LAPORAN

PRAKTIK KERJA LAPANGAN

PT. MEPROFARM PHARMACEUTICAL INDUSTRIES

Disusun oleh :
Gina Novita P17335116003
Fenty Yuniar P17335116025
Desti Retno Palupi P17335116042

KEMENTERIAN KESEHATAN RI
POLITEKNIK KESEHATAN BANDUNG
JURUSAN FARMASI
2019
 ENDOTOKSIN

Pirogen berasal dari kata pyrexia (fever/demam). Pirogen jika diinjeksikan atau
masuk ke dalam tubuh akan menyebabkan peningkatan suhu tubuh. Senyawa yang memiliki
sifat pyrogen ini disebut endotoksin. Endotoksin adalah lipopolisakarida (LPS) konstituen
utama dari membran luar semua bakteri Gram-negatif yang menyebabkan adanya syok septik
pada hewan (Beutler dan Rietschel, 2003). Dalam industri farmasi dimungkinkan untuk
menemukan endotoksin selama proses produksi atau dalam produk akhir. Meskipun
endotoksin terkait dalam dinding sel bakteri, mereka terus dilepaskan ke lingkungan.
Pelepasan tidak hanya terjadi pada kematian sel tetapi juga selama pertumbuhan dan
pembelahan. Karena bakteri dapat tumbuh dalam media yang miskin nutrisi, seperti air,
garam, dan buffer, endotoksin ditemukan hampir di mana-mana.
Endotoksin menimbulkan berbagai macam efek patofisiologis. Dalam kondisi di mana
tubuh terpapar LPS secara berlebihan atau sistemik (seperti ketika konsentrasi kecil LPS
memasuki aliran darah), reaksi inflamasi sistemik dapat terjadi, yang mengarah ke beberapa
efek patofisiologis, seperti syok endotoksin, cedera jaringan, dan kematian. Namun,
endotoksin tidak bertindak langsung terhadap sel atau organ tetapi melalui aktivasi sistem
kekebalan tubuh, terutama melalui monosit dan makrofag, dengan pelepasan berbagai
mediator pro-inflamasi, seperti faktor nekrosis tumor (TNF), interleukin (IL) -6 dan IL-1.
Reaksi pirogenik dan syok diinduksi pada mamalia setelah injeksi endotoksin intravena pada
konsentrasi rendah (1 ng / mL). Tingkat maksimum endotoksin untuk aplikasi intravena dari
produk farmasi dan biologis diatur ke 5 unit endotoksin (UE) per kg berat badan per jam oleh
semua farmakope. Istilah UE menggambarkan aktivitas biologis endotoksin. Misalnya, 100
pg endotoksin standar EC-5 dan 120 pg endotoksin dari Escherichia coli O111: B4 memiliki
aktivitas 1 EU.
4.1 Sejarah Penemuan Endotoksin
1. Sanarelli (1894)
Studi tentang terjadinya demam setelah pemberian cairan tertentu melalui intravena
dilakukan sebelum abad ke-19. Pada tahun 1894, Sanarelli menunjukkan bahwa kultur cair
dari Eberth bacillus terbebas dari mikroorganisme namun dapat menghasilkan keracunan
disertai dengan demam ketika disuntikkan pada hewan, kadang-kadang bahkan mematikan
(Prista dkk, 1996). Pada akhir abad ke-19, sebutan "injection fever" umumnya digunakan
untuk mengekspresikan reaksi demam yang diamati setelah pemberian beberapa cairan
melalui intravena. Administrasi obat-obatan melalui rute intravena di abad ke-20
meningkatkan jumlah kecelakaan seperti itu, membuat beberapa peneliti mengembangkan
serangkaian pekerjaan evaluasi tentang subjek ini.
2. Hort dan Penfold (1912)
Pada tahun 1912, Hort dan Penfold menciptakan nama "pyrogenic" untuk menunjuk
"waters" yang, ketika disuntikkan, menyebabkan "hipertermia". Penelitian tersebut diteliti
lebih lanjut pada tahun 1923, oleh Florance Seibert yang menyebutkan bahwa pirogenik
sebagai zat "hipertermisasi” mengandung toksin hasil metabolisme yang dikeluarkan bakteri
yang mati tersebut seperti protein denaturasi, endotoksin atau eksotoksin.
3. Seibert (1923)
Seibert dan rekan kerjanya melanjutkan penelitian yang dimulai oleh Hort dan
Penfold, dengan mengisolasi mikroorganisme Gram-negatif yang hidup dari air suling, yang
mampu menghasilkan pirogen. Para penulis menetapkan mikroorganisme ini sebagai bakteri
Pyrogenic, menyadari bahwa itu bukan bakteri baru karena beberapa varietas
mikroorganisme dapat menghasilkan pyrogen.

