi immune checkpoint pada 402 pasien HNSCC.
Ekspresi PD-L1 pada TC dan IC dikategorikan menjadi 4 kelompok berdasarkan persentase PD-L1-
positive cells. Positivitas PD-L1 dikatakan bila terdapat ≥5% selberdasarkan imunohistokimia. Ekspresi
PD-L1 yang tinggi pada IC, tapi tidak pada TC, merupakan faktor prognostik independen yang baik pada
RFS dan kelangsungan hidup keseluruhan (Overall Survival(OS)) disesuaikan menurut umur, gender,
kebiasaan merokok, stadium, dan infeksi HPV. Banyaknya jumlah CD3+ atau CD8+ TILs, Foxp3+ Tregs,
dan PD-1+ TILs dikaitkan kuat dengan prognosis yang menguntungkan. PD-L1 diekspresikan secara
eklusif pada TC atau IC. Analisis transkriptom menunjukkan bahwa IC3 mengekspresikan marker
effector T cells dengan kadar lebih tinggi dibanding TC3, menandakan ekspresi PD-L1 diatur melalui
mekanisme yang dimediasi oleh IFNᵞ adaptif. Ekspresi PD-L1 yang tinggi pada IC, namun tidak pada TC,
dan banyaknya jumlah PD-1+ T cells dan Foxp3+ Tregs merupakan faktor prognostik yang menguntukan
pada HNSCC yang akan dilakukan reseksi. Studi ini mengulas pentingnya penilaian komprehensif baik
pada TC maupun IC.

Prognosis pasien kanker sel skuamous kepala-leher yang rekuren ataupun yang metastasis (R / M
HNSCC) sangat suram, karena kelangsungan hidup keseluruhan mediannya (OS) sekitar enam sampai
sembilan bulan 1. Programmed cell death protein-1 (PD-1) adalah reseptor inhibitorik kekebalan yang
berinteraksi dengan dua ligan, programmed death ligand 1 (PD-L1) dan programmed death ligand
2(PD-L2) 1-3. PD-L1 diekspresikan secara luas pada APC dan sel imun (IC) lainnya 1,2,4 dan diregulasi
pada sel tumor (TC) dari berbagai jenis kanker, termasuk HNSCC. Interaksi PD-1 / PD-L1 adalah
pemeriksaan imun utama yang telah terlibat dalam resistensi imun adaptif pada HNSCC 1–3. Baru-
baru ini, telah ada terobosan dalam imunoterapi kanker dalam melawan berbagai jenis kanker dengan
menggunakan blokade immune checkpoint, terutama menggunakan antibodi yang diarahkan melawan
member jalur PD-1 / PD-L1 3,5. Blokade anti-PD-1 atau anti-PD-L1 diharapkan dapat dipegang
sebagai pengobatan pasien dengan HNSCC berdasarkan hasil awal dari uji klinis menggunakan
pembrolizumab atau durvalumab (MEDI4736), yang menunjukkan bahwa ekspresi PD-L1 dapat
menjadi biomarker prediktif terhadap efikasi/keberhasilan blokade anti-PD-1 / PD-L1 2,6,7.
Pembrolizumab menunjukkan tingkat respons keseluruhan (overall response rate (ORR)) sebesar
20%, dan analisis subkelompok menunjukkan tingkat respons yang lebih tinggi di antara mereka yang
PD-L1 positif (45,5%) daripada mereka yang PD-L1 negatif (11,4%) 7. Demikian pula, durvalumab
menampilkan ORR 14% pada pasien R / M HNSCC, dengan tingkat respons 50% di antara mereka
yang tumornya menunjukkan positivitas PD-L1 tetapi hanya 6% di antara mereka yang tumornya
menunjukkan PD-L1 negatif 6. Saat ini, berbagai uji coba klinis fase III sedang menguji
pembrolizumab (NCT02252042 dan NCT02358031), nivolumab (NCT02105636), dan kombinasi
durvalumab dan tremelimumab (NCT02369874) pada pasien R / M HNSCC.

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 1

 www.nature.com/scientificreports/

Sistem imun memainkan peran kunci dalam pengembangan, pembentukan, dan progresivitas HNSCC, dan berbagai mekanisme
penghindaran imun oleh sel tumor telah ditemukan pada bentuk kanker ini 8. Kehadiran CD8 + tumor-infiltrating lymphocytes
(TILs) diketahui dapat memprediksi respons tumor padat terhadap terapi anti-PD-1, 9,10. Selama proses penghindaran imun oleh
HNSCC, berbagai immune checkpoint dapat digunakan oleh sistem imun pada lingkungan mikro tumor untuk menginduksi
kelelahan pada sel T efektor. Beberapa reseptor, termasuk limfosit T sitotoksik yang berasosiasi dengan protein-4 (cytotoxic T
lymphocyte associated protein-4(CTLA-4)), gen aktivasi limfosit-3 (lymphocyte-activation gene-3 (LAG-3)), imunoglobulin musin
T sel protein-3 (T cell immunoglobulin mucin protein-3 (TIM-3)), dan PD-1, telah diidentifikasi. pada limfosit yang mengalami
kelelahan dan disfungsi dan diregulasi dalam jalur sel berbagai tipe tumor, termasuk HNSCC 8,11. CTLA-4, anggota famili reseptor
B7 , diekspresikan oleh sel T CD4 +, sel T CD8 +, dan sel T regulator (Treg) dan bersaing dengan CD28 untuk mengikat ligan
stimulatori CD80 dan CD868,12. LAG-3 adalah reseptor lain yang telah terbukti meningkatkan fungsi Treg 8,13. Peran TIM-3
sebagai marker atau mediator imunosupresi masih dalam penyelidikan, tetapi penelitian telah mengaitkan tingkat ekspresi TIM-3
dengan buruknya outcome klinis 8,14. Identifikasi profil ekspresi dan efek prognostik dari molekul-molekul ini telah memfasilitasi
landasan imunoterapi kedepannya 8. Saat ini, nilai prognostik PD-L1 masih kontroversial, dan distribusi PD-L1 pada TC atau IC
belum dianalisis secara komprehensif pada HNSCC. Ekspresi PD-L1 telah berkorelasi dengan outcome klinis yang buruk pada
beberapa jenis kanker, meskipun PD-L1 dikaitkan dengan peningkatan kelangsungan hidup dan peningkatan jumlah TIL dalam
beberapa laporan 15-22. Oleh karena itu, menentukan frekuensi dan efek prognostik dari molekul-molekul ini pada pasien HNSCC
dapat membantu dalam pengembangan obat untuk jenis kanker ini. Di sini, kami menganalisis distribusi sel T CD3 + / CD8 + dan
Tregs dan ekspresi immune checkpoint, seperti PD-1, ICOS, dan LAG-3, pada IC. Selain itu, kami secara komprehensif mengukur
ekspresi PD-L1 pada TC dan IC dan memeriksa apakah status PD-L1, keberadaan sel T yang menginfiltrasi, dan ekspresi immune
checkpoint dikaitkan dengan gambaran klinis dan temuan patologis atau outcome kelangsungan hidup pasien HNSCC. Pada
akhirnya, kami bertujuan untuk menetapkan nilai prognostik PD-L1 dan berbagai immune checkpoint pada pasien HNSCC untuk
mengidentifikasi relevansi terapeutik potensial mereka.

