MAKALAH

Analisis Kromatografi
Penetapan Kadar Gentamisin pada Sediaan Krim Dengan Metode Kromatografi
Lapis Tipis

Disusun oleh :

Zenna Adella 182210101105

Dewi Nikita Maghfirotul Ilmi 182210101106

Dinda Mirza Ayu Maretha 182210101111

Salma Luthfiana Nurshabira 182210101150

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

2020
 Daftar Isi
Bab I Pendahuluan ................................................................................................................................. 1

1.1. Latar Belakang......................................................................................................................... 1

1.2. Rumusan Masalah ................................................................................................................... 2

1.3. Tujuan penulisan ..................................................................................................................... 2

Bab II Teori Dasar .................................................................................................................................... 3

BAB III Isi ................................................................................................................................................. 6

3.1. Menentukan analit dan sampel .............................................................................................. 6

3.1.1. Formulasi Krim Gentamisin ............................................................................................. 6

3.1.2. Analit ............................................................................................................................... 6

3.1.3. Matriks ............................................................................................................................ 6

3.2. Menentukan sifat fisika kimia ................................................................................................. 7

3.2.1. Sifat fisika kimia analit ........................................................................................................ 7

3.2.2. Sifat Fisika Kimia Matriks .................................................................................................... 7

a. Vaselin Album ............................................................................................................................. 7

3.3. Metode Analisis..................................................................................................................... 12

3.4. Preparasi Sampel .................................................................................................................. 12

3.4.1. Pembuatan larutan standar .......................................................................................... 12

3.4.2. Pembuatan eluen / fase gerak ...................................................................................... 13

3.4.3. Teknik penampakan noda ............................................................................................. 13

3.4.4. Pemilihan panjang gelombang maksimum ................................................................... 13

3.4.5. Penyiapan sampel sediaan topikal gentamisin ............................................................. 14

3.5. Validasi .................................................................................................................................. 14

3.5.1. Kondisi Analisis .............................................................................................................. 14

3.5.2. Metode Validasi ............................................................................................................ 14

3.6. Aplikasi .................................................................................................................................. 16

3.6.1. Alat dan Bahan .............................................................................................................. 16

i
 3.6.2. Prosedur Kerja............................................................................................................... 16

Bab IV Kesimpulan ................................................................................................................................ 20

Daftar Pustaka....................................................................................................................................... 21

ii
 Bab I
Pendahuluan

1.1. Latar Belakang

Sediaan farmasi yang digunakan pada kulit adalah untuk memberikan aksi lokal dan
aksinya dapat bertahan lama pada tempat yang sakit dan sedikit mungkin diabsorbsi.
Penggunaan obat pada kulit dimaksudkan untuk efek lokal tidak untuk sistemik. Bentuk sediaan
yang digunakan untuk kulit adalah salep, krim, pasta dengan basis yang bermacam-macam dan
mempunyai sifat yang beragam seperti hidrofil (suka air) atau hidrofob (tidak suka air). Oleh
karena itu sediaan untuk kulit biasanya pemakaiannya pada kulit sebagai antiseptik, antifungi,
antiinflamasi dan anastetik lokal Obat topikal merupakan obat yang diberikan melalui kulit dan
membran mukosa. Obat topikal adalah obat yang mengandung 2 komponen dasar yaitu
pembawa dan zat aktif. Dimana zat aktif merupakan komponen obat yang mempunyai aktivitas
terapeutik sedangkan zat pembawa merupakan bagian inaktif yang berbentuk cairan atau padat
yang membawa bahan aktif berkontak dengan kulit. Dan idealnya zat pembawa harus mudah
dioleskan, mudah dibersihkan, dan tidak mengiritasi.
Krim merupakan sediaan setengah padat yang digunakan untuk pemakaian luar. Sediaan
krim berupa emulsi dimana formulasinya terbagi menjadi dua yaitu emulsi air dalam minyak
atau minyak dalam air. Dalam pembuatan krim dibutuhkan basis krim. Pada saat ini, banyak
yang menggunkaan krim dalam kesehariannya, salah satunya pemakaian kosmetika. Tersapat
beberapa kosmetik yang dibentuk dalam bentuk sediaan krim. Salah satu produk sediaan krim
adalah krim gentamicin. Dimana pembuatan krim ini menggunakan bahan aktif gentamicin serta
penambahan bahan tambahan seperti basis dan lain sebagainya.
Kromatografi lapis tipis merupakan metode kromatografi cair terbuka yang paling
sederhana di mana fase diam berupa lapis tipis yang terdiri atas bahan padat yang dilapisi
kepada permukaan penyangga dasar dan fase geraknya mengalir karena kerja kapiler. Pada
metode analisis KLT, beberapa persiapan harus dipenuhi untuk mendapatkan hasil pemisahan
sampel yang baik meliputi preparasi sampel, penanganan lempeng KLT, penanganan eluen,
penanganan chamber tempat elusi, aplikasi sampel, proses pengembangan sampel dan evaluasi
noda.
Berdasarkan pemaparan yang telah disampaikan mengenai gentamisin sulfat dan cara
menganalisisnya menjadi latar belakang kami dalam menuliskan makalah analisis kromatografi
penetapan kadar krim menggunakan gentamisin sulfat dengan metode Kromatografi Lapis
Tipis-Densitometri

