LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PERCOBAAN 3
ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN KONFIRMASI MIKROBA

Disusun oleh:

Nama : Lulu Mumtaz (10060320152)

Dwi Oktariani (10060320153)
Aulia Nurul Rahim (10060320154)
Gishela Bellania (10060320155)
Citra Mufidah Adilah A (10060320156)
Vidya Sulistiawati D (10060320157)
Shift/Kelompok : E/2
Tanggal Percobaan : 08 Desember 2021
Tanngal Laporan : 14 Desember 2021
Nama Asisten : Rima Purnama, S.Farm.

LABORATORIUM FARMASI UNIT D

PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
2021 M / 1443 H
 I. TUJUAN PERCOBAAN
A. Tujuan Praktikum
Memahami prinsip isolasi, identifikasi, dan konfirmasi mikroba, serta
dapat melakukannya dengan baik.
B. Tujuan Percobaan
1. Mengamati pertumbuhan bakteri tertentu yang diinokulasi pada
media spesifik yang digunakan
2. Mengamati perubahan yang terjadi pada media spesifik yang
diinokulasi bakteri

II. TEORI DASAR

2.1 Definisi Isolasi Mikroba
Isolasi mikroba ialah memisahkan mikroba tersebut dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam
medium buatan. Isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan
menumbuhkan mikrobia pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk
pertumbuhannya. Memindahkan bakteri dari medium lama kedalam
medium yang baru diperlukan ketelitian dan pengsterilan alat-alat yang
digunakan, supaya dapat dihindari terjadinya kontaminasi. Pada
pemindahan bakteri dicawan petri setelah agar baru, maka cawan petri
tersebut harus dibalik, hal ini berfungsi untuk menghindari adanya tetesan
air yang mungkin melekat pada dinding tutup cawan petri (Lay, 1994).
2.2 Macam-macam Metode Isolasi Mikroba
1) Isolasi Tunggal
Merupakan metode isolasi dengan cara meneteskan bahan yang
mengandung mikroorganisme pada suatu kaca penutup dengan
menggunakan mikropipet, yang kemudian diteliti dibawah obyektif
mikroskop (Dwidjoseputro, 1994).
 2) Isolasi Gores
Merupakan metode isolasi dengan cara menggeser atau
menggoreskan ujung jarum ose yang telah mengandung mikroorganisme
dengan hati-hati di atas permukaan agar secara zig zag yang dimulai dari
dasar tabung menuju ke bagian atas tabung (Dwidjoseputro, 1994). Tujuan
utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni
bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat. Ada
beberapa teknik goresan, diantaranya adalah:
 Goresan T
 Goresan Kuadran
 Goresan Radian
 Goresan Sinambung (Nuniek, 2001)
3) Isolasi Tebar
Merupakan metode isolasi dengan cara menebarkan bahan yang
mengandung mikroorganisme pada permukaan atas tabung (Dwidjoseputro,
1994).
4) Isolasi Tuang
Merupakan metode isolasi dengan cara mengambil sedikit sampel
campuran bakteri yang telah diencerkan dan sampel tersebut kemudian
disebarkan didalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer
(Dwidjoseputro, 1994).
2.3 Faktor-faktor Yang Harus Diperhatikan Dalam Mengisolasi Mikroba
Beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam mengisolasi bakteri adalah
sebagai berikut:
1. Sifat dan jenis mikroorganisme
2. Habitat mikroorganisme
3. Medium pertumbuhan
4. Cara menginokulasi dan inkubasi
5. Cara mengidentifikasi bakteri
6. Cara pemeliharaannya (Dwidjoseputro, 1994)
 Proses identifikasi bakteri secara konvensional berdasarkan karakter
fenotip bakteri seperti pewarnaan Gram, morfologi koloni, dan aktivitas
enzim seringkali tidak bersifat statis dan dapat berubah seiring dengan
adanya evolusi. Kesalahan identifikasi seringkali terjadi dikarenakan
hadirnya karakteristik fenotip bakteri yang tidak biasa ataupun kurangnya
pengalaman dalam menginterpretasikan data karakter fenotip. Hal ini
menimbulkan hadirnya metode identifikasi secara molekuler menggunakan
gen 16S rRNA. Hal ini juga mengurangi prasangka penafsiran dan
menyingkirkan kebutuhan untuk kemungkinan "pretest" mengenai
klasifikasi mikroorganisme untuk pemeriksaan langsung dan pemilihan
database (Petti et al., 2005).
Proses identifikasi bakteri secara konvensional berdasarkan karakter
fenotip bakteri seperti pewarnaan Gram, morfologi koloni, dan aktivitas
enzim seringkali tidak bersifat statis dan dapat berubah seiring dengan
adanya evolusi. Kesalahan identifikasi seringkali terjadi dikarenakan
hadirnya karakteristik fenotip bakteri yang tidak biasa ataupun kurangnya
pengalaman dalam menginterpretasikan data karakter fenotip. Hal ini
menimbulkan hadirnya metode identifikasi
Konfirmasi mikroba yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan
koloninya. Konfirmasi jenis bakteri dapat menggunakan berbagai
pewarnaan, reaksi ensimatis atau reaksi biokimia, terutama jika identifikasi
menggunakan media masih meragukan atau belum memuaskan (Volk,
1993).