Pasien Dan Metode

Pasien. Studi ini dikerjakan secara kohort pada pasien HNSCC yang menjalani tindakan reseksi pada Severance Hospital, Seoul,
Korea, antara tahun 2005 dan 2012. Kriteria seleksi pasien meliputi: 1) pasien HNSCC direseksi untuk tujuan kuratif, 2)
ketersetidaan data jaringan tumor dan status data klinis pasien berkaitan dengan riwayat merokok dan outcome kelangsungan
hidupnya, 3) tanpa terapi preoperatif, dan 4) tanpa metastasis yang jauh. Kami mengeksklusi 121 pasien yang sampelnya
mengalami dekalsifikasi. Dan akhirnya, tersisa sampel tumor 402 pasien yang layak untuk pemeriksaan marker imun. Kami lalu
mengevaluasi lokasi dan ukuran tumor, grading histologis, metastasis ke limfonodus regional, invasi limfovaskular dan invasi
perineural. Tumor-tumor diklasifikasi berdasarkan sistem klasifikasi tumor TNM Seventh American Joint Committee on Cancer
(AJCC) dan sistem klasifikasi WHO. Dua patolog berpengalaman (S.O.Y. dan E.K.K), yang dengan secara sengaja tidak
diberikan data klinis pasien, mengonfirmasi diagnosis HNSCC berdasarkan pewarnaan hematoksilin-eosin (H&E). Format
pengumpulan data predesain digunakan dalam mengkaji rekam medik pasien untuk mengevaluasi karakteristik klinikopatologis
dan angka kelangsungan hidup setelah operasi. Studi ini disetujui oleh the Institutional Review Board of Severance Hospital dan
segala eksperimen dilakukan sesuai dengan pedoman dan regulasi yang relevan. Kami memperoleh persetujuan inform consent
untuk semua subjek penelitian kami.

Persiapan Microarray Jaringan, Imunohistokimia (IHC), Dan Analisis.

Bagian-bagian dari jaringan yang tertanam dalam blok parafin-formalin (Formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPE))
disiapkan dan diwarnai dengan H & E. Di bawah mikroskop, daerah tumor yang representatif dikonfirmasi dan dipilih untuk
menghasilkan microarray jaringan (TMAs). Dua atau tiga daerah tumor perwakilan yang berbeda per sampel diseleksi, dan inti
jaringan (diameter 3 mm) dikumpulkan dari masing-masing blok FFPE dan disusun dalam blok parafin resipien (blok TMA)
menggunakan trephine. Semua blok TMA dipastikan mengandung lesi tumor yang mewakili lebih dari 50% dari area inti
berdasarkan pewarnaan H & E. IHC dilakukan pada 4-μm bagian jaringan menggunakan Ventana Bench Mark XT Autostainer
(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA). Antibodi primer terhadap antigen berikut inilah yang digunakan sbb: PD-L1
(pengenceran 1: 100; klon SP142; Ventana), PD-1 (pengenceran 1: 100; klon NAT105; Sel Marque, Rocklin, CA, USA), CD3
(pengenceran 1: 200; LabVision, Fremont, CA, USA), CD8 (RTU; klon C8 / 144B; Dako, Glostrup, Denmark), Foxp3
(pengenceran 1: 100; Abcam, Cambridge, Inggris), ICOS / CD278 (klon SP98; pengenceran 1:50; Thermo Scientific, Rockford,
IL, USA), LAG-3 (klon EPR4392 ( 2); pengenceran 1: 100; Abcam), dan p16 (RTU; Ventana).

(NB: Immune checkpoint dapat diartikan sebagai molekul protein

spesifik yang berhubungan dengan sistem imun seperti PD-1, ICOS, dan
LAG-3. Istilah ini telah digunakan secara universal sehingga tidak
diterjemahkan ke dalam bahasa Indonesia.)

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 2

www.nature.com/scientificreports/

Analisis Imunohistokimia.
Ekspresi PD-L1 pada TC dan IC dianalisis secara terpisah dengan menggunakan modifikasi dari pendekatan
yang digunakan sebelumnya 2. IC didefinisikan sebagai sel T dan makrofag / sel dendritik yang diinfiltrasi
ke sarang sel tumor (sel imun intraepitelial) 2. Ekspresi PD-L1 oleh TC dan IC dikategorikan menjadi empat
kelompok sesuai dengan persentase sel PD-L1-positif: TC0 atau IC0, 0%; TC1 atau IC1,> 0% tetapi <5%;
TC2 atau IC2, ≥ 5% tetapi <50%; dan TC3 atau IC3, ≥ 50%. PD-L1 positif didefinisikan sebagai ekspresi
PD-L1 pada ≥ 5% dari semua TC atau IC berdasarkan imunohistokimia. Kepadatan TIL secara semi-
kuantitatif dinilai dengan mengukur sel T CD3 + dan CD8 + berdasarkan metode yang digunakan
sebelumnya 23-25. Banyaknya TIL yang menginfiltrasi sarang sel tumor dievaluasi dengan memeriksa lima
lapangan pandang daya tinggi yang representatif di bawah perbesaran 400x. Limfosit-limfosit yang intak
yang mengekspresikan CD3 atau CD8 dihitung secara manual, dan jumlah sel dirata-ratakan. Frekuensi PD-
1-, Foxp3-, ICOS-, dan LAG-3-positive TILs diukur menggunakan metode yang sama seperti yang
disebutkan di atas. Positivitas PD-1 didefinisikan sebagai ekspresi PD-1 pada ≥ 5% dari semua TIL. Untuk
sel T CD3 +, CD8 +, ICOS + dan LAG-3 + dan Foxp3 + Tregs, jika kepadatan sel berada di atas nilai
median, sampel dikategorikan berdensitas tinggi untuk jenis sel tersebut. Untuk p16 IHC, memakai kriteria
yang diterima secara konvensional, dan sampel yang didapat positif p16-nya ketika pewarnaan inti dan
sitoplasma yang kuat dan difus ditemukan pada lebih dari 70% dari semua sel tumor HNSCC. Semua pola
pewarnaan lainnya dinilai negatif 26,27.

Analisis Transkriptom.
Total 10 ng RNA ditranskripsikan terbalik menggunakan The Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene
Expression Kit sesuai dengan protokol pabrikan (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Pembacaan Ion
Proton dianalisis menggunakan plugin analisis AmpliSeqRNA, v4.2.1, pada Torrent Suite Software (Life
Technologies, Carlsbad, CA, USA). Program ini menghitung jumlah urutan yang diperoleh untuk semua
amplikon cDNA. Jumlah yang dihasilkan mewakili tingkat ekspresi gen untuk lebih dari 20.800 gen yang
berbeda yang nampak dalam panel the AmpliSeq Human Gene Expression 28.

Analisis Statistik.
Korelasi antara marker imun dan karakteristik pasien dianalisis menggunakan uji chi-square dengan koreksi
χ2 atau uji eksak Fisher untuk variabel kategori. Variabel survival/kelangsungan hidup dihitung
menggunakan metode Kaplan-Meier dan dperbandingkan melalui uji log-rank untuk variabel kategori atau
model regresi Cox dan statistik Wald chi-square terkait untuk variabel kuantitatif. Kelangsungan hidup
secara keseluruhan (Overall Survival (OS)) diukur semenjak waktu dari diagnosis awal sampai kematian
atau tindak lanjut berikut. Kelangsungan hidup bebas relaps (Relapse-free survival (RFS)) diukur dari saat
operasi hingga kekambuhan tumor awal (kekambuhan lokal atau jauh) atau kematian akibat
penyebab apapun. Pasien tanpa tanda-tanda kambuh dilakukan sensor pada saat tindak lanjut atau kematian
terbaru. Durasi follow-up rata-rata untuk keseluruhan populasi adalah 46,3 bulan.

Hasil
Data Klinikopatologi Dasar.
Data Kohort 402 sampel tumor HNSCC primer dievaluasi ekspresi PD-L1-nya pada TC dan IC serta
ekspresi PD-1, LAG-3, dan ICOS pada IC. Karakteristik klinikopatologi dasar pasien disajikan pada Tabel
1. Usia rata-rata adalah 58 tahun (kisaran 22-88 tahun), dan mayoritas pasien adalah laki-laki (75,1%) yang
perokok baik saat ini atau mantan perokok (61,1%) . Lokasi tumor primer yang dominan adalah rongga
mulut (204/402, 50,7%) dan orofaring (122/402, 30,3%). Persentase pasien pada masing-masing tahap
patologis adalah 28,9% pada tahap I, 10,7% pada tahap II, 18,4% pada tahap III, dan 42,0% pada tahap IVA
/ B. Selama masa follow-up rata-rata 46,3 bulan, 81 (20,1%) pasien mengalami kekambuhan, dan 74
(18,4%) pasien telah meninggal. Tingkat 5 tahun RFS dan OS masing-masing adalah 71,9% dan 79,6%.
Seperti yang diharapkan, hasil kelangsungan hidup terdiferensiasi dengan jelas sesuai dengan stadium
penyakit (Gambar Tambahan. 1). Kami menganalisis apakah banyaknya jumlah TIL atau ekspresi PD-L1

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 3

www.nature.com/scientificreports/

berkorelasi dengan gambaran klinikopatologi. Kami mengamati tidak ada korelasi signifikan frekuensi TIL
dengan stadium T, stadium N atau riwayat merokok. Ekspresi PD-L1 pada TC atau IC tidak berkorelasi
secara signifikan dengan karakteristik dasar ataupun klinikopatologi.

