Kegiatan Praktikum IV

MONOLAYER CELL CULTURE

Hari : Rabu
Tanggal : 09 OKTOBER 2019

Nama : Wildan Mukholladun

NIM : B1J012036
Rombongan : IV
Kelompok :1

LABORATORIUM KULTUR JARINGAN HEWAN

FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2019

Halaman 1 dari 11
 I. PENDAHULUAN
A. Tujuan

Tujuan dari praktikum Kultur sel monolayer adalah membekali mahasiswa

dengan keterampilan melakukan tahapan pelaksanaan kultur primer dengan metode
teknik kultur monolayer.

B. Manfaat
Manfaat praktikum Kultur sel monolayer yaitu mahasiswa dapat melakukan
kultur monolayer dengan baik dan benar

II. MATERI DAN PROSEDUR KERJA

A. Materi

Alat yang digunakan dalam praktikum Kultur sel monolayer adalah alat
bedah, mikroskop, 24 well plate culture dish, pipet transfer, miktopipet beserta
pipette tip, tabung valcon 50 ml, laminar flow, cawan petri, sterilizator, incubator,
lampu UV, lampu spirtus, gloves.
Bahan yang digunakan dalam praktikum Kultur sel monolayer adalah ikan
nilem betina, medium kultur pemeliharaan (medium DMEM, serum darah ikan,
glutamin, dan antibiotik).

Halaman 2 dari 11
B. Prosedur Kerja
Metode yang dilakukan pada praktikum kali ini adalah:
A. Proses kultur
1. Ruang kultur dan peralatan yang akan digunakan di sterilisasikan.
2. Bahan dan alat yang akan digunakan dipersiapkan.
3. Culture medium 57 ml dibuat dengan mencampurkan sebanyak 1140 µl medium
DMEM, 150 µl serum, 75 µl antibiotik, dan 75 µl glutamin dengan mikropipet
lalu diresuspensikan.
4. Sel hasil disosiasi dikeluarkan dari refrigerator.
5. Suspensi sel yang berada pada cover glass dimasukkan ke dalam well plate yang
telah berisi berisi medium kultur.
6. Tutup well plate dan beri label dengan keterangan kelompok dan rombongan.
7. Bersihkan semua peralatan dan area kerja yang telah digunakan.
8. Kultur sel diinkubasi dalam inkubator selama 3 hari pada suhu 28oC.

B. Evaluasi hasil kultur

1. Dilihat warna mediumnya.
2. Medium pada well plate dibuang.
3. 1,5 ml PBS ditambahkan pada well plate.
4. Setelah 30 detik, PBS dibuang lalu cover glass dikering anginkan.
5. 1,5 ml methanol ditambahkan pada well plate.
6. Setelah 3 menit methanol dibuang dan cover glass dikering anginkan.
7. Giemsa ditetesi secukupnya, ditunggu selama 5 menit.
8. Cover glass dibilas dengan dengan akuades secara perlahan.
9. Cover glass diletakkan di atas object glass lalu diamati dibawah mikroskop
pertumbuhan selnya.

Halaman 3 dari 11
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Tabel 3.1. Data Hasil Praktikum Kultur Sel Monolayer

Pengamatan ke Temperature Warna Perlekatan Distribusi sel/

inkubator medium sel confluensy
1 29o C Magenta Belum Belum
melekat konfluen
2 29o C Magenta Belum Belum
melekat konfluen
3 29o C Magenta Belum Belum
melekat konfluen
o
4 29 C Magenta Melekat Konfluen
5 29o C Magenta Melekat Konfluen
6 29o C Magenta Melekat Konfluen
7 29o C Magenta Melekat Over konfluen

Perhitungan
Kelompok 2 rombongan 4: - Jumlah sel hidup: 0
- Jumlah sel mati: 0
Densitas = rata-rata 5 kotak sedang x 2,5 x 105
= 0 x 2,5 x 105
=0
Viabilitas sel = ∑ Sel hidup x 100%
∑ Sel total
= 0 x 100%
0
=0%
PDL = 3,22 (log Xe – log Xb) + S
= 3,22 (log 0 – log 1 x 106) + 0
= 3,22 (0 – 6) + 0
= 3,22 (-6) = -19,22
PDT = T x ln 2
Ln Xe
Xb
= 168 x 0,693 = 0
0
Gambar 1. Foto pengamatan hari ke 1