1
1.2. Rumusan Masalah
a. Apa saja analit dan matriks pada sediaan krim Gentamisin?
b. Bagaimana sifat fisika dan kimia pada masing-masing analit dan matriks yang digunakan?
c. Apa metode analisis serta yang digunakan?
d. Bagaimana menentukan preparasi sampel?
e. Bagaimana validasi metode analisis yang digunakan?
f. Bagaimana aplikasi penentuan kadar krim gentamisin?

1.3. Tujuan penulisan

a. Dapat mengetahui analit serta matriks pada sediaan krim Gentamisin
b. Dapat mengetahui sifat fisika dan kimia dari analit dan matriks yang digunakan
c. Dapat mengetahui metode analisis yang digunakan
d. Dapat menentukan preparasi sampel
e. Dapat menentukan validasi metode analisis yang digunakan
f. Dapat melakukan penentuan kadar krim gentamisin

2
 Bab II
Teori Dasar
Krim merupakan sediaan setengah padat yang mengandung satu atau lebih bahan obat
terlarut dalam bahan dasar yang sesuai yang ditujukan untuk penggunaan topikal. Formulasi krim
bisa sebagai emulsi air dalam minyak ataupun minyak dalam air. Saat ini, emulsi minyak dalam air
lebih mengarah pada produk kosmetika dan estetika. Hal tersebut dikarenakan lebih mudah dicuci
dengan air (Ditjen POM, 1995). Krim juga digunakan untuk pengobatan, umumnya untuk mengatasi
penyakit kulit seperti jamur, infeksi atau dapat juga untu antiinflamasi (Anwar, 2012)

Untuk membuat krim harus memnuhi beberapa persyaratan pembuatan krim. Dimana,
persyaratan krim yaitu stabil dalam pemakaian, lunak, mudah dipakai, serta dapat terdistribusi
secara merata pada kulit (Widodo, 2013). Metode pembuatan sediaan ini yaitu proses peleburan
serta emulsifikasi. Dalam pembuatan krim perlunya dalam memastikan temperaturnya harus sama.
Hal ini diperlukan agar krim tidak menjadi 2 fase karena terjadinya pemisahan antara fase mintak
dan fase cair (Widodo, 2003). Penyimpanan krim umumnya dikemas dalam botol atau tube.
Umumnya kemasa botol menggunakan botol yang gelap untuk bahan obat yang peka terhadap
cahaya (Ansel, 1989).

Salah satu contoh produk krim adalah krim gentamisin. Gentamisin merupakan obat
antibiotik yang termasuk dalam golongan aminoglikosida yang didapatkan dari isolasi microspora
purpurea (Katzung, 2010). Aminoglikosida merupakan obat bakterisid yang berasal dari berbagai
spesies Streptomyces. Selain gentamisin, terdapat obat golongan aminoglikosida yang lain seperti
streptomisin, kanamisin, neomisin, amikasin, tobramisin, dan sebagainya (Katzung dkk, 2009).
Namun, yang paling banyak diminati salah satunya adalah gentamisin. Hal ini dikarenakan harga dari
gentamisin relatif terjangkau serta gentamisin efektif melawan bakteri gram positif serta bakteri
gram negatif. Sehingga, gentamisin menjadi pilihan lini pertama dalam golongan aminoglikosida
yang digunakan oleh masyarakat (Katzung, 2010).