Semakin banyak ditemukan kadar TIL yang tinggi adalah faktor prognostik yang menguntungkan
untuk kelangsungan hidup pasien HNSCC.
Semua pasien dikelompokkan menjadi dua kelompok: kelimpahan TIL rendah atau tinggi, menurut
kelimpahan median CD3+ TIL (36 / HPF) dan CD8+ TIL (24 / HPF) (Gambar 1A (a-d)). Jumlah spesifik
dari CD3 +, CD8 +, dan Foxp3 +TIL disajikan dalam Gambar 2. Pasien dengan frekuensi tinggi CD3+ TIL
menunjukkan tingkat RFS 5 tahun yang jauh lebih tinggi (79,1% vs 65,0%) dan OS (73,5% vs 86,3%)
dibandingkan mereka yang memiliki frekuensi rendah CD3 + TIL. Analisis univariat menunjukkan risiko
rendah kekambuhan penyakit (rasio hazard [HR]: 0,57, 95% CI: 0,38-0,84, P = 0,005) dan kematian (HR:
0,56, 95% CI: 0,35-0,90, P = 0,01) di antara pasien dengan frekuensi tinggi CD3 + TIL (Gambar 2A, B).
`Pasien dengan jumlah CD8 + TIL tinggi juga menunjukkan tingkat 5 tahun yang jauh lebih tinggi baik pada
RFS (80,7% vs 63,3%) dan OS (87,1% vs 72,4%) dibandingkan dengan jumlah CD8 + TIL rendah (Gambar
2C, D). Analisis multivariat menunjukkan bahwa pasien dengan kelimpahan CD3 + TIL yang tinggi
memiliki risiko kekambuhan dan kematian yang jauh lebih rendah dibandingkan pasien dengan kelimpahan
CD3 + TIL yang rendah setelah disesuaikan untuk jenis kelamin, merokok, usia, stadium patologis, dan
infeksi HPV (RFS: HR yang disesuaikan [AHR] 0,57, 95% CI 0,39-0,8, P = 0,005; OS: AHR 0,56, 95% CI
0,35-0,90, P = 0,017) (Tabel Tambahan 1). Suatu kelimpahan tinggi CD8 + TILS juga berkorelasi dengan
risiko kekambuhan dan kematian yang signifikan lebih rendah daripada kelimpahan rendah CD8 + TILS
setelah disesuaikan berdasarkan jenis kelamin, merokok, usia, stadium patologis, dan infeksi HPV (RFS:
AHR 0,46, 95% CI 0.31- 0,70, P <0,001; OS: AHR 0,48, 95% CI 0,30-0,78, P = 0,003) (Tabel Tambahan 1).
Pasien dikelompokan menjadi dua kelompok sesuai dengan kelimpahan median sel Foxp3 + T (7 / HPF),
yang disebut sebagai kelompok TIL rendah dan tinggi (Gambar 1A (e, f)). Kelimpahan Foxp3 + Tregs yang
tinggi berhubungan erat dengan outcome kelangsungan hidup yang tinggi, relatif dibanding kelimpahan
Foxp3 + Tregs yang rendah. Kurva Kaplan-Meier menyoroti outcome kelangsungan hidup pasien yang lebih
buruk pada mereka yang jumlah Foxp3 + Treg-nya rendah dibandingkan dengan jumlah Foxp3 + Treg yang
tinggi (tingkat RFS 5 tahun: 79,5% vs 64,7%, P = 0,05; tingkat OS 5 tahun: 84,9% vs 74,8%, P = 0,09)
(Gambar 2E, F).

Ekspresi PD-1, LAG-3, dan ICOS pada sel imun.

Kami mengevaluasi ekspresi reseptor immune checkpoint, termasuk PD-1 dan LAG-3, dan reseptor
stimulasi imun ICOS oleh IC. Frekuensi ekspresi PD-1, LAG-3, dan ICOS pada IC secara semi-kuantitatif
dihitung di setiap lapangan pandang/HPF (Gambar. 1B (a-f)). Positivitas PD-1 didefinisikan sebagai
ekspresi PD-1 pada ≥ 5% dari semua IC. Kadar LAG-3 dan ICOS yang rendah dan tinggi dalam setiap sel
diberi skor menggunakan level median infiltrasi tumor oleh IC sebagai nilai cut-off. Kelimpahan rata-rata
LAG-3- dan ICOS- yang diekspresikan IC adalah masing-masing 12 dan 3 per HPF. PD-1 positif tampaknya
terkait dengan risiko kekambuhan yang lebih rendah dan risiko kematian yang lebih rendah (tingkat RFS 5
tahun: 82,1% vs 68,3%, P = 0,02; tingkat OS 5 tahun: 88,8% vs 76,9%, P = 0,06) (Gambar 3A, B). Analisis
regresi Cox multivariat menunjukkan bahwa pasien dengan lebih banyak IC yang mengekspresikan PD-1
memiliki outcome kelangsungan hidup yanglebih superior dibanding mereka dengan lebih sedikit IC yang
mengekspresikan PD-1 (RFS: HR: 0,56, 95% CI: 0,34-0,93, P = 0,02; OS: HR: 0,57, 95% CI: 0,31-1,05, P =
0,07) (Tambahan Tabel 1). Pasien dengan kelimpahan IC yang mengekspresikan LAG-3 yang tinggi
cenderung memiliki RFS dan OS yang panjang dibandingkan dengan mereka yang memiliki kelimpahan
rendah, meskipun hasil ini tidak menunjukkan signifikansi statistik (Gambar 3C, D). Namun, ekspresi ICOS
tidak menunjukkan dampak prognostik yang signifikan pada RFS atau OS di antara pasien-pasien HNSCC
(Gambar 3E, F).

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 4

www.nature.com/scientificreports/

Characteristics Total (n= 402) n (%)

Age, years
Median (range) 58 (22–88)
Sex
Male 302 (75.1)
Female 100 (24.9)
Primary sites§
Oral cavity 204 (50.7)
Oropharynx 122 (30.3)
Larynx 44 (10.9)
Hypopharynx 28 (7)
Nasal cavity 4 (1.0)
Differentiation
Well differentiated 149 (37.1)
Moderately differentiated 200 (49.8)
Poorly differentiated 53 (13.2)
pT stage
T1 183 (45.5)
T2 148 (36.8)
T3 28 (7.0)
T4 43 (10.7)
pN stage
N0 180 (44.8)
N1 76 (18.9)
N2 146 (36.1)
N3 3 (0.7)
AJCC7 stage
Stage I 116 (28.9)
Stage II 43 (10.7)
Stage III 74 (18.4)
Stage IVA/B 169 (42.0)
Smoking
Never smoker 156 (38.9)
Former smoker* 81 (20.1)
Current smoker 165 (41.0)
Smoking history (pack*years)
Median (range) 18 (0–100)
Resection margin
Positive 94 (23.4)
Negative 308 (76.6)
Lymphovascular invasion
Yes 76 (18.9)
No 326 (81.1)
Perineural invasion
Yes 54 (13.4)
No 348 (86.6)
p16 expression status
Positive 163 (40.5)
Negative 239 (59.5)
Adjuvant treatment
CCRT 101 (25.3)
Radiotherapy 151 (37.8)
Chemotherapy 2 (0.5)
No 146 (36.5)