4. Co-Tui dan Schrif (1925-1945)

Co-Tui dibantu oleh Schrif menemukan bahwa bakteri Gram-negatif mengahasilkan
endotoksin yang paling berbahaya karena sangat stabil di semua kondisi (pH, suhu,
surfaktan), sedangkan bakteri Gram-positif, ketika dihancurkan oleh panas hampir tidak
menghasilkan pyrogen karena pada bakteri gram positif eksotoksin yang dihasilkan oleh
bakteri gram positif dapat dengan mudah didenaturalisasikan oleh panas.
Menurut Westphal (1945), pirogen yang harus benar-benar ditakuti dalam sediaan
farmasi, sesuai dengan endotoksin bakteri Gram-negatif, dan kompleks lipopolysaccharide
seperti itu ditemukan di lapisan luar dinding sel bakteri. Pada dasarnya, pirogen berasal dari
mikroorganisme dari keluarga Enterobactereaceae dan dianggap sebagai kontaminan utama
dari larutan injeksi yang disiapkan tanpa proses disinfektan dan sterilisasi yang tepat. Sekitar
dua dekade kemudian, sebuah studi kolaboratif dikembangkan oleh Institut Kesehatan
Nasional AS dan industri farmasi untuk menggunakan hewan untuk mengevaluasi
"pirogenitas" dari suatu cairan. Studi tersebut memuncak dalam pengembangan uji pirogen
resmi pertama pada kelinci, yang digabungkan dalam USP XII, pada tahun 1942.
4.2 Endotoxin: Sifat-Sifat Kimia Dan Fisik
Endotoksin, juga disebut lipopolysaccharides (LPS) merupakan komponen utama dari
membran luar bakteri Gram-negatif (Gambar 1).

Sumber : Raetz dkk, 1991

Gambar 1. Komponen utama membran luar bakteri gram negative

Lipopolisakarida terdiri dari gugus polisakarida hidrofilik, yang secara kovalen terkait
dengan gugus lipid hidrofobik (Lipid A) (Gambar 2). Lipopolisakarida dari sebagian besar
spesies terdiri dari tiga bagian berbeda: bagian antigen-O, inti oligosakarida dan Lipid A
(LipA) (Gambar 2).