2.4 Media Umum, Media Spesifik, dan Media Diferensial
Media umum merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan
yang bertujuan untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum.
Contohnya pada Nutrient Agar, Nutrient Broth, Potato Dextose Agar (PDA)
untuk menstimulir pertumbuhan fungi. Media ini merupakan media yang
dapat ditumbuhi dengan mikroba yang berbeda, mikroba tersebut akan
tumbuh dengan ciri khusus sehingga dapat dibedakan. Contohnya media
Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Sulfit Indol Motility (SIM), dan lain-lain
(Pelczar, 1996).
Media ini merupakan media yang dapat menumbuhkan satu jenis
mikroba tetapi mikroba lainnya dihambat. Contohnya media Salmonella
Shigella Agar (SSA), Thiosulphate Citrate Bile Salt (TCBS), dan
sebagainya. Media selektif merupakan media yang ditambahkan
bahanbahan tertentu akan menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak
diinginkan yang ada dalam satu spesimen (Pelczar, 1996).
Media diferensial merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan
tertentu yang menyebabkan mikroba tumbuh memperlihatkan perubahan-
perubahan spesifik yang dapat dibedakan jenis lainnya (kingdom sama,
tetapi bentuk berbeda) (Pelczar, 1996).
Mac Conkey Agar (MCA) adalah salah satu jenis media yang
digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Mac Conkey Agar termasuk
dalam media selektif dan diferensial bagi mikroba. Jenis mikroba tertentu
akan membentuk koloni dengan ciri tertentu yang khas apabila ditumbuhkan
pada media ini. Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, garam
empedu, dan merah netral sebagai indikator warna. Media ini akan
menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dengan adanya garam
empedu yang akan membentuk kristal violet. Bakteri Gram negatif yang
tumbuh dapat dibedakan dalam kemampuannya memfermentasikan laktosa.
Koloni bakteri yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan
dapat dikelilingi oleh endapan garam empedu. Endapan ini disebabkan oleh
penguraian laktosa menjadi asam yang akan bereaksi dengan garam
empedu. Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat
patogen. Golongan bakteri ini tidak memperlihatkan perubahan pada media.
Beberapa contoh pertumbuhan koloni pada Mac Conkey Agar adalah
Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella,
Enterococcus, Staphylococcus (Lay, 1994).
Vogel Johnson Agar (VJA) mengandung mannitol, tellurite, dan
lithium klorida yang berperan untuk mengisolasi bakteri yang bersifat
koagulasi positif, karena semua yang bersifat koagulasi positif akan tumbuh
pada media ini. S. aureus mempunyai koloni hitam sebagai akibat
pengendapan hasil reduksi tellurite. Media di sekitar koloni akan berubah
menjadi kuning akibat fermentasi mannitol. Adanya lithium chloride:
sangat bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain termasuk
E. coli. Namun demikian media ini kurang mampu memilah S. aureus
karena semua koagulasi positif dapat tumbuh termasuk S. epidermidis dan
Proteus. Warna kuning disebabkan oleh fermentasi mannitol oleh
Staphylococcus aureus (Suwandi, 1999).
Cetrimide Agar (CA) biasanya digunakan untuk isolasi
Pseudomonas. Kandungan cetrimide yang merupakan quarternary
ammonium merupakan senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri lain, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur di dalam sel,
namun tidak terjadi pada Pseudomonas. Pada media cetrimide konvensional
beberapa bakteri dapat tumbuh seperti Klebsiella, Proteus dan Providencia.
Untuk menghambat pertumbuhan mereka dapat ditambahkan cetrimide.
Pada media ini, P. aeruginosa dapat dibantu dengan menggunakan media
Pseudomonas Selective Medium yang mengandung Nalidixi acid untuk
menghambat pertumbunan bakteri lain (Pelczar M. J., 1988).
Simmon sitrat atau nama lainnya Simmons Citrate Medium
mengandung amonium dihidrogen fosfat, natrium klorida, natrium sitrat.
magnesium sulfat, agar, bromtimol biru, aquades, dan memiliki pH 6,9
(Pelczar M. J., 1988).
Triple Sugar Iron Agar (TSIA) media ini berfungsi untuk
mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasikan karbohidrat
berdasarkan panjang rantai karbon. TSIA biasanya digunakan untuk
konfirmasi pengujian E. coli dan dapat digunakan untuk identifikasi bakteri
gram negatif yang memfermentasi dekstrosa, laktosa, sukrosa dan produksi
H2S (Pelczar M. J., 1988).
III. ALAT DAN BAHAN
Alat yang digunakan yaitu bunsen, cawan petri, inkubator, pipet
ukur steril, rak tabung reaksi dan tabung reaksi steril.
Bahan yang digunakan yaitu media MCA (Mac Conkey Agar), VJA
(Vogel Jonson Agar), CA (Cetrimide Agar), SS (Simon Sitrat) dan TSIA (
Triple Sugar Iron Agar).

