MODUL 3

“ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN KONFIRMASI MIKROBA”

I. Tujuan Percobaan
1. Memahami prinsip isolasi, identifikasi, dan konfirmasi mikroba
2. Mengamati pertumbuhan bakteri tertentu yang diinokulasi pada media
MCA, VJA, CA, Simmon sitrat, dan TSIA.
3. Mengamati perubahan yang terjadi pada media MCA, VJA, CA, Simmon
sitrat, dan TSIA.

II. Alat dan Bahan

Alat Bahan
 Bunsen  Media Mac Conkey Agar
(MCA), Vogel Jonson Agar
(VJA), Cetrimide Agar (CA),
Simmon sitrat, dan Triple Sugar
Iron Agar (TSIA).

 Inkubator 37 ℃  Potasium telurite

 Ose Bundar dan Lurus  Suspensi bakteri ; S. Aureus, P.

Aeruginosa, E.coli

 Papan pembentuk agar miring

 Pipet ukur 5 dan 10 ml

 Rak tabung reaksi

 Tabung reaksi steril

III. Teori Dasar
Prinsip dari isolasi, identifikasi dan konfirmasi mikroba adalah memisahkan
satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-
macam mikroba. Identifikasi mikroba yaitu untuk mengetahui sifat-sifat morfologi
bakteri, maka bakteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup atau mati.
Pemeriksaan morfologi bakteri ini perlu, untuk mengenal nama bakteri.
Disamping itu juga perlu pengenalan sifat-sifat fisiologisnya bahkan sifat-sifat
fisiologis ini kebanyakan merupakan faktor terentu dalam mengenal nama spesies
suatu bakteri. Sedangkan konfirmasi jenis bakteri yaitu tindakan untuk
mengetahui apakah suatu bakteri tertentu benar tumbuh pada media spesifik yang
digunakan. Terutama jika identifikasi menggunakan media masih
meragukan/belum memuaskan. (Sutedjo,1996).
Media spesifik yaitu media yang digunakan unutk mendiagnosis atau
menganalisis metabolisme suatu mikroba khusus. Media spesifik ini beraneka
ragam komposisinya tergantung nutrisi apa yang diperlukan oleh bakteri tersebut.
Untuk menelaah bakteri di dalam laboratorium , pertama- tama kita harus dapat
menumbuhkan bakteri tersebut di dalam suatu biakan murni. Untuk
melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis nutrient yang disyartakan oleh
bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang mana dapat menyebabkan kondisi
yang optimum bagi pertumbuhannya tersbut (Pelczar, 1986).
Pada umumnya media yang digunakan untuk membiakkan mikroba
mengandung air, sumber energi (protein dan karbohidrat), zat hara (sumber
karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan hidrogen), serta faktor penunjang
pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin). Suatu media yang memenuhi
kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan melakukan aktivitasnya secara
normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroba tertentu. Setiap media
spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu yang dapat mendukung
pertumbuhan mikroba tertentu tetapi menghambat pertumbuhan jenis mikroba
lainnya. Sebagai contoh Media MCA ( Mac Conkey Agar) mengandung zat warna
yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram Positif, sedangkan bakteri
Gram Negatif tetap tumbuh. ( suriawirnia, 1995 ).
 Salah satu komposisi dari media spesifik yang sering digunakan yaitu:
 Mac Conkey Agar ( Merah) : Lactose , Bile Salts, Agar , Crystal Violet,
Indikator pH, Pepton.
Laktose disini digunakan untuk membedakan bakteri yang dapat
memfermentasikan latosa atau tidak dan satu-satunya sumber karbohidrat bagi
basil, gram-negatif yang menghasilkan laktosa ferments merah tua menjadi merah
muda koloni.
Kemudian adanya kristal violet yang dapat menghambat pertumbuhan gram
positif dan menumbuhkan bakteri gram negatif. Dan perubahan warna media
berasal dari indikator pH yang akan berubah menjadi kuning (bersifat asam).
(Pelczar, 1986)
 Vogel Jonhson Agar ( Merah) : Pepton, Ragi, Manitol, Phenol merah, Kalium
tellurite, Litium klorida, Agar.
Mannitol yang digunakan untuk membedakan bakteri yang memfermentasikan
mannitol dan tidak. Kemudian adanya lithium klorida untuk menghambat bakteri
selain E. Coli dan kalium tellurite yang mewarnai koloni menjadi hitam. (Pelczar,
1986)
 Cetrimide Agar (Putih) : Gelatin, Gliserol, Cetrimide, MgCl, Kalium, Agar.
Cetrimide pada media ini berfungsi untuk menghambat bakteri lain karena akan
terjadi pecahan sel pada bakteri selain pseudomonas aeruginosa. Media ini selektif
terhadap psedomonas aeruginosa. (Pelczar, 1986)
 Simmons sitrat (Hijau) : Sitrat, Bromtimol blue, media SI, ion amoniak, ion
anorganik, Agar.
Media ini ditujukkan untuk mengetahui bakteri mana yang dapat menggunakan
sitrat sebagai sumber karbonnya. Bromtimol biru digunakan untuk mengetahui
perubahan warna media dari hijau menjadi biru yang menandakan menghasilkan
basa. (Pelczar, 1986)
 Media Triple Sugar Iron Agar (Orange) : Karbohidrat(glukosa, sukrosa,
laktosa), FeSO4 , Casein, Natrium klorida, Fenol merah, Agar.
Karbohidrat yang digunakan 3 jenis untuk membedakan bakteri mana yang dapat
menfermentasikan glukosa, sukrosa, laktosa. FeSO4 untuk menunjukkan adanya
H2S endapan hitam. Media ini dapat diusulkan untuk konfirmasi Salmonella dan
memilahkan dari Pseudomonas yang tumbuh pada media lain BSA dan BGA.
Terjadinya fermentasi dekstrosa oleh Salmonella akan menurunkan pH menjadi
asam. Kondisi ini akan menyebabkan perubahan phenol red (media merah)
menjadi kuning. Sedangkan Pseudomonas karena tidak mampu memfermentasi
dekstrosa, maka media akan tetap berwarna merah. Dengan demikian media ini
dapat dengan mudah memilah Salmonella dari Pseudomonas. (Pelczar, 1986)
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu
substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan
kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa
mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang
hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti
gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat
kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks
lainnya (Volk, dan Wheeler,1993).
IV. Prosedur Kerja