Rute penggunaan yang tepat pada gentamisin yaitu melalui intravena, intraperitoneal, intra
muskular dan topikal. Penggunaan gentamisin tidak diberikan melalui rute oral dikarenakan absorpsi
gentamisin melalui pencernaan kurang baik, sehingga tidak disarankan pemberian untuk rute oral.
Waktu paruh gentamisin 2-3 jam (Hardjosaputra dkk, 2008)

Mekanisme kerja dari gentamisin yaitu bakterisid yang digunakan dalam menembus dinding
bakteri. Untuk menembus dinding bakteri, aminoglikosida yang bermuatan positif verikatan secara
pasif dengan membran luar dinding yang bermuatan negatif (Radigan dkk, 2009). Obat gentamisin

3
juga berikatan dengan ribosom subunit 30s dan 50s pada bakteri. Gentamisin bekerja dengan
mengganggu proses translasi sehingga terjadi kekacauan pada biosintesa protein bakteri. (Katzung,
2010)

Gentamisin adalah antibiotika golongan aminoglikosida yang secara klinis digunakan untuk
melawan bakteri gram negatif. Aktifitasnya terutama terhadap Escherichia coli, Proteus mirabilis,
dan Klebsiella sp, Morganella sp, Citrobacter sp, Serratia sp dan Enterobacter sp, Pseudomonas sp,
Acinetobacter sp dan Haemophilus influenza (Leibovici dkk, 2009). Gentamisin digunakan pada
septikemia dan infeksi berat lain yang disebabkan oleh bakteri gram-negatif aerob, infeksi saluran
kemih, infeksi saluran empedu, dan infeksi serius lain. Gentamisdin dapat dikombinasikan dengan
beta-laktam yang dapat digunakan untuk endokarditis bakterial. Gentamisin juga dapat digunakan
sebagai kemoprofilaksis pada operasi abdominal (Hardjosaputra dkk, 2008)

Efek Samping dari gentamisin yaitu neurotoksisitas, ototoksisitas (auditori dan vestibular),
nefrotoksik (meningkatkan klirens kreatinin) dengan kejadian lebih dari 10%. Edema, gatal, dan
kemerahan adalah reaksi samping yang terjadi pada kurang dari 10% pengguna. Efek samping lain
yang lebih jarang (< 1%) yaitu agranulositosis, reaksi alergi, dispnea, granulositopenia, fotosensitif,
pseudomotor serebral, dan trombositopenia (Katzung, 2010).

Untuk memisahkan campuran obat dapat menggunakan kromatografi. Kromatografi adalah

teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen
campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas)
yang menyebabkan terjadinya perbedaan migrasi dari masing-masing komponen. Perbedaan migrasi
merupakan hasil dari perbedaan tingkat afinitas masing-masing komponen dalam fase diam dan
fase gerak. Afinitas senyawa dalam fase diam dan fase gerak ditentukan oleh sifat fisika kimia dari
masing-masing senyawa. Retensi dan selektivitas kromatografi juga ditentukan oleh interaksi antara
fase diam, fase gerak dan komponen sampel yang berupa ikatan hidrogen, pasangan elektron donor
atau pasangan elektron-akseptor (transfer karge), ikatan ionion, ikatan ion-dipol, dan ikatan van der
Waals.
Kromatografi lapis tipis (KLT) tergolong kromatografi planar. KLT adalah yang metode
kromatografi paling sederhana yang banyak digunakan. Peralatan dan bahan yang dibutuhkan untuk
melaksanakan pemisahan dan analisis sampel dengan metode KLT cukup sederhana yaitu sebuah
bejana tertutup (chamber) yang berisi pelarut dan lempeng KLT. Dengan optimasi metode dan
menggunakan instrumen komersial yang tersedia, pemisahan yang efisien dan kuantifikasi yang
akurat dapat dicapai. Kromatografi planar juga dapat digunakan untuk pemisahan skala preparatif
yaitu dengan menggunakan lempeng, peralatan, dan teknik khusus.