IV. PROSEDUR PERCOBAAN

Sebelum pembuatan media, dilakukan beberapa prosedur aseptis
agar meja kerja yang digunakan terhindar dari kontaminasi mikroba yang
ada pada meja kerja dan yang ada di udara. Pertama, alkohol 70%
disemprotkan pada meja kerja kemudian di lap sampai kering. Kedua,
bunsen dinyalakan hingga diperoleh nyala api biru kemudian bunsen
dibiarkan menyala. Lalu tabung reaksi steril dan cawan petri diletakkan
diantara dua api bunsen.
Dibuat media MCA dalam bentuk plat agar, disiapkan cawan petri
steril dan pipet ukur steril. Dipipet 20 mL media dan dimasukkan ke cawan
petri steril kemudian dibiarkan memadat. Dilakukan hal yang sama untuk
kedua cawan petri lainnya.
Dibuat media VJA dalam bentuk plat agar, disiapkan cawan petri
steril dan pipet ukur steril. Dipipet 20 mL media dan dimasukkan ke cawan
petri steril kemudian dibiarkan memadat. Dilakukan hal yang sama untuk
kedua cawan petri lainnya.
Dibuat media CA dalam bentuk plat agar, disiapkan cawan petri
steril dan pipet ukur steril. Dipipet 20 mL media dan dimasukkan ke cawan
petri steril kemudian dibiarkan memadat. Dilakukan hal yang sama untuk
kedua cawan petri lainnya.
Media SS dibuat dalam bentuk agar miring, disiapkan tabung reaksi
steril dan pipet ukur steril. Dipipet 5 mL media dan dimasukkan ke tabung
 reaksi kemudian dibiarkan memadat dengan posisi miring. Dilakukan hal
yang sama untuk kedua tabung reaksi lainnya.
Media TSIA dibuat dalam bentuk agar miring, disiapkan tabung
reaksi steril dan pipet ukur steril. Dipipet 5 mL media dan dimasukkan ke
tabung reaksi kemudian dibiarkan memadat dengan posisi miring.
Dilakukan hal yang sama untuk kedua tabung reaksi lainnya.
Dicatat dan didokumentasikan warna masing-masing media
sebelum diinokulasi dengan bakteri. Diinokulasikan bakteri S. aureus, P.
aeruginosa dan E. coli pada media MCA, VJA, CA, SS dan TSIA dengan
menggunakan alat swab steril dan setiap pergantian bakteri dan media
digunakan alat swab yang baru. Dilakukan pra inkubasi selama 30 menit.
Diinkubasi seluruh kultur bakteri pada inkubator 37◦C selama 24 – 48 jam.
Dilakukan dan dicatat pengamatan waktu inokulasi dan pengamatan, warna
media sebelum dan sesudah inokulasi, warna koloni bakteri setelah
inokulasi dan adanya retakan pada media.
V. DATA PENGAMATAN
5.1 Dokumentasi Pengamatan Media Sebelum Inokulasi