Dibuatkan media MCA, VJA, dan CA dalam bentuk plat agar, sedangkan
media Simmon sitrat dan TSIA dalam bentuk agar miring.

Diinokulasikan masing-masing suspensi bakteri pada media MCA, VJA,

CA, Simmon sitrat, dan TSIA.

Dicatat dan didukomentasikan warna masing-masing media setelah

diinokulasi dengan bakteri.

Diinkubasikan seluruh kultur bakteri pada inkubator 37 ℃ selama 2 hari.

Dilakukan pengamatan selama 2 hari dan pengamatan dibuat dalam bentuk

tabel yang mencakup keterangan:
- Waktu dan pengamatan ( waktu/ warna media/ warna koloni)
- Warna media ( Sebelum dan setelah diinokulasi)
Warna koloni ( Setelah diinokulasi dan adanya retakan pada media.
V. Data Pengamatan dan Perhitungan
5.1. Data pengamatan
5.2. Perhitungan
a) Mac Conkey Agar
250𝑚𝐿
MCA = X 50 g = 12,5 gram + 10% = 1,25 gram
1000𝑚𝐿
= 12,5 g + 1,25 g = 13,75 gram
Aquadest = 250 X 10% = 25 mL
= 250 mL + 25 mL = 275 mL
b) Vogel Jonson Agar
250𝑚𝐿
VJA = X 500 g = 15,432 gram + 10% = 1,5432 gram
8100𝑚𝐿
= 15,432 g + 1,5432 g = 16,9752 gram
Aquadest = 250 X 10% = 25 mL
= 250 mL + 25 mL = 275 mL
c) Cetrimide Agar
250𝑚𝐿
CA = X 500 g = 11,363 gram + 10% = 1,1363 gram
11000𝑚𝐿
= 11,363 g + 1,1363 g = 12,4993 gram
Aquadest = 250 X 10% = 25 mL
= 250 mL + 25 mL = 275 mL
d) Summon Sitrat
125𝑚𝐿
SS = X 22,5 g = 2,8125 gram + 10% = 0,28125 gram
1000𝑚𝐿
= 2,8125 + 0,28125 = 3,09375 gram
Aquadest = 125 X 10% = 12,5 mL
= 125 mL + 12,5 mL = 137,5 mL
e) Triple Sugar Iron Agar
125𝑚𝐿
MCA = X 65 g = 8,125 gram + 10% = 0,8125 gram
1000𝑚𝐿
= 8,125 g + 0,8125 g = 8,9375 gram
Aquadest = 125 X 10% = 12,5 mL
= 125 mL + 12,5 mL = 137,5 mL
VI. Pembahasan
Isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba
lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat
dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan
membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Jika sel-sel tersebut
tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel
atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang
terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya (Dwidjoseputro, D. 1994).
Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup
dan melakukan aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi
jenis mikroba tertentu. Setiap media spesifik memiliki kandungan senyawa
tertentu yang dapat mendukung pertumbuhan mikroba tertentu tetapi menghambat
pertumbuhan jenis mikroba lainnya. Media yang digunakan pada praktikum ini
yaitu MCA (Mac Conkey Agar), Vogel Johnson Agar(VJA), Cetrimide Agar
(CA), Simmon sitrat dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA).