4
Pelaksanaan analisis dengan KLT diawali dengan menotolkan alikuot kecil sampel pada salah satu
ujung fase diam (lempeng KLT), untuk membentuk zona awal. Kemudian sampel dikeringkan. Ujung
fase diam yang terdapat zona awal dicelupkan ke dalam fase gerak (pelarut tunggal ataupun
campuran dua sampai empat pelarut murni) di dalam chamber. Jika fase diam dan fase gerak dipilih
dengan benar, campuran komponen-komponen sampel bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda
selama pergerakan fase gerak melalui fase diam. Pada KLT, identifikasi awal suatu senyawa
didasarkan pada perbandingan nilai Rf dibandingkan Rf standar.

5
 BAB III
Isi

3.1. Menentukan analit dan sampel

3.1.1. Formulasi Krim Gentamisin

No Nama Bahan Jumlah
1 Gentamisin Sulfat 0,1 %
2 Vaselin Album 10%
3 Metil Paraben 0,6 %
4 Propil paraben 0,3%
5 BHT 0,1%
6 Parafin Liquid 10%
7 Alkohol ketostearat 10%
8 Aquadest 68,9%

3.1.2. Analit
• Gentamisin Sulfat

3.1.3. Matriks
• Vaselin Album : Basis krim
• Metil Paraben : Antimikroba
• Propil Parabn : Antimikroba
• BHT : Antioksidan
• Parafin Liquid : Emolien
• Alkohol ketostearat : Emulgator, Emolien
• Aquadest : Pembawa

6
3.2. Menentukan sifat fisika kimia

3.2.1. Sifat fisika kimia analit

a. Gentamisin Sulfat
• Struktur kimia :

• Rumus molekul : C21H43N5O7

• Pemerian : Serbuk; putih sampai kuning gading
• Kelarutan : Mudah larut dalam air; praktis tidak larut dalam etanol (95%) P, dalam
kloroform P dan dalam eter P.
• BM : 516.6 g/mol
• Titik didih : 1117 °C
• Titik lebur : 681 °C
• Λ max : 330 nm
• Log P : -4

3.2.2. Sifat Fisika Kimia Matriks

a. Vaselin Album
• Struktur molekul : -
• Rumus molekul : -
• Pemerian : Masa lunak, lengket, bening, putih; sifat ini tetap setelah zat dileburkan
dan dibiarkan hingga dingin tanpa diaduk. Berfluoresensi lemah, juga jika dicairkan;
tidak berbau; hampir tidak berasa
• Kelarutan : Praktis tidak larut dalam aseton, etanol. Etanol (95%) panas atau
dingin,gliserin, dan air ; larut dalam benzene, karbon disulfide, kloroform, eter,
heksana, dan minyak atsiri.

7
 • BM:-
• Titik didih : -
• Titik lebur : 38–60 °C
• Λ max : -
• Log P : -
• Inkompatibilitas : Merupakan bahan inert yang tidak dapat bercampur dengan
banyak bahan.
b. Metil Paraben
• Struktur molekul :

• Rumus molekul : C8H8O3

• Pemerian : Serbuk hablur halus; putih; hampir tidak berbau; tidak mempunyai rasa,
kemudian agak membakar diikuti rasa tebal.
• Kelarutan : Larut dalam 500 bagian air, dalam 20 bagian air mendidih, dalam 3,5
bagian etanol (95%) P dan dalam 3 bagian aseton P; mudah larut dalam eter P dan
dalam larutan alkali hidroksida; larut dalam 60 bagian gliserol P panas dan dalam
40 bagian minyak lemak nabati panas.
• BM : 152.15 g/mol
• Titik didih : 275 °C
• Titik lebur : 125-128 °C
• Λ max : 2244 nm
• Log P : 1
• Inkompatibilitas : Aktivitas antimikroba metil paraben dan paraben lainnya adalah
sangat berkurang dengan adanya surfaktan nonionik, seperti Polisorbat 80 sebagai
akibat dari micellization. Namun, propilenglikol (10%) berpotensi mengurangi
aktivitas antimikroba dari paraben dengan surfaktan nonionik dan mencegah
interaksi antara Metil paraben dan polisorbat 80. Tidak kompatible dengan bahan
lain, seperti bentonit, magnesium trisilikat, talk, tragakan, natrium alginat, minyak