5.2 Dokumentasi Pengamatan Media Selama 24 Jam

A. Mac Conkey Agar (MCA)
B. Vogel Johnson Agar (VJA)

C. Cetrimide Agar (CA)

D. Simmon Sitrat (SS)

E. Triple Sugar Iron Sugar (TSIA)

5.3 Dokumentasi Pengamatan Media Selama 48 Jam
A. Mac Conkey Agar (MCA)

B. Vogel Johnson Agar (VJA)

C. Cetrimide Agar (CA)

D. Simmon Sitrat ( SS)

 E. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

VI. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan isolasi, identifikasi,
dan konfirmasi mikroba. Tujuan dari dilakukannya percobaan ini adalah
mengamati pertumbuhan bakteri tertentu yang diinokulasi pada media
spesifik yang digunakan serta mengamati perubahan yang terjadi pada
media spesifik yang diinokulasi bakteri. Isolasi merupakan suatu proses
pemisahan bakteri dari media atau lingkungan asalnya, lalu
menumbuhkannya di media buatan untuk diperoleh biakan murni sehingga
dapat dilakukan identifikasi dan konfirmasi.
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat didalam
dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi
mikroba yaitu memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang
berasal dari campuran mikroba. Media yang digunakan pada isolasi bakteri
adalah media padat yaitu Mac Conkey Agar (MCA), Vogel Johnson Agar
(VJA), Cetrimide Agar (CA), Simmon Sitrat, dan Triple Sugar Iron Agar
(TSIA), selain itu juga pada percobaan dilakukan dengan 3 bakteri yaitu
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa.
Langkah yang dilakukan pertama – tama sebelum dilakukan
percobaan yaitu ruangan penanaman bakteri harus dalam keadaan bersih
dan dalam keadaan steril, alasan dilakukannya yaitu agar tidak terjadi
kesalahan dalam pengamatan di laboratorium. Semua pekerjaan pada
praktikum ini dilakukan dengan memperhatikan prosedur teknik aseptik,
tujuannya yaitu untuk mencegah terjadinya kontaminasi dengan biakan
yang mungkin bersifat pathogen. Teknik aseptis ini didefinisikan sebagai
prosedur kerja yang meminimaisir kontaminan mikroorganisme dan dapat
mengurangi resiko paparan terhadap petugas dan terhadap produk steril.
sehingga penting untuk memperhatikan teknik aseptis selama proses kerja
(Oetari, 2017). Kerja aseptik ini dilakukan dengan cara melakukan seluruh
kegiatan di antara dua nyala api bunsen dan di dekat nyala api bunsen juga
mulut erlenmeyer yang berisi media untuk isolasi dan ujung pipet yang
digunakan sebelum dan sesudah pengambilan media di flambir terlebih
dahulu pada nyala api bunsen. hal ini dilakukan untuk meminimalkan
kontaminasi serta melindungi praktikan dari mikroorganisme patogen
maupun non patogen. Difalmbirnya mulut erlenmeyer dan pipet ukur, juga
pengerjaan yang dilakukan di dekat api bunsen ini dilakukan dengan tujuan
untuk mengurangi terjadinya kontaminasi (Putri, 2017). Sebelum
melakukan pertumbuhan bakteri tertentu yang diinokulasi pada media
spesifik, alat dan bahan yang digunakan harus steril yang sebelumnya sudah
dilakukan proses sterilisasi terlebih dahulu dengan autoklaf, hal ini
bertujuan untuk menghancurkan semua mikroba hidup dan spora-spora nya
sehingga pada saat praktikum tidak terdapat kontaminasi.
Lalu dilakukan pembuatan media plat agar dan agar miring. Media
yang dibuat dengan metode plat agar adalah media Mac Conkey Agar
(MCA), Vogel Johnson Agar (VJA), dan Cetrimide Agar (CA). Dimulai
dari mempipet masing-masing media sebanyak 20 ml lalu dimasukkan
kedalam masing – masing 3 cawan petri sesuai dengan bakteri yang
digunakan, tujuan dimasukkan kedalam cawan petri karena media yang
digunakan berupa media padat. Sedangkan, media yang dapat dilakukan
dengan teknik agar miring yaitu Simmon sitrat (SS) dan Triple Sugar Iron
Agar (TSIA) dengan mempipet masing - masing media sebanyak 5 ml lalu
dimasukkan kedalam masing – masing 3 tabung reaksi sesuai dengan
bakteri yang digunakan , kemudian media dibiarkan memadat dalam
keadaan miring, hal ini bertujuan agar media cepat memadat karena
menggunakan media agar miring. Kemudian dilakukan pencatatan dan
dokumentasi warna masing – masing media sebelum diinokulasikan dengan
bakteri.
Prosedur selanjutnya, yaitu dilakukan inokulasi bakteri yaitu terdiri
dari Staphylococcus aureus yang termasuk kedalam bakteri gram positif
serta Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa yang merupakan
bakteri gram negatif. Dilakukan inokulasi bakteri pada media yang telah
memadat dengan cotton swab, alasan dilakukannya karena inokulasi yang
digunakan pada masing - masing media spesifik yaitu dengan cara
streak/gores. Kemudian dilakukan pra inkubasi, hal ini bertujuan untuk
tahap awal sebelum dilakukannya proses inkubasi. Selanjutnya, dilakukan
inkubasi pada inkubator dengan suhu 37oC selama 48 jam / 2 hari. Suhu
tersebut menyesuaikan kondisi pada suhu tubuh dan waktu yang digunakan
pada proses inkubasi merupakan waktu rata-rata perkembangbiakan bakteri
secara optimal.
Hasil inokulasi yang didapatkan pada bakteri Staphylococcus aureus
dengan menggunakan media Mac Conkey Agar (MCA) berdasarkan hasil
pengamatan diketahui bahwa sebelum dilakukan inokulasi media berwarna