Sumber : Ohno and Morrison 1989

Gambar 2. Struktur kimia dari Endotoksin

Lipid A adalah bagian endotoksin yang paling terkonservasi dan bertanggung jawab
untuk sebagian besar aktivitas biologis endotoksin, yaitu toksisitasnya (Petsch dan Anspach,
2000). Endotoksin terdiri dari residu D-glukosamin b-1,6-linked, terkait secara kovalen
dengan substituen 3-hidroksi-asil dengan 12-16 atom karbon melalui ikatan amida dan ester,
selanjutnya dapat diesterifikasi dengan asam lemak jenuh (Petsch dan Anspach, 2000).
Bagian hidrofobik dari endotoksin ini memiliki susunan heksagonal yang teratur,
menghasilkan struktur yang lebih kaku dibandingkan molekul lainnya Strain yang
kekurangan lipid A atau endotoksin tidak diketahui (Lin MF dkk, 2005).
Inti oligosakarida memiliki struktur kekal dengan asam 3-deoksi-D-manno-2-
octulosonic (KDO) 3-bagian dalam - daerah heptosa dan daerah heksosa luar. Pada spesies E.
coli, lima jenis inti berbeda diketahui, dan spesies Salmonella hanya memiliki satu struktur
inti. Wilayah inti yang dekat dengan lipid A dan lipid A sendiri sebagian terfosforilasi (pK1 =
1,3, pK2 = 8,2 gugus fosfat pada lipid A), sehingga molekul endotoksin menunjukkan muatan
negatif bersih dalam larutan protein umum (Petsch dan Anspach, 2000).
Antigen-O umumnya terdiri dari oligosakarida identik (masing-masing terdiri dari
tiga hingga delapan monosakarida), yang merupakan strain spesifik dan determinatif untuk
identitas serologis dari masing-masing bakteri (Petsch dan Anspach, 2000). Telah diketahui
bahwa endotoksin membentuk berbagai agregat supra-molekuler dalam larutan berair karena
struktur amphipathiknya. Agregat ini dihasilkan dari interaksi non-polar antara rantai lipid
serta jembatan yang dihasilkan antara kelompok fosfat dengan kation divalent. Struktur
agregat telah dipelajari dengan berbagai teknik seperti mikroskop elektron, difraksi sinar-X,
spektroskopi FT-IR, dan NMR. Hasil dari studi ini telah menunjukkan bahwa, dalam larutan
encer, endotoksin dapat merakit sendiri dalam berbagai bentuk, seperti lamella, kubik, dan
pengaturan terbalik heksagonal, dengan diameter hingga 0,1 mm dan 1000 kDa, dan stabilitas
tinggi tergantung pada larutan karakteristik (pH, ion, surfaktan, dll) (Ryan, 2004). Diusulkan
bahwa protein juga dapat menggeser kesetimbangan dengan melepaskan monomer
endotoksin dari agregat.
Endotoksin dikeluarkan dalam jumlah besar setelah kematian sel serta selama
pertumbuhan dan pembelahan. Mereka sangat stabil terhadap panas dan tidak hancur dalam
kondisi sterilisasi reguler. Endotoksin dapat dinonaktifkan ketika terpapar pada suhu 250º C
selama lebih dari 30 menit atau 180º C selama lebih dari 3 jam (Gorbet dan Sefton, 2006).
Asam atau alkali dengan kekuatan setidaknya 0,1 M juga dapat digunakan untuk
menghancurkan endotoksin dalam skala laboratorium (Pinto dkk, 2000).
4.3 Mekanisme Aksi Endotoxin
Endotoksin menimbulkan berbagai macam efek patofisiologis, seperti syok
endotoksin, cedera jaringan, dan kematian (Ogikub, 2004). Endotoksin tidak bertindak
langsung terhadap sel atau organ tetapi melalui aktivasi sistem kekebalan tubuh, terutama
monosit dan makrofag, sehingga meningkatkan respons imun. Sel-sel ini melepaskan
mediator, seperti faktor nekrosis tumor, beberapa interleukin, prostaglandin, faktor
perangsang koloni, faktor pengaktif trombosit dan radikal bebas (Forehand dkk, 1989).
Mediator memiliki aktivitas biologis yang kuat dan bertanggung jawab atas efek samping
pada paparan endotoksin. Ini termasuk perubahan dalam struktur dan fungsi organ dan sel,
perubahan fungsi metabolisme, peningkatan suhu tubuh, aktivasi kaskade koagulasi,
modifikasi hemodinamik dan induksi syok. Banyak upaya telah dilakukan untuk mencegah
atau mengobati efek buruk endotoksin pada sel imun, seperti penggunaan antibodi anti-
endotoksin, dan struktur parsial endotoksin untuk memblokir antagonis reseptor endotoksin.
Namun demikian, interaksi endotoksin dengan sel-sel kekebalan tidak hanya dimediasi oleh
reseptor spesifik. Priming sel juga dapat terjadi oleh interkalasi non-spesifik molekul
endotoksin ke dalam membran sel target (Schromm dkk, 2000).
Endotoksin juga memiliki efek menguntungkan, diantaranya digunakan untuk terapi
demam buatan, menghancurkan tumor dan untuk meningkatkan secara tidak spesifik
pertahanan kekebalan tubuh. Ketidakpastian tentang perannya untuk kesehatan manusia
pernah dijelaskan oleh Bennett pada tahun 1953. Di sisi lain, paparan endotoksin berlebihan
harus benar-benar dihindari untuk mencegah komplikasi. Ini terutama berlaku untuk obat-
obatan yang diberikan secara intravena.