1. Media Mac Conkey Agar Warna media merah maroon

Bakteri Staphylococcus aureus pada media MCA yang diamati pada hari rabu
( 6/ 12/ 2017), warna media merah maroon, koloni berwarna pink. Sedangkan
pengamatan yang dilakukan pada hari kamis (7/12/2017) media berwarna merah
keorangean, adanya koloni berwarna pink, tidak ada retakan. Bakteri S. Aureus
merupakan bakteri gram positif yang akan terhambat pertumbuhannya pada media
MCA karena pada media MCA mengandung garam empedu dan kristal ungu yang
akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme gram positif, maka pada media
ini bakteri S. Aureus menghasilkan koloni yang berwarna pink karena S.Aureus
tidak dapat memfermentasikan laktosa.
Bakteri E. Coli pada pada media MCA yang diamati pada hari rabu
(6/12/2017), warna media menjadi lebih muda, koloni berwarna pink, tidak ada
retakan, ada gelembung-gelembung dipingirnya. Sedangkan pengamatan yang
dilakukan pada hari kamis (7/12/017) warna media pink muda kekuningan, koloni
berwarna merah, di tepi terdapat glembung gelembung, tidak ada retakan. Bakteri
E. Coli merupakan bakteri gram negatif yang pertumbuhannya baik pada media
MCA karena pada media MCA mengandung kristal ungu yang akan menghambat
pertumbuhan mikroorganisme gram positif, dan mendukung pertumbuhan gram
negatif. Kemampuan E. coli memfermentasi laktosa menyebabkan penurunan pH,
sehingga mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah koloni menjadi
merah bata dan bile/ empedu diendapkan. MCA ini mengandung laktosa dan
indikator pH untuk mendeteksi produksi asam.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media MCA yang diamati pada
hari rabu (6/12/2017), Media berwarna merah keorangean, koloni berwarna pink,
tidak ada retakan. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis
(7/12/2017) media tetap berwarna orange, ada koloni berwarna pink, tidak ada
retakan. Bakteri Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif yang
pertumbuhannya baik pada media MCA karena pada media MCA mengandung
kristal ungu yang akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme gram positif,
dan mendukung pertumbuhan gram negatif. Namun P. Aeruginosa tidak
menfermentasi laktosa.