merah. Pada inokulasi selama 24 jam dan 48 jam terjadi perubahan warna
menjadi merah sedikit ungu. Jika dilihat berdasarkan komposisi MCA
berdasarkan Farmakope Indonesia edisi VI terdiri dari pancreatic digest of
gelatin, peptones (meat and casein), laktosa monohidrat, natrium klorida,
bile salts, agar, merah netral, kristal violet, dan air. Sehingga hal ini terjadi
karena pada media MCA terdapat laktosa maka terjadi fermentasi laktosa
dan terjadi penurunan pH dan tidak terdapat koloni bakteri. Selain itu, hal
ini juga dikarenakan bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri
gram positif sedangkan media Mac Conkey Agar (MCA) dalam
komposisinya memiliki indikator zat warna yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif. Hasil yang didapatkan sesuai dengan
literatur yaitu menurut literatur (Downes, 2001), tidak terdapatnya susunan
sel bakteri Staphylococcus aureus karena media Mac Conkey Agar (MAC)
hanya direkomendasikan untuk mengkultur dan mengidentifikasi bakteri
Escherichia coli.
Hasil inokulasi yang didapatkan pada bakteri Staphylococcus aureus
dengan menggunakan media Vogel Johnson Agar (VJA) yaitu sebelum
dilakukan inokulasi media berwarna orange pekat. Pada inokulasi selama
24 jam warna media berubah menjadi coklat muda agak oren dan setelah 48
jam warna media berwarna orange namun ada warna merah sedikit. Selain
perubahan warna media terlihat pula koloni dengan warna abu abu seperti
transparan. Hal ini terjadi karena Staphylococcus aureus mampu
memfermentasikan manitol menjadi asam, dimana phenol red sebagai
indikator dalam suasana asam akan merubah warna media dari oren pekat
seperti merah menjadi oren. Juga media VJA ini merupakan media yang
dapat menumbuhkan bakteri yang koagulase positif, seperti Staphylococcus
aureus (Elvira, 2017). Hasil yang didapatkan ini sesuai dengan literatur
menurut literatur (Pratiwi, 2008), yaitu Staphylococcus aureus secara
makroskopis pada media Vogel Johnson Vogel (VJA) didapat susunan sel
bakteri dengan daerah sekitar koloni berwarna transparan.
Hasil inokulasi yang didapatkan pada bakteri Staphylococcus aureus
dengan menggunakan media Cetrimide Agar (CA) yaitu sebelum dilakukan
inokulasi media berwarna transparan, setelah dilakukan inokulasi selama 24
jam dan 48 jam media tidak terjadi perubahan warna tetapi karena
pencahayaan warnanya terlihat agak cream dan tidak terdapat koloni
bakteri, jika dilihat dari komposisinya berdasarkan Farmakope Indonesia
edisi VI Cetrimide Agar (CA) ini memiliki komposisi pancreatic digest of
gelatin, magnesium klorida, dikalium sulfat, setrimid, agar,air, dan Gliserol.
Tidak terjadinya perubahan dan tidak terdapatnya koloni ini dikarenakan
media ini digunakan untuk isolasi bakteri gram negatif sedangkan
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif. Hasil pengamatan
sesuai dengan literatur yaitu menurut literatur (Pratiwi, 2008) kandungan
cetrimide terdapat senyawa yang menghambat pertumbuhan bakteri
Staphylococcus aureus yang menyebabkan kebocoran unsur-unsur di dalam
selnya sehingga menyebabkan warna media tetap tidak berwarna atau
kuning bening.
Hasil inokulasi yang didapatkan pada bakteri Staphylococcus aureus
dengan menggunakan media Simmon Sitrat yaitu sebelum dilakukan
inokulasi media berwarna hijau tua pekat , setelah dilakukan inokulasi
selama 48 jam media tidak terjadi perubahan warna dan tidak terdapat
koloni bakteri, seharusnya dalam literatur menurut literatur (Downes, 2001)
media Simmon Sitrat jika dilakukan inokulasi akan terjadi perubahan warna
biru karena senyawa basa dari indikator bromthymol biru, ketidak sesuaian
dengan literatur dapat terjadi karena kesalahan dalam pengamatan ataupun
bisa terjadi karena media yang kurang steril. Media Simon Sitrat sendiri
merupakan media yang digunakan untuk membedakan bakteri
Enterobacteriaceae. Komposisi media Simon Sitrat yaitu natrium sitrat
sebagai sumber karbon dan amonium fosfat sebagai sumber nitrogen
(Habibah, 2016).
Hasil inokulasi yang didapatkan pada bakteri Staphylococcus aureus
dengan menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) yaitu sebelum
dilakukan inokulasi media berwarna merah, setelah dilakukan inokulasi
selama 24 jam dan 48 jam terjadi perubahan warna menjadi kuning
keseluruhannya dan terdapat koloni bakteri berwarna kuning , hal ini terjadi
karena TSIA memiliki komposisi yang teridiri dari bubuk Lab-Lemco,
ekstrak ragi, pepton, natrium klorida, laktosa, sukrosa, glukosa, besi sitrat,
natrium tiosulfat, fenol merah, dan agar. Ekstrak ragi dan pepton disini
merupakan sumber karbon dan nitrogen, natrium tiosulfat sebagai sumber
untuk reduksi sulfur, fenol red sebagai pH indikator, dan besi sitrat sebagai
indikator H2S. Media ini terdiri dari 3 karbohidrat yaitu laktosa, sukrosa,
dan glukosa yang bertujuan untuk meningkatkan sensitivitas medium
dengan memfasilitasi deteksi bakteri yang memfermentasi sukrosa, laktosa
dan atau dekstrosa/ glukosa, fermentasi ini terjadi dengan ditandai
perubahan warna media dari merah menjadi kuning (Habibah, 2016).