8
 esensial, sorbitol, dan atropin. Metil paraben berubah warna dengan adanya besi
dan terhidrolisis oleh basa lemah dan asam kuat.
c. Propil Paraben
• Struktur molekul :

• Rumus molekul : C10H12O3

• Pemerian : Serbuk hablur putih; tidak berbau; tidak berasa.
• Kelarutan :
Aseton : mudah larut
Etanol (95%) : 1:1,1
Etanol (50%) : 1:5,6
Eter : mudah larut
Gliserin : 1:250
Minyak mineral : 1:3330
Minyak kacang : 1:70
Propilenglikol : 1: 3,9
Propilenglikol 50% : 1:110
Air 1: 4350 pada suhu 15°C,
1: 2500,
1: 225 pada 80 °C
• BM : 180.20 g/mol
• Titik didih : 295 °C
• Titik lebur : 109 °C
• Λ max : 2269 nm
• Log P : 2
• Inkompatibilitas : Aktivitas antimikroba Propil paraben akan berkurang dengan
adanya surfaktan nonionik sebagai akibat dari micellization. Propil paraben akan
diserap oleh plastik, dengan jumlah yang diserap tergantung pada jenis plastik.
Magnesium alumunium silikat, magnesium trisilikat, dan oksida besi kuning dan

9
 biru laut juga akan menyerap propil, sehingga mengurangi efektivitas pengawet.
Propil paraben berubah warna dengan adanya besi dan akan terhidrolisis oleh
alkali lemah dan asam kuat.
d. Butylated Hydroxytoluene (BHT)
• Struktur molekul :

• Rumus molekul : C15H24O

• Pemerian : Putih atau kristal kuning pucat atau serbuk dengan karakteristik bau
seperti fenol.
• Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air, gliserin, propilenglikol, larutan alkali
hidroksida dan larutan asam mineral. Larut dalam aseton, benzena, etanol 95%
eter, metanol, toluena, minyak. Lebih larut daripada butil hidroksil anisol dalam
minyak pada makanan dan lemak.
• BM : 220 g/mol
• Titik lebur : 70 °C
• Titik didih : 265 °C
• Λ max : 1413 nm
• Log P : 6
• Inkompatibilitas : Tidak kompatible dengan antioksidan kuat seperti peroksida dan
permanganat. Kontak dengan antioksida lain dapat menyebabkan pembakaran
yang spontan. Garam besi menyebkan perubahan warna dan aktivitas.
e. Paraffin Liquidum
• Struktur molekul : -
• Rumus molekul : -
• Pemerian : Cairan kental, transparan, tidak berfluoresensi; tidak berwarna; hampir
tidak berbau; hampir tidak mempunyai rasa.
• Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air dan dalam etanol (95%) P, larut dalam
kloroform P dan dalam eter P.

10
 • BM:-
• Titik didih : >360 °C
• Titik lebur : -
• Λ max : -
• Log P : -
• Inkompatibilitas : Inkompatible dengan oksidator kuat.
f. Cetostearyl Alcohol
• Struktur molekul :

• Rumus molekul : C34H72O2

• Pemerian : Massa putih atau warna krem, serpihan, pellet, atau granul.
Mempunyai karakteristik aroma manis yang lemah. Pada pemanasan, cetostearil
alcohol melebur menjadi cairan bebas bahan tersuspensi, jernih, tidak berwarna
atau kuning pucat.
• Kelarutan : Larut dalam etanol (95%), eter dan minyak; praktis tidak larut dalam air.
• BM : 512.9 g/mol
• Titik didih : 385-431 °C
• Titik lebur : 57–80 °C
• Λ max : 2312 nm
• Log P : 7
• Inkompatibilitas : Inkompatibel dengan oksidator kuat dan garam logam.
g. Aquadest
• Struktur molekul :