2. Media Vogel Jonhson Agar warna media merah

Bakteri Staphylococcus aureus pada media VJA yang diamati pada hari
rabu (6/12/2017) warna media merah kecoklatan, ada koloni berwarna jingga
kuning, tidak ada retakan. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis
(7/12/2017) warna media menjadi kuning, ada koloni berwarna putih kekuningan .
Vogel Johnson Agar Medium mengandung mannitol, tellurite dan lithium chloride
yang berperan untuk mengisolasi bakteri yang bersifat koagulase positif, karena
semua yang bersifat koagulase positif akan tumbuh pada media ini. Media di
sekitar koloni akan berubah menjadi kuning akibat fermentasi mannitol.
Koagulase merupakan enzim yang diproduksi Staphylococcus aureus yang
mengubah fibrinogen menjadi plasma darah fibrin yang merangkai kembali pada
koagulasi plasma darah. Ketika koagulase dihasilkan oleh suatu organisme
patogen, maka akan dihasilkan formasi acak fibrin yang berfungsi untuk
melindungi bakteri dari mekanisme prtahanan tubuh.
 Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media VJA yang diamati pada hari
rabu (6/12/2017) Media berwarna merah muda, koloni putih kemerahan, tidak ada
retakan. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis (7/12/2017)
Media berwarna pink pekat, koloni berwarna putih, tidak ada retakan. Yang
membedakan dengan Staphylococcus aureus adalah perubahan warna media, bila
Staphylococcus aureus berubah menjadi kuning karena menfermentasikan
mannitol, tapi Pseudomonas aeruginosa berubah menjadi pink pekat itu karena
Pseudomonas aeruginosa tidak memfermentasikan mannitol. Adanya lithium
chloride: sangat bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain
termasuk E. coli. Namun demikian media ini kurang mampu memilah S. aureus
karena semua koagulase positif dapat tumbuh termasuk Pseudomonas aeruginosa.
Bakteri E. Coli pada pada media VJA yang diamati pada hari rabu
(6/12/2017), Media berwarna merah keorangen, koloni berwarna jingga, tidak ada
retakan. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis (7/12/2017)
media berubah warna mejadi warna kunimg, koloni ada berwarna jingga, tidak
ada retakan. . Sedangkan perubahan warna yang terjadi pada media disebabkan
oleh asam yang dihasilkan pada metabolisme bakteri atau akibat fermentasi
manitol.

3. Cetrimide Agar warna media bening

Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media CA yang diamati pada hari
rabu ( 6/12/2017) warna media bening, ada koloni berwarna bening agak kuning,
tidak ada retakan. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis
(7/12/2017) Media berwarna bening, koloni berwarna putih, tidak ada retakan.
Karena koloni yang dihasilka berwarna putih, maka Pseudomonas aeruginosa
menghassilkan pigmen pyoferdin. Ini disebabkan Cetrimide Agar Medium
biasanya digunakan untuk isolasi Pseudomonas. Kandungan cetrimide yang
merupakan quarternary ammonium merupakan senyawa yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri lain, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur di dalam
sel, namun tidak terjadi pada Pseudomonas.
 Bakteri E. Coli pada pada media CA yang diamati pada hari rabu
(6/12/2017), Media tetap berwarna bening, ada koloni berwarna bening bintik
bintik putih, tidak ada retakan. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari
kamis (7/12/2011) Media tetap, ada koloni berwarna putih, tidak ada retakan. Ini
menunjukkan bahwa E.coli dapat tumbuh sdikit pada media Cetrimide Agar,
namun tidak menghasilkan pigmen pyosianin( biru) atau pyoferdin(hijau) karena
hanya timbul koloni putih.
Bakteri Staphylococcus aureus pada media CA yang diamati pada hari
rabu (6/12/2017), Media tetap, koloni putih kekuningan, tidak ada retakan.
Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis (7/12/2017) tetap tidak
berubah yaitu media tetap, koloni tidak ada, tidak ada retakan. Ini menandakan
bahwa bakteri gram positif tidak dapat tumbuh di media Cetrimide Agar karena
media ini selektif terhadap bakteri gram positif dan gram negatif. Pada media
cetrimide konvensional beberapa bakteri dapat tumbuh seperti Klebsiella, Proteus
dan Providencia. Untuk menghambat pertumbuhan mereka dapat ditambahkan
cetrimide.