Sehingga berdasarkan komposisi tersebut terjadinya perubahan warna pada
hasil inokulasi ini akibat terjadinya fermentasi dari gula (laktosa, sukrosa,
dan glukosa) yang terkandung pada komposisi media tersebut oleh
Staphylococcus aureus. Dengan diperoleh hasil bahwa media TSIA ini
dapat menunjukkan adanya perubahan warna menjadi kuning seluruhnya
artinya media ini merupakan media spesifik untuk pertumbuhan bakteri
Staphylococcus aureus.
Bakteri Escherichia Coli ditumbuhkan pada media MCA (Mac
Conkey Agar), sebelum inokulasi media berwarna merah kemudian setelah
inokulasi selama 24 jam dan 48 jam warna media merah dan terjadi
pertumbuhan koloni dengan warna koloni pada media merah dengan
pertumbuhan zigzag sesuai apusan pada permukaan cawan. Hal ini
disebabkan karena kemampuan E.Coli memfermentasikan laktosa dan
menyebabkan penurunan PH (asam), sehingga mempermudah absorpsi
neutral red untuk mengubah koloni menjadi merah muda (Champoux et al.,
2004). Fermentasi laktosa ini terjadi karena komposisi dari MCA
berdasarkan Farmakope Indonesia edisi VI terdiri dari pancreatic digest of
gelatin, peptones (meat and casein), laktosa monohidrat, natrium klorida,
bile salts, agar, merah netral, kristal violet, dan air. Juga MCA ini memiliki
sifat dapat menumbuhkan dan indikatif terhadap Escherichia Coli. Dengan
diperoleh hasil bahwa media MCA ini dapat menunjukkan adanya koloni
artinya media ini merupakan media spesifik untuk pertumbuhan bakteri
Esterichia Coli.
 Bakteri Escherichia Coli ditumbuhkan pada media VJA (Vogel
Johnson Agar), pada awalnya sebelum inokualsi media berwarna merah,
setelah inokulasi selama 24 jam warna media orange dan tidak terlihat
adanya koloni pada media, tetapi setelah 48 jam warna media tetap oren dan
terlihat adanya koloni berwarna putih berbentuk bulat pada permukaan
cawan. Warna media menjadi orange akibat fermentasi manitol yang yang
ada pada bakteri E.Coli.
Bakteri Esterichia Coli ditumbuhkan pada media CA (Centrimide
Agar), diketahui bahwa warna media sebelum inokulasi adalah bening.
Setelah inokulasi selama 48 jam tidak terjadi perubahan warna media dan
warna koloni tidak terlihat. Pada media CA bakteri E.Coli tidak dapat
tumbuh karena pada media ini E.Coli dihambat oleh centrimide yang
merupakan quarternary ammonium akan menginhibisi dan menyebabkan
kebocoran unsur-unsur didalam sel dengan melepas nitrogen dan fosfor.
Berdasarkan Farmakope Indonesia edisi VI Cetrimide Agar (CA) ini
memiliki komposisi pancreatic digest of gelatin, magnesium klorida,
dikalium sulfat, setrimid, agar,air, dan gliserol. Juga bersifat menghambat
pertumbuhan E.Coli. Dengan diperoleh hasil bahwa media CA ini tidak
mengalami perubahan dan tidak terdapat koloni artinya media ini bukan
merupakan media spesifik untuk pertumbuhan bakteri Esterichia Coli.
Bakteri Esterichia Coli ditumbuhkan pada media SS (Simmon
Sitrat), pada awalnya media berwarna hijau sebelum dilakukan inokulasi.
Setelah inokulasi selama 48 jam warna media tetap hijau tua dan warna
koloninya tidak terlihat. Hal ini terjadi karena pada pada pertumbuhannya
bakteri E.Coli tidak memerlukan sitrat sebagai sumber karbon dan
energinya, dimana media simmon sitrat akan memberikan warna biru saat
trinatrium sitrat yang merupakan satu - satunya sumber karbon dan
indikatornya yang merupakan Brantymol blue akan memberikan warna biru
pada saat PH>7 (Fatmawati, 2014). Media SS sendiri merupakan media
yang digunakan untuk membedakan bakteri Enterobacteriaceae. Komposisi
media Simon Sitrat yaitu natrium sitrat sebagai sumber karbon dan
amonium fosfat sebagai sumber nitrogen, dengan pH akhir 6,8 ± 0,2 pada
suhu 25ºC (Habibah, 2016). Dengan diperoleh hasil bahwa media SS ini
tidak mengalami perubahan artinya media ini bukan merupakan media
spesifik untuk pertumbuhan bakteri Esterichia Coli.
Bakteri Esterichia Coli ditumbuhkan pada media TSIA (Triple
Sugar Iron Agar), Pada awalnya warna media sebelum inokulasi adalah
merah. Setelah inokulasi selama 48 jam warna media merah berubah
menjadi kuning seluruhnya dan warna koloni kuning pekat. Bakteri
Esterichia Coli dapat tumbuh baik pada media TSIA karena media ini
biasanya digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif yang
memfermentasi dekstosa/laktosa/sukrosa dan produksi H2S. Warna media
berubah menjadi warna kuning akibat terjadinya fermentasi karbohidrat
yang disebabkan oleh indikator fenol merah (Quinn et al., 2006). Fermentasi
dari laktosa, sukrosa, dan glukosa merupakan ciri dari media ini telah
menumbuhkan bakteri karena komposisi yang dimilikinya. Komposisi yang
dimiliki TSIA teridiri dari bubuk Lab-Lemco, ekstrak ragi, pepton, natrium
klorida, laktosa, sukrosa, glukosa, besi sitrat, natrium tiosulfat, fenol merah,
dan agar. Ekstrak ragi dan pepton disini merupakan sumber karbon dan
nitrogen, natrium tiosulfat sebagai sumber untuk reduksi sulfur, fenol red
sebagai pH indikator, dan besi sitrat sebagai indikator H2S. Media ini terdiri
dari 3 karbohidrat yaitu laktosa, sukrosa, dan glukosa yang bertujuan untuk