Table 1. Karakteristik dasar

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 5

www.nature.com/scientificreports/

A. T cells B. Immune regulatory receptors

lo
(a) CD3 (b) CD3 hi (a) PD1lo (b) PD1hi

(c) CD8lo (d) CD8hi (c) LAG3lo (d) LAG3hi

(e) FOXP3lo (f) FOXP3hi (e) ICOSlo (f) ICOShi

C. PD-L1
(a) IC0 (b) IC1 (c) IC2 (d) IC3

(e) TC0 (f) TC1 (g) TC2 (h) TC3

Gambar 1. (A) Sampel yang menunjukkan CD3 +, CD8 +, dan sel T regulator: (a) infiltrasi rendah sel T CD3 +
(b) infiltrasi tinggi sel T CD3 + (c) infiltrasi rendah sel T CD8 + (d) infiltrasi tinggi sel T CD8 + (e) infiltrasi
rendah dari Foxp3 + Tregs (f) infiltrasi tinggi dari Foxp3 + Tregs. (B) Sampel yang menunjukkan ekspresi
reseptor regulasi imun pada sel imun: (a) ekspresi rendah PD-1 (b) ekspresi tinggi PD-1 (c) ekspresi rendah
LAG-3 (d) ekspresi tinggi dari LAG-3 (e) ekspresi rendah ICOS (f) ekspresi ICOS yang tinggi. (C) ekspresi
PD-L1 secara semi-kuantitatif dinilai dalam tumor-infiltrating immune cells (IC) sebagai IC0, 0% (a); IC1,> 0%
tetapi <5% (b); IC2, ≥5% tetapi <50% (c); dan IC3 ≥50% (d). Dalam sel tumor (TC), ekspresi PD-L1 dinilai
sebagai TC0, 0% (e); TC1,> 0% tetapi <5% (f); TC2, ≥5% tetapi <50% (g); dan TC3,≥50% (h).

Of note, PD-1 expression on IC showed a significant positive correlation with LAG-3 and ICOS expression (LAG-
3: Pearson correlation coefficient= 0.514, P = 0.0001; ICOS: Pearson correlation coefficient= 0.229, P = 0.0001).

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 6

www.nature.com/scientificreports/

A B
1.0 1.0

Proportion of recurrence free survival

0.8 0.8

Proportion of overall survival

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 P = 0.015 0.2 P = 0.015

CD3+TIL density CD3+TIL density
low low
high high
0.0 0.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Months Months
C D
1.0 1.0
Proportion of recurrence free survival

0.8 0.8

Proportion of overall survival

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 P < 0.001 0.2 P = 0.003

CD8+TIL density CD8+TIL density
low low
high high
0.0 0.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Months Months
E F
1.0 1.0
Proportion of recurrence free survival

0.8 0.8
Proportion of overall survival

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 P = 0.005 0.2 P = 0.09

FOXP3 FOXP3
low low
high high
0.0 0.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Months Months
Gambar 2. 402 pasien ditugaskan ke salah satu dari dua kelompok berdasarkan subset tertentu dari
limfosit T. (A) Tingkat RFS 5 tahun adalah 65,0% untuk CD3+ rendah vs 79,1% untuk CD3+ tinggi; P =
0,005. (B) Tingkat OS 5 tahun adalah 73,5% untuk CD3+ rendah vs. 86,3% untuk CD3+ tinggi; P = 0,01.
(C) Tingkat RFS 5 tahun adalah 63,3% untuk CD8+ rendah vs. 80,7% untuk CD8+ tinggi; P <0,0001. (D)
Tingkat OS 5-tahun adalah 72,4% untuk CD8+ rendah + 87,1% untuk CD8 + tinggi; P = 0,003. (E) Tingkat
RFS 5 tahun adalah 64,7% untuk Treg Foxp3 rendah vs 79,5% untuk Treg Foxp3 tinggi; P = 0,05. (F)
Tingkat OS 5-tahun adalah 74,8% untuk Treg Foxp3 rendah vs 84,9% untuk Treg Foxp3 tinggi; P = 0,09.

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 7

www.nature.com/scientificreports/

A B
1.0 1.0

Proportion of recurrence free survival

0.8 0.8

Proportion of overall survival

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 P = 0.02 0.2 P = 0.06

PD-1(5%) PD-1(5%)
low low
high high
0.0 0.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Months Months

C D
1.0 1.0

0.8 0.8
Proportion of recurrence free survival

Proportion of overall survival

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 P = 0.05 0.2 P = NS

LAG-3 LAG-3
low low
high high
0.0 0.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Months Months
E F
1.0 1.0
Proportion of recurrence free survival

0.8 0.8
Proportion of overall survival

0.6 0.6

0.4 0.4

P = NS P = NS
0.2 0.2
ICOS ICOS
low low
high high
0.0 0.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Months Months

Gambar 3. (A) Tingkat kelangsungan hidup 5 tahun bebas kekambuhan (recurrence-free survival (RFS))
adalah 72,4% untuk sel tumor PD-L1-positif (TC) vs 65,6% untuk PD-L1-negatif TC; P = 0,206. (B) Tingkat
kelangsungan hidup keseluruhan 5 tahun (OS) adalah 80,1% untuk PD-L1-positif TC vs 77,7% untuk PD-L1-
negatif TC; P = 0,317. (C) Tingkat RFS 5 tahun adalah 69,7% untuk sel imun PD-L1-negatif (IC) vs 80,1%
untuk PD-L1-positif IC; P = 0,005. (D) Tingkat OS 5-tahun adalah 75,6% untuk PD-L1-negatif IC vs 90,6%
untuk PD-L1-positif IC; P = 0,003. (E) Ekspresi PD-L1 pada TC dan IC dikategorikan ke dalam empat
kelompok sesuai dengan persentase sel positif: TC0 atau IC0, 0%; TC1 atau IC1,> 0% tetapi <5%; TC2 atau
IC2, ≥5% tetapi <50%; dan TC3 atau IC3, ≥50%. Jumlah (frekuensi) dari TC1 / 2/3 dan IC1 / 2/3 adalah
129/402 (32,1%) dan 201/402 (50%), masing-masing, dan tumpang tindih antara TC1/ 2/3 dan IC1/2/3 adalah
103/402 (25,6%). Hitungan (frekuensi) dari TC2/3 dan IC2/3 adalah 73/402 (18,2%) dan 112/402 (27,9%),
dan tumpang tindih antara kedua kelompok ini adalah 40/402 (10%). Khususnya, jumlah (frekuensi) dari TC3
dan IC3 adalah 10/402 (2,5%) dan 28/402 (7,0%), masing-masing, dan tumpang tindih antara TC3 dan IC3
hanya 1/402 (0,2%).

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 8

www.nature.com/scientificreports/

Ekspresi PD-L1 oleh sel imun (IC) adalah faktor prognostik menguntungkan independen untuk RFS
dan OS pada pasien HNSCC.
Sebagaimana ditunjukkan dalam penelitian sebelumnya, PD-L1 diekspresikan dalam membran sitoplasma
TC dan IC, termasuk limfosit T, makrofag, dan sel dendritik. Seperti dilaporkan dalam penelitian
sebelumnya menggunakan antibodi anti-PD-L1 yang sama (klon SP142, Ventana) 2, kami juga menemukan
bahwa distribusiPD-L1-positif pada sel tumor umumnya sangat fokal. Sedangkan makrofag dan sel
dendritik yang menginfiltrasi tumor memiliki sitoplasma yang jelas terlihat, mereka menunjukkan pola
pewarnaan PD-L1 membranosa. Karena limfosit T biasanya mengandung sitoplasma yang sedikit,
pewarnaan PD-L1 terdeteksi dalam pola butiran seperti titik di daerah perinuklear. Kami juga mencatat
bahwa PD-L1-positif pada IC yang terkumpul di pinggiran sarang sel tumor, di band-band stroma yang
melintasi sarang sel tumor, atau sebagai sel tunggal yang tersebar di stroma atau dalam sarang sel tumor,
seperti yang diamati dalam studi sebelumnya 2 ( Gambar Tambahan. 3). Untuk membedakan secara jelas TC
dari IC dalam kasus kami, kami melakukan pewarnaan tambahan dengan CD3 dan cytokeratin pada bagian
tumor yang berdekatan (Gambar Tambahan. 4).