4. Simmon Sitrat warna media hijau

Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media SS yang diamati pada hari
rabu (6/12/2017) Warna media biru, kecuali bagian dasar berwarna hijau, warna
koloni biru. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis (7/12/2017)
Media berwarna biru karena adanya koloni, tidak ada retakan. Ini menandakan
Pseudomonas aeruginosa positif terhadap media SS. Pembentukkan warna biru
pertama kali terdapat pada bagian atas media karena bakteri ini memerlukan
oksigen karena bakteri ini termasuk bakteri aerob obligate.
bakteri E. Coli pada pada media SS yang diamati pada hari rabu (6/12/2017),
Warna media hijau, koloni berwarna putih, tidak ada retakan. Sedangkan
pengamatan yang dilakukan pada hari kami (7/12/2017) Warna media hijau,
adanya koloni berwarna putih, tidak ada retakan. Ini menandakan E.coli pun
positif terhadap SS.
 Bakteri Staphylococcus aureus pada media SS yang diamati pada hari rabu
(6/12/2017), Media berwarna hijau, koloni berwarna bening, tidak ada retakan.
Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis (7/12/2017) Warna media
di bagian atas kuning, dasar hijau, ada koloni , tidak ada retakan. Ini mendakan
pula S. Aureus positif terhadap SS. karena dapat menggunakan sitrat sebagai
sumber karbon tunggal dan ion ammonium sebagai sumber nitrogen tunggal.
Simmon sitrat mengandung amonium dihidrogen fosfat, natrium klorida, natrium
sitrat. Magnesium sulfat, agar, bromtimol biru, aquades dan memiliki pH 6,9.
Media SS digunakan untuk menentukan apakah isolasi dari bakteri ada yang
mampu menggunakan sitrat sebagai karbohidrat

5. Media Triple Sugar Iron Agar warna media hitam

Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media TSIA yang diamati pada
hari rabu (6/12/2017) Warna media hitam kecklatan, ada koloni berwarna coklat,
tidak ada retakan. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis
(7/12/2017) Media berwarna coklat, tidak ada retakan. Ini menandakan
Pseudomonas aeruginosa positif terhadap media TSIA.
Kemudian bakteri E. Coli pada pada media TSIA yang diamati pada hari
rabu (6/12/2017), mdia berwarna hitam kecoklatan, ada koloni berwarna coklat.
Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis (7/12/2017) media
berwarna coklat. Ini menandakan E.coli pun positif terhadap TSIA.
 Dan Bakteri Staphylococcus aureus pada media TSIA yang diamati pada
hari rabu (6/12/2017), Warna media hitam kecoklatan, koloni berwarna coklat.
Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari kamis (7/12/2017) Warna media
coklat, ada koloni putih. Ini mendakan pula S. Aureus positif terhadap
TSIA.kuning (bersifat asam), tetapi menfermentasikan glukosa. Triple Sugar Iron
Agar medium, biasanya digunakan untuk konfirmasi pengujian E. coli dan dapat
digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif yang memfermentasi
dekstrosa/laktosa/sukrosa dan produksi H2S. TSIA mengandung 3 macam gula,
yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa, juga terdapat indikator fenol merah serta
FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan H2S (endapan hitam). Bila
mikroorganisme Pembentukan dari fermentasi H2 dan CO2 dpt dilihat dari
terangkatnya agar. Media ini dapat diusulkan untuk konfirmasi Salmonella dan
memilahkan dari Pseudomonas yang tumbuh pada media lain BSA dan BGA.
VII. Kesimpulan

 Isolasi mikroba merupakan upaya pembiakkan suatu jenis mikroba tertentu

yang diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media yang spesifik,
sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dan konfirmasi. Prinsip
dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan jenis
mikroba lainnya yang berasal dari campuran macam-macam mikroba.
 Identifikasi mikroba yaitu Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri,
maka bakteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup atau mati.
 konfirmasi mikroba yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan koloninya.
Konfirmasi jenis bakteri dapat menggunakan berbagai pewarnaan, reaksi
ensimatis atau reaksi biokimia, terutama jika identifikasi menggunakan
media masih meragukan/belum memuaskan.
Tabel pertumbuhan bakteri pada media spesifik :
Bakteri Media
MCA VJA CA SS TSIA
E. Coli + + - - +
S. Aureus + + - - +
P. + + + - +
Aeruginosa
Keterangan :
(+) Tumbuh bakteri
(-) Tidak tumbuh bakteri
VIII. Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Pelczar, Michael J, Jr dan E.C.S.Chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi
(Terjemahan). Jakarta : Universitas Indonesia.
Suriawirnia, U. 1995. P engantar B iologi Umum . Angkasa, Bandung.
Volk & Wheeler. 1993.M ikrobiologi dasar. Penerbit Erlangga, Jakarta.