meningkatkan sensitivitas medium dengan memfasilitasi deteksi bakteri
yang memfermentasi sukrosa, laktosa dan atau dekstrosa/ glukosa,
fermentasi ini terjadi dengan ditandai perubahan warna media dari merah
menjadi kuning (Habibah, 2016). Dengan diperoleh hasil bahwa media
TSIA ini terlihat adanya perubahan warna media menjadi kuning seluruhnya
artinya media ini merupakan media spesifik untuk pertumbuhan bakteri
Esterichia Coli.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa ditumbuhkan pada media MCA
(Mac Conkey Agar), pada awalnya warna media sebelum inokulasi adalah
merah. Setelah inokulasi selama 48 jam warna media tetap merah dan
warna koloni abu – abu zig zag sesuai apusan. Hal ini terjadi karena
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif tetapi tidak dapat
memfermentasi laktosa.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa ditumbuhkan pada media VJA
(Vogel Johnson Agar), pada awalnya warna media sebelum di inokulasi
adalah coklat pekat dan seperti warna merah. Setelah inokulasi selama 48
jam terdapat perubahan warna media menjadi orange dan terlihat adanya
sedikit koloni berwarna putih di dekat ujung cawan petri. Hal ini terjadi
karena pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa terhambat oleh
kalium terurit yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan beberapa
bakteri gram – dan +. Sedangkan warna orange didapatkan akibat fermentasi
manitol.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa ditumbuhkan pada media CA
(Centrimide Agar), pada awalnya warna media sebelum diinokulasi adalah
bening. Setelah inokulasi selama 48 jam tidak terjadi perubahan warna pada
media dan warna koloni kekuningan zig zag sesuai apusan. Jika dilihat
komposisinya berdasarkan Farmakope Indonesia edisi VI Cetrimide Agar
(CA) ini memiliki komposisi pancreatic digest of gelatin, magnesium
klorida, dikalium sulfat, setrimid, agar,air, dan gliserol. Karena pada
komposisinya terdapat setrimide maka Pseudomonas aeruginosa dapat
tumbuh karena dengan adanya centrimide ini, membuatnya dapat
menginhibisi bakteri selain Pseudomonas aeruginosa dan adanya MgCl2
dan KSO4 yang menstimulasi produksi pyocianin dan florourescein disini
florourescein menyebabkan pigmen warna kekuningan (Hidemasa, 2003).
Juga berdasarkan Farmakope Indonesia edisi VI Cetrimide Agar (CA) ini
memiliki sifat untuk dapat menghambat pertumbuhan E Coli. Berdasarkan
dari hasil literatur bakteri Pseudomonas aeruginosa cocok ditumbuhkan
atau diisolasi pada media CA.Cetrimide agar merupakan media yang
digunakan untuk isolasi Pseudomonas aeruginosa. Cetrimide merupakan
quaeternary ammonium merupakan senyawa yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri lain, dapat menyebabkan kebocoran unsur - unsur
didalam sel, namun tidak terjadi pada bakteri Pseudomonas aeruginosa
(V.I.Borwn and E.J.L lowbury, 1965). Dengan diperoleh hasil bahwa media
CA ini terlihat adanya warna koloni kekuningan zig zag sesuai apusan
artinya media ini merupakan media spesifik untuk pertumbuhan bakteri
Pseudomonas aeruginosa.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa ditumbuhkan pada media SS
(Simmon Sitrat) setelah inokulasi selama 48 jam terjadi perubahan warna
media dari hiajau menjadi berwarna biru seluruhnya. Warna biru pada
media terjadi saat trinatrium sitrat yang merupakan satu-satunya sumber
karbon dan indikatornya yang merupakan Brantymol blue akan memberikan
warna biru pada saat PH > 7 (Fatmawati, 2014). Media SS sendiri
merupakan media yang digunakan untuk membedakan bakteri
Enterobacteriaceae. Komposisi media Simon Sitrat yaitu natrium sitrat
sebagai sumber karbon dan amonium fosfat sebagai sumber nitrogen
(Habibah, 2016). Dengan diperoleh hasil bahwa media SS ini berubah
menjadi warna biru seluruhnya artinya media ini merupakan media spesifik
untuk pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa ditumbuhkan pada media TSIA
(Triple Sugar Iron Agar), pada awalnya warna media sebelum inokulasi
adalah merah. Setelah inokulasi selama 48 jam warna media tidak berubah
dan warna koloni tidak terlihat. Warna media merah akibat tidak terjadi
fermentasi karbohidrat yang disebabkan oleh indikator fenol merah. Media
TSIA ini memiliki Komposisi yang teridiri dari bubuk Lab-Lemco, ekstrak
ragi, pepton, natrium klorida, laktosa, sukrosa, glukosa, besi sitrat, natrium
tiosulfat, fenol merah, dan agar. Ekstrak ragi dan pepton disini merupakan
sumber karbon dan nitrogen, natrium tiosulfat sebagai sumber untuk reduksi
sulfur, fenol red sebagai pH indikator, dan besi sitrat sebagai indikator H2S.
Media ini terdiri dari 3 karbohidrat yaitu laktosa, sukrosa, dan glukosa yang
bertujuan untuk meningkatkan sensitivitas medium dengan memfasilitasi
deteksi bakteri yang memfermentasi sukrosa, laktosa dan atau dekstrosa/
glukosa, fermentasi ini terjadi dengan ditandai perubahan warna media dari
 merah menjadi kuning (Habibah, 2016). Dengan didapatkan hasil bahwa
warna media tidak mengalami perubahan artinya media ini bukan media
spesifik untuk pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa.