11
 • Rumus molekul : H2O
• Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak mempunyai rasa.
• Kelarutan :
• BM : 18 g/mol
• Titik didih : 100 °C
• Titik beku : 0 °C
• Λ max :
• Log P : -1,38
• Inkompatibilitas : Dalam formulasi farmasi, air dapat bereaksi dengan obat-obatan
dan eksipien lain yang rentan terhadap hidrolisis (dekomposisi dalam adanya air
atau uap air) pada lingkungan dan temperatur yang tinggi.Air dapat bereaksi
dengan logam alkali, logam alkali dan oksida nya dengan cepat, seperti kalsium
oksida dan magnesium oksida. Air juga bereaksi dengan garam anhidrat untuk
membentuk hidrat dari berbagai komposisi, dengan bahan organik tertentu dan
kalsium karbida.

3.3. Metode Analisis

Gentamisin terdiri dari tiga komponen yaitu gentamisin C1, gentamisin C1a dan gentamisin
C2a+2 yang sulit dipisahkan dengan cara ekstraksi atau KLT sederhana. Metode KLT-Densitometri
salah satu metode yang dikembangkan untuk pemisahan dan identifikasi komponen dalam
sediaan obat, serta mengukur kadar analit dalam sampel berdasarkan interaksi radiasi
elektromagnetik dengan analit yang ada di dalam noda pada KLT.
Metode digunakan untuk menganalisis kelompok aminoglikosida yaitu spektrofotometri,
fluorometr, GC, TLC, kapiler elektroforesis, serta radiokimia, metode radioimunologis, dan
imunoenzimatik. Farmakope Eropa, Inggris, dan Polandia merekomendasikan metode TLC
terutama untuk mengidentifikasi aminoglikosida. Metode ini memiliki ketelitian dan kepekaan
yang baik, sehingga dapat digunakan untuk sampel dalam jumlah nanogram. Sehingga
dikembangkan metode analisis gentamisin dengan KLT yang dapat dilakukan secara cepat dan
sederhana, untuk menunjang analisis pre-klinik atau uji bahan baku sebagai persyaratan
penjaminan mutu obat.

3.4. Preparasi Sampel

3.4.1. Pembuatan larutan standar

• Pembuatan larutan standar induk gentamisin dengan konsentrasi 2000 ppm dilakukan
dengan cara menimbang seksama gentamisin sulfat 100 mg, dilarutkan dalam

12
 aquadest dan dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL, diencerkan dengan
aquadestsampai tanda.
100 𝑚𝑔 𝑚𝐿
× 1000 = 2000 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿 𝐿
• Dari larutan baku induk dibuat larutan baku kerja dengan konsentrasi 10 ppm, 20
ppm, 40 ppm, 60 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm dalam labu takar 50 mL.
𝑥 𝑚𝐿
a) 50 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 10 𝑝𝑝𝑚

𝑥 = 0,25 𝑚𝐿
𝑥 𝑚𝐿
b) × 2000 𝑝𝑝𝑚 = 20 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿

𝑥 = 0,5 𝑚𝐿
𝑥 𝑚𝐿
c) 50 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 40 𝑝𝑝𝑚

𝑥 = 1 𝑚𝐿
𝑥 𝑚𝐿
d) 50 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 60 𝑝𝑝𝑚

𝑥 = 1,5 𝑚𝐿
𝑥 𝑚𝐿
e) 50 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 100 𝑝𝑝𝑚

𝑥 = 2,5 𝑚𝐿
𝑥 𝑚𝐿
f) × 2000 𝑝𝑝𝑚 = 150 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿

𝑥 = 3,75 𝑚𝐿
𝑥 𝑚𝐿
g) 50 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 200 𝑝𝑝𝑚

𝑥 = 5 𝑚𝐿

3.4.2. Pembuatan eluen / fase gerak

• Ditimbang seksama 10 gram KH2PO4
• Dilarutkan dalam aquadest dan dimasukkan labu takar 50 mL
• Diencerkan dengan aquades sampai tanda, diperoleh larutan KH2PO4 20%