PD-L1 positif didefinisikan sebagai ekspresi PD-L1 pada ≥ 5% dari semua TC atau IC berdasarkan IHC.
Frekuensi PD-L1 positif dalam TC dikategorikan ke dalam empat kelompok, sebagai berikut: 273 (67,9%)
pada 0%, 56 (13,9%) pada > 0% tetapi <5%, 63 (15,7%) pada ≥ 5% tetapi <50%, dan 10 (2,5%) pada ≥ 50%
TC (Gambar 1C (a –d)). Frekuensi PD-L1-positif IC ditentukan menggunakan kriteria yang sama: 201
(50%), 89 (22,1%), 84 (20,9%), dan 28 (7,0%) dalam 0%,> 0% tapi < 5%, ≥ 5% tetapi <50%, dan ≥ 50%
kelompok (Gambar 1C (e –h)). PD-L1 positif pada TC tidak menunjukkan dampak yang signifikan baik
pada RFS atau OS dibandingkan dengan PD-L1 negatif pada TC (5 tahun RFS: 72,4% vs 65,6%, P = 0,206;
OS 5 tahun: 80,1% vs 77,7%, P = 0,317) (Gambar 4A, B). Sebaliknya, pasien dengan PD-L1-positif IC
secara signifikan lebih tinggi level 5 tahun RFS (80,1% vs 69,7%) dan OS (90,6% vs 75,6%) (Gambar 4C,
D). Analisis multivariat menegaskan bahwa pasien dengan PD-L1-positif pada IC memiliki risiko
kekambuhan dan kematian yang secara signifikan lebih rendah daripada mereka yang tidak memiliki PD-L1-
positif IC setelah disesuaikan untuk jenis kelamin, merokok, usia, stadium patologis, dan infeksi HPV (RFS:
AHR 0,49 , 95% CI 0,29-0,82, P = 0,005; OS: AHR 0,38, 95% CI 0,19-0,73, P = 0,04) (Tambahan Tabel 1).
Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa ekspresi PD-L1 yang tinggi pada IC merupakan faktor
prognosis independen yang menguntungkan untuk HNSCC yang direseksi secara pembedahan. Frekuensi
infiltrasi CD3 + dan CD8 + limfosit T tidak berbeda secara signifikan antara pasien dengan PD-L1-positif
dan PD-L1 negatif IC atau TC (sel T CD3 +: 85,7 vs 80,8%, P = 0,41; sel CD8 + T: 80,4 vs 78,1%, P =
0,71). Oleh karena itu, pertimbangan ekspresi PD-L1 sebagai penanda prognostik yang menguntungkan
harus dibatasi pada IC, bukan TC.

Ketika PD-L1 positif dari IC dan TC dianalisis secara terpisah, jumlah hitung TC1/ 2/3 dan IC1/ 2/3
(frekuensi) adalah masing-masing 129 (32,1%) dan 201 (50%), dan yang tumpang tindih antara TC1/ 2/3
dan IC1/ 2/3 adalah 103 (25,6%). Jumlah (frekuensi) dari TC2 / 3 dan IC2 / 3 adalah 73 (18,2%) dan 112
(27,9%), dan yang tumpang tindih antara kedua subkelompok adalah 40 (10%). Khususnya, jumlah TC3 dan
IC3 (frekuensi) adalah 10 (2,5%) dan 28 (7,0%), dan hanya 1 (0,2%) sel yang menunjukkan tumpang tindih
antara TC3 dan IC3, yang mencerminkan hampir tidak ada overlap, seperti ditunjukkan pada Gambar. 4E.
Temuan ini menunjukkan bahwa ekspresi PD-L1 mungkin diatur oleh mekanisme berbeda di TC dan IC.
Tidak ada perbedaan signifikan dalam intensitas CD8 + atau CD3 + pada TIL di antara kelompok IC3 dan
TC3. Untuk menganalisis perbedaan potensial dalam mekanisme ekspresi PD-L1 antara jenis sel,
dilakukanlah analisis transkriptom pada sampel tumor dari sub kelompok TC3 dan IC3. Hasil kami
menandakan bahwa mekanisme yang mendasari induksi PD-L1 mungkin berbeda antara TC dan IC. Hasil
menunjukkan bahwa tingkat ekspresi marker sel T efektor termasuk IFNγ dan GZMB lebih tinggi di grup
IC3 daripada di grup TC3. Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi PD-L1 pada IC3 diatur oleh mekanisme
yang dimediasi IFNγ adaptif, mencerminkan imunitas yang sudah ada sebelumnya (Tambahan Gambar. 5,
Tambahan Tabel 2).

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 9

www.nature.com/scientificreports/

HPV. Kami membagi 402 pasien HNSCC menjadi dua kelompok berdasarkan ada tidaknya infeksi HPV
onkogenik (seperti yang ditunjukkan oleh ekspresi p16) pada tumor mereka. Frekuensi HPV positif adalah
41,8% (168/402) di antara semua pasien HNSCC dan 80,3% (98/122) di antara pasien kanker orofaring
(OPC). Berdasarkan perkiraan Kaplan-Meier, outcome kelangsungan hidup pasien dengan kanker HPV-
positif secara signifikan lebih baik daripada pasien dengan kanker HPV-negatif (5 tahun RFS: 82,4% vs
64,3%, P <0,001; OS 5 tahun : 85,6% vs. 75,3%, P = 0,006). Pasien dengan OPC HPV-positif juga memiliki
RFS dan OS yang secara signifikan lebih baik dibandingkan dengan OPC HPV-negatif. Sampel OPC HPV-
positif lebih banyak diinfiltrasi oleh sel CD3 + (P <0,001), sel CD8 + (P = 0,001), PD-1 + TILs (P = 0,01),
dan LAG-3 + TIL (P = 0,001) dari HPV sampel OPC negatif. Kecenderungan peningkatan infiltrasi pada
sampel OPC HPV positif juga diamati dalam bentuk infiltrasi sel Foxp3 + tingkat tinggi. IC yang
mengekspresikan PD-L1 lebih sering ditemukan pada OPC HPV-positif daripada di OPC HPV-negatif
(Tabel 2). Sampel OPC HPV-positif diinfiltrasi oleh banyak PD-L1 + IC, PD-1 + TIL, CD3 +, dan
keberadaan sel CD8 + berkorelasi dengan OS yang lebih baik. Memang, pasien dengan PD-L1-positif IC
memiliki tingkat OS 5 tahun keseluruhan 93,8%, sedangkan pasien dengan PD-L1-negatif IC memiliki
tingkat OS 5 tahun keseluruhan 81,4% (P = 0,04). Pasien OPC HPV-positif yang menunjukkan infiltrasi sel
CD8 + tinggi menunjukkan RFS dan OS lebih superior dibanding mereka yang menunjukkan infiltrasi sel
CD8+ rendah (tingkat RFS 5 tahun: 91,0% vs 69,0%, P <0,001; tingkat OS 5 tahun: 94,2% vs. 72,1%, P
<0,001) Sebaliknya, tingkat infiltrasi oleh sel T Foxp3+, PD-1 + TIL, dan LAG-3 + TILs tidak berkorelasi
dengan OS pada pasien OPC HPV-positif.

DISKUSI
Sebagaimana imunoterapi disorot sebagai strategi pengobatan yang efektif untuk pasien HNSCC,
ketertarikan pada biomarker yang terkait dengan kekebalan tubuh telah sangat meningkat. Meskipun
infiltrasi CD3 + atau CD8 + TIL diketahui berkorelasi dengan prognosis yang menguntungkan pada pasien
HNSCC, masih banyak yang belum diketahui terkait dengan biomarker imun (immune-related biomarker)
HNSCC. Dalam penelitian ini, kami secara komprehensif mengevaluasi frekuensi ekspresi PD-L1 pada TC
dan IC. Selain itu,kami mengevaluasi ekspresi reseptor regulasi imun lainnya (yaitu, PD-1, ICOS, dan LAG-
3), kelimpahan beberapa jenis sel T (yaitu, CD3 +, CD8 +, dan Treg) dan dampak prognostik mereka pada
outcome pasien HNSCC yang direseksi. Pasien dengan ekspresi PD-L1 pada IC memiliki outcome
kelangsungan hidup yang menguntungkan, sedangkan ekspresi PD-L1 pada TC atau di seluruh bagian
jaringan, termasuk TC dan IC, tidak menunjukkan dampak prognostik pada outcome kelangsungan hidup
pasien HNSCC. Dalam penelitian kami, kelimpahan CD3 + atau CD8 + TIL yang tinggi secara independen
terkait dengan outcome kelangsungan hidup yang panjang pada pasien HNSCC, dan temuan kami konsisten
dengan laporan sebelumnya 9. Sel T CD8 + didominasi oleh sel T sitotoksik, komponen penting dari sistem
kekebalan seluler, dan sangat penting untuk respon imun anti-tumor yang dimediasi sel 20,29,30.