VII. KESIMPULAN
Pada praktikum kali ini dilakukan beberapa percobaan mengenai
isolasi, identifikasi dan konfirmasi mikroba. Berikut kesimpulan yang dapat
diambil dari percobaan ini:
1. Media spesifik untuk pertumbuhan bakteri S .aureus terjadi pada
media Vogel Johnson Agar ditandai dengan perubahan warna media
menjadi berwarna abu dan pada media Triple Sugar Iron Agar
ditandai dengan perubahan media dari merah menjadi kuning.
2. Media spesifik untuk pertumbuhan bakteri P.aeruginosa terjadi pada
media Cetrimide Agar (CA) ditandai dengan pertumbuhan koloni
berwarana kuning, kemudian pada media Simmon Sitrate ditandai
dengan perubahan media dari hijau menjadi biru.
3. Media spesifik untuk pertumbuhan bakteri E. coli terjadi pada media
Mac Conkey Agar ditandai dengan pertumbuhan koloni berwarna
merah tua, pada media Vogel Johnson Agar ditandai dengan
pertumbuhan koloni berwarna putih dan pada media Triple Sugar
Iron Agar ditandai dengan perubahan media dari merah menjadi
kuning.
VIII. DAFTAR PUSTAKA
Champoux, J.J., Neidhardt, F. C., Drew, W. L., & Plorde, J.J. (2004).
Enterobacteriaceae in Pathogenic Bacteria. In K.J. Ryan, & C.G. Ray
(Eds),Sherris medical microbiology fourth edition: an introduction to
infectious diseases, (pp. 342-357). New York, USA: McDrawHill.
Ditjen POM. (1995). Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta: Departemen
Kesehatan RI.
Downes. F. P. dan K. Ito. (2001). Compendium of Methods For the Microbiological
Examination of Food. Washington D.C: APHA.
Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Elvira dkk. (2017). Identifikasi Staphylococcus aureus dan Uji Sensitivitas terhadap
Antibiotik dari Sampel Darah Pasien Sepsis di RSUD Dr.
Moewardi. Jurnal biomedika, 10(1), 23 – 29.
Fatmawati, A.G. Bambang dan N.S. Kojong. (2014). Analisis cemaran bakteri
coliform dan identifikasi E.coli pada air isi ulang dari depot di Kota
Manado. Jurnal Ilmiah Farmasi.
Habibah,U. (2016). Analisis Cemaran Bakteri Coliform dan Identifikasi
Escherichia coli pada Air Minum Isi Ulang (AMIU) Depot di Kelurahan
Pondok Cabe Ilir Kota Tangerang Selatan. (Skripsi, UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta, 2016).
Hidemasa Kodoka,Morihiro Iwata, Shigeo Yumoto, Fusaka kashitani. (2003).
Evaluation of a new agar medium containing cetrimide, kanamycin and
nalidixic acid for isolation and enhancement of pigmen production of
Pseudomonad aeruginosa in clinicalsampel. Jurnal of Basic
Microbiology. 43 (5), 407-413.
Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Rajawali.
Oetari, RA. (2017). Teknik Aseptis. Yogyakarta: Gadjah mada university press.
Petti, C.A., C.R. Polage dan P. Schreckenberger. 2005. The Role of 16S rRNA Gene
Sequencing in Identification of Microorganisms Misidentified by
 Conventional Methods. Journal of Clinical Microbiology 12 (43) : 6123
6125.
Pelczar. (1996). Mycrobiology. Tokyo: Mc Graw Hill.
Pelczar, M. J. (1988). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Universitas Indonesia.
Pratiwi, Sylvia. T. (2008). Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga.
Quinn,P.J.,B.K.Markey,M.E.Carter,W.J.Donnelly and F.C.Leonard. (2006).
Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Blackwell Publishing.
USA. 443-46,465-475.
Suwandi, U. (1999). Peran Media Untuk Identifikasi Mikroba Patogen Cermin
Dunia Kedokteran. Jakarta: PT Kalbe Farma.
V.I.Brown and J.L. Lowbury. (1965). Use of an improved cetrimide agar medium
and other culture methods for Pseudomonas aeruginosa. From the
M.R.C Indutrial Injuries and Burns Reseach Unit, Birminghan
Accident Hospital,18,752.
Volk, W. a. (1993). Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Jakarta: Erlangga.
PEMBAGIAN TUGAS LAPORAN :

- Cover dan Tujuan : Dwi Oktariani

- Teori Dasar : Vidya Sulistiawati dan Gishela Bellania
- Alat dan Bahan : Citra Mufidah
- Prosedur : Citra Mufidah
- Data Pengamatan : Citra Mufidah dan Dwi Oktariani
- Pembahasan : Aulia Nurul Rahim dan Lulu Mumtaz
- Kesimpulan : Vidya Sulistiawati
- Daftar Pustaka : Aulia Nurul Rahim