4.4 Teknik-Teknologi Penentuan Endotoxin

1. LAL gel-cloth assay
Teknik yang disetujui FDA untuk pendeteksian endotoksin adalah uji pirogen kelinci
dan uji Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) (Hoffmann, 2005). Uji pirogen kelinci, yang
dikembangkan pada 1920-an, melibatkan pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah injeksi
larutan uji intravena. Karena biayanya yang tinggi dan waktu penyelesaian yang lama,
penggunaan uji pirogen kelinci telah berkurang, dan sekarang hanya diterapkan dalam
kombinasi dengan uji LAL untuk menganalisis senyawa biologis dalam fase pengembangan
sebelumnya dari perangkat parenteral.
Saat ini sistem deteksi endotoksin yang paling populer didasarkan pada LAL, yang
berasal dari darah kepiting tapal kuda, Limulus polyphemus, dan gumpalan pada paparan
endotoksin. Bentuk paling sederhana dari uji LAL adalah uji gel-bekuan LAL. Ketika uji
LAL dikombinasikan dengan pengenceran sampel yang mengandung endotoksin, gel akan
dibentuk secara proporsional dengan sensitivitas endotoksin dari pengujian yang diberikan.
Konsentrasi endotoksin diperkirakan dengan terus menggunakan uji sensitivitas kurang
sampai reaksi negatif (tidak ada gumpalan yang dapat diamati) diperoleh. Prosedur ini dapat
membutuhkan beberapa jam (Pinto, 2000). Konsentrasi 0,5 EU / mL didefinisikan sebagai
ambang batas antara sampel pirogenik dan non-pirogenik (Pinto, 2000).

2. Turbidimetri LAL
Selain teknik gel-gumpalan, produsen juga telah mengembangkan dua teknik lain:
teknik LAL turbidimetri dan teknik LAL kromogenik. Teknik-teknik yang lebih baru ini
berbasis kinetik, yang berarti mereka dapat memberikan konsentrasi endotoksin dengan
mengekstraksi tanggapan real-time dari uji LAL. Turbidimetric LAL assay mengandung
cukup koagulogen untuk membentuk kekeruhan ketika dibelah oleh enzim pembekuan, tetapi
tidak cukup untuk membentuk bekuan (Ong dkk, 2006). Uji turbidimetri LAL, bila
dibandingkan dengan uji gel-gumpalan LAL, memberikan pengukuran endotoksin yang lebih
kuantitatif pada rentang konsentrasi (0,01 EU / mL hingga 100,0 EU / mL.). Pengujian ini
didasarkan pada peningkatan kekeruhan karena koagulasi protein terkait dengan konsentrasi
endotoksin dalam sampel. Kepadatan optik dari berbagai pengenceran sampel uji diukur dan
dikorelasikan dengan konsentrasi endotoksin yang dibantu oleh kurva standar yang diperoleh
dari sampel dengan jumlah endotoksin yang diketahui (Ong dkk, 2006).

3. Kromogenik LAL
Uji substrat kromogenik kinetik berbeda dari reaksi bekuan-gel dan turbidimetri
karena koagulogen sebagian atau seluruhnya diganti oleh substrat kromogenik (Poole dkk,
2003). Ketika dihidrolisis oleh enzim pra-pembekuan, substrat kromogenik melepaskan zat
berwarna kuning yang dikenal sebagai p-nitroanilin. Waktu yang diperlukan untuk mencapai
zat kuning terkait dengan konsentrasi endotoksin (Poole dkk, 2003). Namun, uji turbidimetri
dan kromogenik kinetik, meskipun lebih akurat dan lebih cepat dari gumpalan-gel, tidak
dapat digunakan untuk cairan dengan kekeruhan yang melekat seperti darah dan cairan
berwarna kuning, mis. urin, dan kinerjanya dapat terganggu oleh presipitasi dari larutan (Ong
dkk, 2006). Oleh karena itu, metode yang berbeda untuk mendeteksi endotoksin dalam
sampel yang berbeda telah dipelajari (Poole dkk, 2003).
4.5 Metode Penghilangan Endotoksin
Terdapat dua kesulitan yang berhubungan dengan penghilangan endotoksin dalam
produk diantaranya proses yang diterapkan tidak terjadi perubahan produk selama proses
penghilangan endotoksin, konsentrasi endotoksin relative rendah dan kesulitan dalam
menghilangkan endotoksin yang terikat. Dasar dengan adanya beberapa metode untuk
menhilangkan endotoksin adalah struktur kompleks, molekul endotoksin memiliki daerah
yang bersifat hidrofobik, hidrofilik dan bermuatan (Malgahaes dkk, 2007).