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 10

www.nature.com/scientificreports/

A B
1.0 1.0

Proportion of recurrence free survival

0.8 0.8

Proportion of overall survial

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 P = NS 0.2 P = NS
PD-L1(5%) on TC PD-L1(5%) on TC
low low
high high
0.0 0.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Months Months
C D
1.0 1.0

0.8 0.8
Proportion of recurrence free survival

Proportion of overall survival

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 P = 0.005 0.2 P = 0.003

PD-L1 (5%) on IC PD-L1 (5%) on IC
low low
high high
0.0 0.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Months Months

E
TC3 IC3
2.5% 7.0%
(9) (27)

0.2% (1)

TC2/3 0% IC2/3
18.2% 40 27.9%
(73) (112)

TC1/2/3 IC 1/2 3
25.6%
32.1% 50 %
( 3)
(129) ( 1

Gambar 4. 402 pasien ditugaskan ke salah satu dari dua kelompok berdasarkan ekspresi immune
checkpoint pada limfosit T. (A) Tingkat RFS 5 tahun adalah 82,1% untuk sel T PD-1 positif vs 68,3% untuk
sel T PD-1 negatif (P = 0,02). (B) Tingkat OS 5 tahun adalah 88,8% untuk sel T PD-1 pos vs 76,9% untuk sel
T PD-1neg (P = 0,06). (C) Tingkat RFS 5 tahun adalah 77,1% untuk sel LAG-3 pos T vs 67,1% untuk sel T
LAG-3 neg (P = 0,054). (D) Tingkat OS 5 tahun adalah 83,9% untuk sel T LAG-3 pos vs 75,7% untuk sel T
LAG-3 neg (P = 0,16). (E) Tingkat RFS 5 tahun adalah 75,2% untuk ICOS pos sel T vs 69,9% untuk sel T
ICOS neg (P = 0,53). (F) Tingkat OS 5 tahun adalah 79,9% untuk sel T ICOS pos vs 80,0% untuk sel T ICOS
neg (P = 0,64).

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 11

 www.nature.com/scientificreports/

HPV-positive oropharyngeal HPV-negative oropharyngeal

cancer (n= 98) cancer (n= 24) P-value
CD3 + TIL High 73 (59.8%) 5 (4.1%) <0.001
Low 25 (20.5%) 19 (15.6%)
CD8 + TIL High 73 (59.8%) 9 (7.4%) 0.001
Low 25 (20.5%) 15 (12.3%)
Foxp3 + T cell High 53 (43.4%) 8 (6.6%) 0.055
Low 45 (36.9%) 16 (13.1%)
PD-L1 + tumor cell High 19 (15.6%) 3 (2.5%) 0.324
Low 79 (64.8%) 21 (17.2%)
PD-L1 + immune cell High 45 (36.9%) 4 (3.3%) 0.01
Low 53 (43.4%) 20 (16.4%)
PD-1 TIL High 48 (39.3%) 3 (2.5%) 0.01
Low 50 (41.0%) 21 (17.2%)
LAG-3 TIL High 73 (59.8%) 6 (4.9%) 0.001
Low 25 (20.5%) 18 (14.8%)
ICOS TIL High 39 (32.0%) 12 (9.8%) 0.248
Low 59 (48.4%) 12 (9.8%)

Table 2. Correlations of HPV infection status with T-cell infiltration and PDL-1 expression.
Abbreviations: HPV, human papilloma virus; TIL, tumor infiltrating lymphocyte.

Yang paling penting, kami secara komprehensif mengevaluasi ekspresi PD-L1 pada IC, TC, dan seluruh bagian
jaringan. Di seluruh bagian jaringan, terlepas dari TC atau IC, ekspresi PD-L1 tidak menunjukkan dampak prognostik
untuk pasien yang termasuk (data tidak ditampilkan). Anehnya, hanya ekspresi PD-L1 pada IC yang menunjukkan
prognosis yang menguntungkan pada pasien HNSCC ini. Nilai prognostik PD-L1 masih kontroversial pada pasien
HNSCC. Beberapa laporan menunjukkan bahwa ekspresi PD-L1 adalah faktor prognostik negatif pada beberapa jenis
kanker, termasuk kanker ginjal, kolorektal, dan paru-paru 16-18, tetapi yang lain melaporkan bahwa PD-L1 adalah
faktor prognosis yang menguntungkan pada melanoma metastatik, NSCLC, dan karsinoma sel Merkel 21,22,31. Baru-
baru ini, telah dilaporkan bahwa ekspresi PD-L1 dan kelimpahan TIL adalah faktor prognostik menguntungkan
independen untuk OS dan RFS pada pasien karsinoma sel skuamosa laring. Hingga saat ini, tidak ada studi
komprehensif tentang IC dan TC yang berfokus pada HNSCC. Sebagian besar penelitian terkait, ekspresi PD-L1 pada
bagian tumor telah dievaluasi tanpa diskriminasi yang baik antara IC dan TC. Berdasarkan hasil kami, ekspresi PD-L1
pada TC dan IC mungkin memiliki nilai prognostik yang berbeda dan mungkin diatur oleh mekanisme yang berbeda.
Ketika kita secara terpisah menganalisis kepositifan PD-L1 pada TC dan IC, yang dikategorikan ke dalam empat
kelompok, PD-L1 secara eksklusif diekspresikan pada TC atau IC. Dari catatan, TC3 dan IC3 mewakili populasi yang
berbeda dengan tumpang tindih <1% , menunjukkan bahwa PD-L1 kemungkinan diatur oleh mekanisme yang berbeda
pada himpunan bagian dari TC dan IC. Berdasarkan hasil analisis transkriptom kami, ekspresi PD-L1 pada IC diatur
melalui mekanisme adaptif dan mencerminkan kekebalan yang sudah ada sebelumnya. Namun, ekspresi PD-L1 pada
TC dapat diatur oleh mekanisme tumor-intrinsik termasuk induksi HIF1-α oleh keadaan hipoksia, aktivasi jalur sinyal
onkogenik, atau transisi epitelial mesenkimal, meskipun kita tidak dapat mengidentifikasi kode gen khas yang berbeda
pada TC332-35. Secara kolektif, hasil kami menyoroti pentingnya penilaian komprehensif ekspresi PD-L1 baik pada
TC maupun IC. Sebagai catatan, tidak ada perbedaan dalam infiltrasi limfosit antara populasi PD-L1 positif TC dan IC
. Setelah dikompensasi oleh infiltrasi sel T, kepositifan PD-L1 dari IC tetap menjadi faktor prognostik yang
menguntungkan dalam kelompok pasien HNSCC ini, dan hasil ini menunjukkan nilai prognosis independen yang
baik.