Halaman 4 dari 11
Gambar 2. Foto pengamatan hari terakhir

Gambar 3. Foto lapang pandang hemocytometer

Gambar 4. Sell yang telah di Fiksasi

Halaman 5 dari 11
B. Pembahasan

Halaman 6 dari 11
 Kultur jaringan atau kultur sel primer dapat diperoleh dengan cara
menumbuhkan sel dari potongan jaringan atau fragmen jaringan disebut eksplan
primer, atau menggunakan enzim atau diperoleh secara mekanik. Kultur sel
primer mempunyai sifat dapat bertahan hidup setelah dilakukan disagregasi,
mempunyai sifat adhesif yaitu mampu melekat pada substrat. Beberapa segi
fungsi khusus sel dapat diekspresikan lebih kuat dan jelas pada kultur sel primer,
terutama setelah kultur itu menjadi konfluen. Pada fase ini kultur sel akan
menunjukkan morfologi yang hampir serupa dengan jaringan asalnya (Trenggono,
2009). Sedangkan Kultur sel primer yaitu kultur sel yang diperoleh secara
langsung setelah sel/jaringan/organ diangkat dari suatu organisme. Ada dua tipe
kultur, yaitu kultur sel monolayer dan kultur sel suspensi. Kultur sel monolayer
yaitu sel yang membentuk suatu lembaran serta tumbuh dan melekat pada substrat
(Ma’at, 2011).Metode kultur monolayer digunakan jika sel yang akan dikultur
merupakan sel yang melekat, sedangkan metode kultur suspensi digunakan untuk
sel yang tidak melekat. (Aljauhai et al., 2013).
Berdasarkan praktikum dan pengamatan didapatkan hasil kultur
monolayer dari hepotopankreas ikan nilem yaitu didapatkan warna medium
setelah masa inkubasi 3 hari menunjukkan warna magenta yang menunjukan
bahwa sell tidak mengalami kontaminasi. Sedangkan untuk karakteristik selnya
yaitu bentuknya polygonal dan saling berlekatan. Organ yang digunakan dalam
praktikum kali ini adalah bagian dari hepatopankreas ikan, bagian ini dipilih
karena memiliki struktur jaringan yang lunak dan mudah untuk dilakukan proses
disosiasi jaringan, menentukan kepadatan sel dan viabilitas sel (Doyle, 1998).
Kepadatan sel yang tumbuh di permukaan substrat. Pertumbuhan sel dalam kultur
dapat dilihat dari viabilitas sel, konfluen sel dan normal tidaknya sel. Dari hasil
yang di dapat tidak ditemukan sell pada saat di amati di mikroskop menggunakan
hemocytometer hal ini dapat disebabkan oleh sell yang masih berlekatan tidak
terpisah sehingga tidak bisa menentukan viabilitas sell. Viabilitas sel dapat
didefinisikan sebagai jumlah sel-sel sehat dalam sampel. Pengujian viabilitas sel
sering berguna ketika sel tidak membelah (seperti sel primer) yang terisolasi dan
dipelihara dalam kultur untuk menentukan kondisi kultur optimal untuk populasi
sel (Freshney, 2005).