a. Partisi Dua Fase

Penggunaan dua fase pelarut menjadi popular dengan proses tertentu, pelarut
organik sebagai pelarut alternatif. Metode ini dapat menghasilkan kondisi yang lebih
ringan yang tidak membahayakan mengubah sifat yang tidak stabil atau labile
biomolecule. Partisi dua fase dalam penghilangan endotoksin ini melibatkan
optimalisasi kondisi partisi protein menjadi satu fase sedangkan endotoksin dipartisi
ke fase lain. Dua system ini dapat dimanipulasi dengan mengubah faktor-faktor
seperti massa polimer, pH, kekuatan ionic, konsentrasi komponen fase (Lopes dkk,
2010).
b. Ultrafiltrasi
Molekul endotoksin cenderung membentuk misel atau vesikel dalam larutan air
ini dapat dihilangkan dari larutan dengan penyaringan. Ultrafiltrasi dilakukan dengan
menyaring berdasarkan berat molekul menggunakan filter ultra halus 10.000 Da atau
lebih besar (massa molar dari monomer endotoksin bervariasi dari 10.000-20.000 Da).
Proses ini sering digabungkan dengan filter 0,1 µm untuk kontrol bioburden. Metode
ini sedikit memberi efek pada kadar endotoksin (Jang dkk, 2009).
c. Kromatografi
Metode kromatografi negatif adalah metode yang disukai untuk penghilangan
endotoksin. Afinitas metode kromatografi (afinitas ligan termasuk DEAE sepharose,
poly-L-lysine dan polymixin B) bertindak untuk mengikat endotoksin melalui ikatan
afinitas. Sebaliknya kromatografi bermuatan positif untuk menarik endotoksin yang
bermuatan negatif. Kedua proses tersebut dipengaruhi oleh pH, suhu, laju aliran,
jumlah elektrolit (Diago dkk, 2005).
Selain itu, kromatografi ukuran ekslusi dapat dipertimbangkan meskipun
tergantung pada ukuran protein. Matriks selektif endotoksin absorber dirancang untuk
menghilangkan endotoksin melalui disosiasi protein (Petsch dan Anspach, 2000).
d. Elektroforesis
Metode ini jarang digunakan untuk penghilangan endotoksin. Beberapa peneliti
telah berhasil dengan application of slab-polyacrylamide atau sodium deodecyl
sulfate- polyacrylamide gel elektoforeseis. Metode tersebut dapat digunakan untuk
memisahkan lipopolisakarida dari protein (Jann dkk, 1975).
e. Deterjen
Pemisahan endotoksin dari larutan protein dapat terjadi dengan penggunaan
surfaktan non ionic dalam proses pencucian. Namun hal ini dapat menimbulkan
masalah untuk langkah selanjutnya karena deterjen membutuhkan pembersihan.
Langkah tambahan dapat menyebabkan perubahan perubahan pada hasil produk
(Reichelt dkk, 2006).
 DAFTAR PUSTAKA