Perlu dicatat, ekspresi PD-1 yang tinggi dikaitkan dengan outcome kelangsungan hidup yang panjang pada pasien
HNSCC yang direseksi. Hasil ini konsisten dengan data yang dilaporkan baru-baru ini pada pasien HNSCC yang
positif-HPV 36, di mana mereka dengan sel T yang mengekspresikan PD-1 tingkat tinggi berkorelasi dengan outcome
kelangsungan hidup yang lebih baik daripada mereka dengan sel-sel yang mengekspresikan tingkat rendah 36. Selain
itu, pada limfoma folikuler, tingkat infiltrasi yang tinggi oleh sel T PD-1-positif mungkin terkait dengan outcome yang
baik dan penurunan risiko transformasi. Sebaliknya, beberapa penelitian lain telah menemukan bahwa ekspresi PD-1
pada IC berkorelasi dengan prognosis yang buruk dan dikaitkan dengan kelangsungan hidup yang lebih pendek pada
pasien kanker sel ginjal, kanker nasofaring, dan limfoma Hodgkin 37–39. PD-1 pada sel T dan IC dikenal melakukan
fungsi inhibisi terhadap sel T efektor, dan PD-1 sangat diregulasi dalam sel T yang kelelahan. Beberapa hipotesis

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 12

 www.nature.com/scientificreports/

dapat menjelaskan prognosis menguntungkan paradoksal ini dari ekspresi PD-1 pada IC. Mengingat bahwa
peningkatan ekspresi PD-1 bisa karena hasil dari aktivasi reseptor sel T, PD-1 mungkin tetap diregulasi dalam konteks
rangsangan antigen-imun spesifik yang persisten. Selain itu, sel T yang mengekspresikan PD-1 mungkin termasuk sel-
sel T antigen spesifik tumor yang menggunakan efek anti-tumor di lingkungan mikro tumor. Ekspresi PD-1 yang
tinggi lebih mencerminkan "status kelelahan" daripada ekspresi PD-1 menengah atau rendah. Namun, kami tidak
dapat menganalisis tingkat ekspresi PD-1 secara rinci karena keterbatasan IHC dan kesulitan dalam menentukan
intensitas pewarnaan PD-1 awal. Dengan demikian, kami tidak dapat menentukan status pengaktifan yang tepat dari
ekspresi PD-1 pada sel T. Kita dapat sementara menyimpulkan bahwa pasien HNSCC dengan sel T PD-1 positif
memiliki outcome kelangsungan hidup yang menguntungkan karena sel T antigen spesifik tumor hadir di antara sel T
PD-1 positif. Dalam analisis gabungan termasuk pasien NSCLC lanjut yang sebelumnya disaring dan / atau terdaftar
dalam tiga uji coba mengevaluasi antibodi anti-PD-L1 atezolizumab (PCD4989g Fase I; FIR Fase II; POPLAR Fase
II; 1.273 pasien), ekspresi reseptor tinggi PD-1 dan B7.1 dikaitkan dengan peningkatan OS setelah pengobatan dengan
atezolizumab. Secara bersama-sama, bukti ini menandakan bahwa pasien dengan ekspresi PD-1 yang tinggi pada TILs
dapat menjadi kandidat potensial untuk blokade anti-PD-1 / PD-L1.

Ekspresi LAG-3 yang tinggi pada IC cenderung memperpanjang kelangsungan hidup dalam penelitian kami,
meskipun hasil ini tidak memiliki signifikansi statistik. Pengamatan ini menunjukkan bahwa IC yang
mengekspresikan LAG-3 mungkin termasuk sel-sel T antigen spesifik tumor. ICOS tidak menunjukkan dampak
prognostik dalam kelompok kami. Namun, karena frekuensi rendah TIL yang mengekspresikan LAG-3- dan ICOS,
kita tidak dapat menarik kesimpulan mengenai dampak prognostik mereka. Seperti yang diharapkan, ekspresi LAG-3
dan ICOS tampaknya sangat terkait dengan ekspresi PD-1 pada TIL. Penelitian kami menunjukkan bahwa Foxp3 +
Tregs tingkat tinggi pada pasien HNSCC berkorelasi positif dengan prognosis yang lebih baik 40. Hasil ini
menyangkut nilai prognostik yang menguntungkan dari Tregs intra-tumoral pada HNSCC yang selanjutnya telah
direproduksi oleh berbagai kelompok 36. Berdasarkan analisis korelasi antara Foxp3 + TILs dan ekspresi PD-L1 pada
IC ataupun TC, ekspresi PD-L1 pada IC dan TC secara signifikan terkait dengan peningkatan frekuensi Foxp3 + TIL
dalam kelompok kami. Fenomena ini mungkin karena PD-L1 dan Treg cell juga direkrut di bawah kondisi
imunosupresif seperti lingkungan mikro dari tumor. Dengan demikian, bisa ada korelasi positif antara Foxp3 + TIL
dan ekspresi PD-L1 pada IC atau TC. Sebuah penelitian baru-baru ini melaporkan bahwa Foxp3 + Treg cell dibagi
menjadi beberapa subset spesifik termasuk Foxp3 + Treg cell yang terdiferensiasi sangat baik dan paling supresif 41.
Kami tidak tahu tepatnya status sel Treg dalam laporan sebelumnya termasuk punya kami, karena studi sebelumnya
biasanya menggunakan Foxp3 sebagai penanda representatif sel Treg. OPC HPV-positif lebih banyak diinfiltrasi oleh
sel T CD3+ dan CD8+ dan oleh PD-1+ dan LAG-3+ IC daripada OPC HPV-negatif. Selain itu, ekspresi PD-L1 pada
IC lebih sering diamati pada OPC HPV-positif daripada di OPC HPV-negatif dan menunjukkan prognosis
menguntungkan berdampak pada outcome kelangsungan hidup pasien OPC HPV-positif. Sayangnya, kami tidak dapat
mengidentifikasi apakah berbagai marker imun dapat memprediksi respons terhadap blokade immune checkpoint
karena studi kohor kami tidak
memasukkan pasien yang diobati dengan terapi ini. Di masa depan, kita harus mengevaluasi nilai marker imun
prediktif ini pada pasien HNSCC yang diobati dengan imunoterapi.

Sebagai ringkasan, penelitian kami menunjukkan bahwa ekspresi PD-L1 pada IC, bukan pada TC, banyaknya IC yang
mengekspresikan PD-1, dan banyaknya sel Foxp3+ Treg adalah prediktor independen dari kelangsungan hidup
keseluruhan yang menguntungkan pada pasien HNSCC. Penilaian ekspresi molekul terkait imun pada HNSCC bisa
menghasilkan bukti yang relevan dengan kesesuaian terapi melalui blokade immune checkpoint. Selain itu, temuan
kami menyoroti pentingnya penilaian komprehensif dari kedua TC dan IC pada HNSCC.