Halaman 7 dari 11
 Viabilitas sel merupakan perbandingan jumlah sel yang hidup dan sel
yang mati (Wulandari, 2003). Viabilitas sel ditentukan dari kemampuan sel untuk
hidup dan menjalankan metabolismenya dimana ini merupakan faktor yang
mempengaruhi keberhasilan kultur sel. Metode yang paling mudah untuk
menentukan jumlah sel hidup adalah penghitungan sel dengan menggunakan
hemositometer dan menggunakan pewarna tryphan blue 0,4% karena tryphan
blue tidak mengubah integritas membran plasma dan memperlambat proses
kematian sel. Tryphan blue juga memperkecil jumlah sel dan memfasilitasi
identifikasi sel yang akan dilihat dengan mikroskop (Freshney,2005).
Praktikum kali ini menggunakan 2 macam medium, yaitu handling
medium dan Culture medium. Culture medium merupakan medium yang tepat
untuk menjaga dan menumbuhkan kultur karena setiap 1ml Culture medium
mengandung medium DMEM 800 µl yang berperan sebagai medium penyangga
dan mengandung nutrisi, antibiotik 50 µl yang berfungsi untuk mencegah
kontaminan dari bakteri , 100 µl serum yang berfungsi sebagai sumber nutrisi, dan
50 µl glutamin yang mengandung growth factor yang berfungsi untuk
meningkatkan pertumbuhan. Handling medium merupakan salah satu medium
yang memiliki fungsi untuk menjaga dan mempertahankan sel agar tidak
mengalami dehidrasi. Setiap 1 ml handling medium terdiri atas 950 ml medium
DMEM ditambah 50 ml antibiotic yang berfungsi untuk mencegah kontaminan
dari bakteri (Ma’at, 2011).
Faktor eksogen yang bisa menyebabkan kerusakan pada sel diantaranya
adalah pengaruh dari luar seperti Ph, suhu, O2 dan CO2, area kerja yang tidak
steril, terlalu banyak pergerakan yang tidak perlu, infeksi bakteri, jamur dan virus.
Faktor lain yang juga mempengaruhi kualitas sel adalah substrat dan
lingkungannya, keadaan fisiokimia dari medium, jenis substrat, pemilihan
medium yang sesuai dengan kebutuhan sel, keadaan fase gas dan temperature
pada waktu inkubasi. Kultur sel seharusnya dipelihara pada temperature yang
sesuai dengan individu asal sel, Poikiloterm (18-25°C) dan Homeoterm (36-37°C)
(Trenggono, 2009).
Kontaminasi merupakan permasalahan mendasar yang sering terjadi pada
kultur in vitro. Apabila kultur medium telah mengalami kontaminasi maka segera

Halaman 8 dari 11
ganti medium secara total. Namun kontaminasi dapat dicegah, berikut adalah
pencegahan sel kultur yang terkontaminasi:
• Minimalkan kontak dengan udara
• Minimalkan trafik
• Pelihara kebersihan ruang kerja
• Bersihkan meja kerja dengan etanol 70%
• Minimalkan area kerja
• Irradiasi ruangan dengan sinar UV sebelum bekerja
• Hindarkan larutan dari kontaminasi dengan udara
• Hindarkan kontaminasi secara manual
• Hindari membuka botol secara berulang-ulang
• Hindari akumulasi cairan pada leher botol (Barahima, 2011).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

Halaman 9 dari 11
A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat ditarik kesimpulan sebagai

berikut:
1. Tahapan pelaksanaan kultur primer dengan teknik kultur sel monolayer yaitu
persiapan alat dan bahan, persiapan sumber jaringan, pengambilan jaringan,
pembuatan suspense sel, penanaman kultur primer, pemeliharaan kultur, dan
subkultur.
B. Saran

Saran yang dapat diberikan terkait praktikum kali ini adalah sebaiknya
praktikan lebih memperhatikan dan melaksanakan teknis aseptisitas.

Halaman 10 dari 11
 DAFTAR REFERENSI

Aljauhi, M.M., Asri, M.T & Trimulyono, G. 2013. Media Alternatif untuk
Pertumbuhan Sel Midgut Spodoptera litura. LenteraBio, 2 (2): 161-165.

Barahima, A. 2011. Prinsip Dasar Teknik Kultur Jaringan. Alfabeta: Bandung.

Doyle, A. & Griffiths, J. B. 1998. Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in
Biotechnology. John Wiley & Sons Ltd: West Sussex.

Freshney, R. I. 2005. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th ed.
John Wiley & Sons Ltd: New York.

Ma’at, Suprapto. 2011. Teknik Dasar Kultur Sel. Airlangga University Press:
Surabaya.

Trenggono, B.S. 2009. Metode Dasar Kultur Jaringan Hewan. Universitas Triskti:
Jakarta.

Wulandari, W. 2003. Perbedaan Konfluensitas dan Viabilitas sel Kultur Primer

Fibroblas dari Jaringan Daun Telinga Rusa Bawean (Axis Kuhlil) pada
Medium TCM 199 dan MEM. UNAIR: Surabaya.

Halaman 11 dari 11