Diogo, M. M. Queiroz, J. A., and Prazeres, D.M. F. (2005). Chromatography of

plasmid DNA, Journal of Chromatography A, 1069 (1): 3–22
Forehand JR, Pabst MJ, Phillips WA, Johnston Jr, RB. (1989). Lipopolysaccharide priming of
human neutrophils for an enhanced respiratory burst. Role of intracellular free calcium. Journal of
Clinical Investigation 83:74-83.
Gorbet MB, Sefton MV. (2006). Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials 26:6811-
6817.
Hoffmann S, Peterbauer A, Schindler S, Fennrich S, Poole S, Mistry Y, Montag-Lessing T,
Spreitzer I, Loschner B, van Aalderen M, Bos R, Gommer M, Nibbeling R, Werner-Felmayer G,
Loitzl P, Jungi T, Brcic M, Brugger P, Frey E, Bowe G, Casado J, Coecke S, de Lange J, Mogster B,
Naess LM, Aaberge IS, Wendel A, Hartung T. (2005). International validation of novel pyrogen
testes based on human monocytoid cells. Journal of Immunological Methods 298:161-173.
Jann B, Reske K, Jann K. (1975). Heterogeneity of lipopolysaccharides. Analysis of
polysaccharide chain lengths by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophore.
Eur. J. Biochem 60:239-246.
Liu S, Tobias R, McClure S, Styba G, Shi Q, Jackowski G. (1997). Removal of endotoxin from
recombinant protein preparations. Clin. Biochem 30:455–463.
Lopes, M., Magalhaes, P. O., Mazzola, P. G. et al., (2010). LPS removal from an E. coli
fermentation broth using aqueous two-phase micellar system, Biotechnology Progress, 26
(6): 1644–1653
Malgahaes PO, Lopes AM, Mazzola PG et al (2007). Methods of endotoxin removal from
biological preparation: a riview. J Pharm Sci; 10(3); 388-404
Mitzner S, Schneidewind J, Falkenhagen D, Loth F, Klinkmann H. (1993). Extracorporeal
endotoxin removal by immobilized polyethylenimine. Artif Organs 17:775–81.
Petsch D, Anspach FB. (2000). Endotoxin removal from protein solutions, J
Biotechnol.;76(2-3):97-119
Reichelt P, Schwarz C, Donzeau M. (2006). Single step protocol to purify recombinant
proteins with low endotoxin contents, Protein Expr Purif.;46(2):483-8
Ogikubo Y, Ogikubo Y, Norimatsu M, Noda K, Takahashi J, Inotsume M, Tsuchiya M,
Tamura Y. (2004). Evaluation of the bacterial endotoxin test for quantification of endotoxin
contamination of porcine vaccines. Biologicals 32:88-93.
 Ohno N, Morrison DC. (1989). Lipopolysaccharide interaction with lysozyme: binding
of lipopolysaccharide to lysozyme and inhibition of lysozyme enzymatic activity. J Biol Chem
264:4434–4441.
Ong KG, Leland JM, Zeng KF, Barrett G, Zourob M, Grimes CA. (2006). A rapid highly-
sensitive endotoxin detection system. Biosensors and Bioelectronics 21:2270-2274.
Petsch D, Anspach FB. (2000). Endotoxin removal from protein solutions. Journal of
Biotechnology 76:97-119.
Pinto TJA, Kaneko TM, Ohara MT. (2000). Controle Biológico de Qualidade de Produtos
Farmacêuticos Correlatos e Cosméticos. In: Atheneu Editor. Pyrogens, São Paulo, p 167-200.
Prista LN, Alves AC, Morgado R. (1996). Preparação de Medicamentos Injectáveis In:
Fundação Calouste Gulbenkian editor. Tecnologia Farmacêutica. Lisboa. III volume, 4ª Edição p
1807-1840.
Poole S, Mistry Y, Ball C, Das REG, Opie LP, Tucker G, Patel M. (2003). A rapid ‘on-plate’ in
vitro test for pyrogens. Journal of Immunological Methods 274:209-220.
Pyo SH, Lee JH, Park HB, Hong SS, Kim JH. (2001). A large-scale purification of
recombinant histone H1 5 from Escherichia coli, Protein Expr. Purif 23:38–44.
Raetz CR, Ulevitch RJ, Wright SD, Sibley CH, Ding A, Nathan CF. (1991). Gram-
negative endotoxin: an extraordinary lipid with profound effects on eukaryotic signal
transduction. The FASEB Journal 5(12):2652-2660.
Ryan J. (2004). Endotoxins and cell culture. Corning Life Sciences Technical
Bulletin.1-8.
Schromm AB, Brandenburg K, Loppnow H, Moran AP, Koch MHJ, Rietschel ET, Seydel U.
(2000). Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipid A
portion. European Journal of Biochemistry 267