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 13

www.nature.com/scientificreports/

References
1. Straub, M. et al. CD274/PD-L1 gene amplification and PD-L1 protein expression are common events in squamous cell carcinoma of
the oral cavity. Oncotarget, doi:10.18632/oncotarget.7593. 102024–112034 (2016).
2. Herbst, R. S. et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature 515, 563–567
(2014).
3. Swanson, M. S. & Sinha, U. K. Rationale for combined blockade of PD-1 and CTLA-4 in advanced head and neck squamous cell
cancer-review of current data. Oral Oncol. 51, 12–15 (2015).
4. Kim, J. W. & Eder, J. P. Prospects for targeting PD-1 and PD-L1 in various tumor types. Oncology 28 Suppl 3, 15–28 (2014).
5. Fury, M., Ou, S. I., Balmanoukian, A. & Hansen, A. Clinical activity and safety of MEDI4736, an anti PD-L1 antibody, in patients
with head and neck cancer [abstract 988PD]. Ann Oncol 25, iv340–iv356 (2014).
6. Segal, N. H. et al. Preliminary data from a multi-arm expansion study of MEDI4736, an anti-PD-L1 antibody. J. Clin. Oncol. 32, 3002
(2014).
7. Seiwert, T. Y. et al. A phase Ib study of MK-3475 in patients with human papillomavirus (HPV)-associated and non-HPV–associated
head and neck (H/N) cancer. J. Clin. Oncol. 32, 6011 (2014).
8. Ferris, R. L. Immunology and immunotherapy of head and neck cancer. J. Clin. Oncol. 33, 3293–3304 (2015).
9. Teng, M. W., Ngiow, S. F., Ribas, A. & Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Res. 75,
2139–2145 (2015).
10. Ock, C. Y. et al. Pan-cancer immunogenomic perspective on the tumor microenvironment based on PD-L1 and CD8 T cell
infiltration. Clin. Cancer Res. 22, 2261–2270 (2016).
11. Partlova, S. et al. Distinct patterns of intratumoral immune cell infiltrates in patients with HPV-associated compared to non-virally
induced head and neck squamous cell carcinoma. Oncoimmunology 4, e965570 (2015).
12. Strauss, L. et al. The frequency and suppressor function of CD4+CD25highFoxp3+ T cells in the circulation of patients with
squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin. Cancer Res. 13, 6301–6311 (2007).
13. Camisaschi, C. et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at
tumor sites. J. Immunol. 184, 6545–6551 (2010).
14. Ferris, R. L., Lu, B. & Kane, L. P. Too much of a good thing? Tim-3 and TCR signaling in T cell exhaustion. J. Immunol. 193,
1525–1530 (2014).
15. Chen, D. S., Irving, B. A. & Hodi, F. S. Molecular pathways: next-generation immunotherapy–inhibiting programmed death-ligand
1 and programmed death-1. Clin. Cancer Res. 18, 6580–6587 (2012).
16. Mu, C. Y. et al. High expression of PD-L1 in lung cancer may contribute to poor prognosis and tumor cells immune escape through
suppressing tumor infiltrating dendritic cells maturation. Med. Oncol. 28, 682–688 (2011).
17. Song, M. et al. PTEN loss increases PD-L1 protein expression and affects the correlation between PD-L1 expression and clinical
parameters in colorectal cancer. PLoS One 8, e65821 (2013).
18. Konishi, J. et al. B7-H1 expression on non-small cell lung cancer cells and its relationship with tumor-infiltrating lymphocytes and
their PD-1 expression. Clin. Cancer Res. 10, 5094–5100 (2004).
19. D’Incecco, A. et al. PD-1 and PD-L1 expression in molecularly selected non-small-cell lung cancer patients. Br J Cancer 112, 95–102
(2015).
20. Vassilakopoulou, M. et al. Evaluation of PD-L1 expression and associated tumor-infiltrating lymphocytes in laryngeal squamous cell
carcinoma. Clin. Cancer Res. 22, 704–713 (2016).
21. Taube, J. M. et al. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an
adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra137 (2012).
22. Lipson, E. J. et al. PD-L1 expression in the Merkel cell carcinoma microenvironment: association with inflammation, Merkel cell
polyomavirus and overall survival. Cancer Immunol Res 1, 54–63 (2013).
23. Balermpas, P. et al. CD8+ tumour-infiltrating lymphocytes in relation to HPV status and clinical outcome in patients with head and
neck cancer after postoperative chemoradiotherapy: a multicentre study of the German cancer consortium radiation oncology
group (DKTK-ROG). Int. J. Cancer 138, 171–181 (2016).
24. Balermpas, P. et al. Tumour-infiltrating lymphocytes predict response to definitive chemoradiotherapy in head and neck cancer. Br
J Cancer 110, 501–509 (2014).

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 14

www.nature.com/scientificreports/

25. Kim, B. H. et al. Lysyl-tRNA synthetase (KRS) expression in gastric carcinoma and tumor-associated inflammation. Ann Surg Oncol
21, 2020–2027 (2014).
26. Ang, K. K. et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363, 24–35 (2010).
27. Mirghani, H. et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Mod. Pathol. 28,
1518–1527 (2015).
28. Osman, A., Hitzler, W. E., Ameur, A. & Provost, P. Differential Expression Analysis by RNA-Seq Reveals Perturbations in the Platelet
mRNA Transcriptome Triggered by Pathogen Reduction Systems. PLoS One 10, e0133070 (2015).
29. Barry, M. & Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nat. Rev. Immunol. 2, 401–409 (2002).
30. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C. & Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.
Nat. Rev. Cancer 12, 298–306 (2012).
31. Droeser, R. A. et al. Clinical impact of programmed cell death ligand 1 expression in colorectal cancer. Eur. J. Cancer 49, 2233–2242
(2013).
32. Parsa, A. T. et al. Loss of tumor suppressor PTEN function increases B7-H1 expression and immunoresistance in glioma. Nat. Med.
13, 84–88 (2007).
33. Atefi, M. et al. Effects of MAPK and PI3K pathways on PD-L1 expression in melanoma. Clin. Cancer Res. 20, 3446–3457 (2014).
34. Palazon, A. et al. The HIF-1alpha hypoxia response in tumor-infiltrating T lymphocytes induces functional CD137 (4-1BB) for
immunotherapy. Cancer Discov 2, 608–623 (2012).
35. Noman, M. Z. et al. PD-L1 is a novel direct target of HIF-1alpha, and its blockade under hypoxia enhanced MDSC-mediated T cell
activation. J. Exp. Med. 211, 781–790 (2014).
36. Badoual, C. et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck
cancer. Cancer Res 73, 128–138 (2013).
37. Thompson, R. H. et al. PD-1 is expressed by tumor-infiltrating immune cells and is associated with poor outcome for patients with
renal cell carcinoma. Clin. Cancer Res. 13, 1757–1761 (2007).
38. Hsu, M. C. et al. Increase of programmed death-1-expressing intratumoral CD8 T cells predicts a poor prognosis for nasopharyngeal
carcinoma. Mod. Pathol. 23, 1393–1403 (2010).
39. Muenst, S., Hoeller, S., Dirnhofer, S. & Tzankov, A. Increased programmed death-1+ tumor-infiltrating lymphocytes in classical
Hodgkin lymphoma substantiate reduced overall survival. Hum. Pathol. 40, 1715–1722 (2009).
40. Badoual, C. et al. Prognostic value of tumor-infiltrating CD4+T-cell subpopulations in head and neck cancers. Clin. Cancer Res. 12,
465–472 (2006).
41. Miyara, M. et al. Sialyl Lewis x (CD15s) identifies highly differentiated and most suppressive FOXP3high regulatory T cells in
humans. Proc Natl Acad Sci USA 112, 7225–7230 (2015).

Acknowledgements
™
The authors would like to thank Macrogen for assistance with Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene
Expression Kit and Dong-Su Jang, a medical illustrator in the medical research support section of Yonsei University
College of Medicine, Seoul, Korea, for assistance with the illustrations. This study was supported in part by a grant
from the Korea Health Technology R&D Project, Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (HI12C1440,
B. C. Cho), a Faculty Research Grant from Yonsei University College of Medicine (6–2012–0124, H.R. Kim),
and a grant of the Health Fellowship Foundation (H.R. Kim).
Author Contributions
Conception and design: Hye Ryun Kim, Sang-Jun Ha, Min Hee Hong, Su Jin Heo, Yoon Woo Koh, Eun Chang
Choi, Eun Kyung Kim, Kyoung Ho Pyo, Inkyung Jung, Byoung Chul Cho and Sun Och Yoon. Financial support:
Byoung Chul Cho, Sun Och Yoon, and Hye Ryun Kim. Administrative support: Byoung Chul Cho, Sun Och Yoon,
and Hye Ryun Kim. Provision of study materials or patients: Hye Ryun Kim, Min Hee Hong, Su Jin Heo, Yoon
Woo Koh, Eun Chang Choi, Eun Kyung Kim, Inkyung Jung, Byoung Chul Cho and Sun Och Yoon. Collection and
assembly of data: Hye Ryun Kim, Min Hee Hong, Su Jin Heo, Yoon Woo Koh, Eun Chang Choi, Eun Kyung Kim,
Kyoung Ho Pyo, Inkyung Jung, Daekwan Seo, Jaewoo Choi, Byoung Chul Cho and Sun Och Yoon. Data analysis
and interpretation: Hye Ryun Kim, Sang-Jun Ha, Min Hee Hong, Su Jin Heo, Yoon Woo Koh, Eun Chang Choi,
Eun Kyung Kim, Inkyung Jung, Byoung Chul Cho and Sun Och Yoon. Manuscript writing: All authors Final
approval of manuscript: All authors.
Additional Information
Supplementary information accompanies this paper at http://www.nature.com/srep
Competing financial interests: The authors declare no competing financial interests.
How to cite this article: Kim, H. R. et al. PD-L1 expression on immune cells, but not on tumor cells, is a
favorable prognostic factor for head and neck cancer patients. Sci. Rep. 6, 36956; doi: 10.1038/srep36956 (2016).
Publisher's note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and
institutional affiliations.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License. The images
or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license,
unless indicated otherwise in the credit line; if the material is not included under the Creative Commons license,
users will need to obtain permission from the license holder to reproduce the material. To view a copy of this
license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

© The Author(s) 2016

Scientific RepoRts | 6:36956 | DOI: 10.1038/srep36956 15