3.4.3. Teknik penampakan noda

• Dilakukan secara kimia, yaitu dengan cara pencelupan pelat KLT secara cepat ke dalam
larutan ninhidrin 0,2% (b/v) dalam etanol 96%
• Kemudian dipanaskan pada suhu 100˚C selama 5-10 menit

3.4.4. Pemilihan panjang gelombang maksimum

Larutan baku kerja gentamisin dalam air suling untuk masing-masing konsentrasi
ditotolkan sebanyak 6μL pada pelat silikagel GF254. Setelah totolan kering, pelat
dimasukkan ke dalam masing-masing bejana kromatografi yang berisi larutan

13
 pengembang KH2PO4 pada rentang konsentrasi 5% - 25%. Apabila larutan pengembang
telah mencapai batas elusi (eluent front), pelat diangkat dari bejana dan dikeringkan
dengan aliran udara pada suhu kamar. Setelah kering, pelat dicelupkan dengan cepat ke
dalam bejana yang berisi larutan ninhidrin. Pelat diangkat dari bejana, setelah kering
dipanaskan pada suhu 100°C selama 5-10 menit. Panjang gelombang maksimum setiap
noda diamati pada densitometer.

3.4.5. Penyiapan sampel sediaan topikal gentamisin

• Ditimbang seksama 10 gram krim
• Selanjutnya diekstrasi tiga kali dengan aquadest sebanyak 15 mL dalam erlenmeyer
dan dikocok dengan sonikator selama 10 menit
• Ekstrak yang diperoleh dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar 50,0 mL
• Lalu ditambah aquadest sampai tanda
• Setelah dikocok homogen, larutan disaring, filtrat pertama dibuang dan filtrat
selanjutnya ditampung

3.5. Validasi

3.5.1. Kondisi Analisis

- Pelarut : aquadest
- Fase diam : silika gel F254
- Fase gerak : KH2PO4 20% (b/v)
- Konsentrasi uji : 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200 ppm
- Penampak noda : ninhidrin 2% dalam etanol 96%
- 𝜆pengamatan : 400 nm
- Visualisasi hasil : densitometer

3.5.2. Metode Validasi

Validasi merupakan tahapan untuk membuktikan bahwa suatu sediaan memberikan
tingkat kepastian yang tinggi bahwa metode tertentu akan menghasilkan produk secara
konsisten agar memenuhi spesifikasi yang telah ditentukan sebelumnya. Metode validasi
berupa parameter yang berbeda seperti selektivitas, linieritas, limit deteksi, limit
kuantitasi, akurasi dan presisi.
a. Linieritas
Larutan baku kerja gentamisin dari masing-masing konsentrasi ditotolkan
sebanyak 6 µL pada pelat silikagel GF254 dengan jarak antar totolan 1,5 cm,

14
 selanjutnya dielusi sama dengan cara di atas, dan dilakukan pengukuran luas noda
pada panjang gelombang maksimum. Dari hasil pengukuran ditentukan koefisien
korelasi yang menyatakan hubungan antara kadar dan luas noda.
b. Selektivitas
Uji selektivitas larutan pengembang dilakukan dengan cara pemilihan
konsentrasi fase gerak yang dapat menghasilkan harga Rf memenuhi syarat. Dari
kelima macam konsentrasi larutan pengembang KH2PO4, maka dipilih larutan KH2PO4
20% (b/v) dalam air suling, karena menghasilkan harga Rf pada rentang 0,3-0,7.
Apabila Rf yang dihasilkan berada di bawah rentang, maka noda yang terukur akan
memberikan puncak sempit dan sangat runcing, sehingga tidak menggambarkan
konsentrasi sebenarnya. Begitu pula bila Rf berada di atas rentang, akan dihasilkan
noda semakin melebar dan memberikan puncak yang lebar, sehingga diperoleh hasil
yang tidak valid bila diukur dengan densitometer. Semakin panjang jarak yang tempuh
eluen, semakin baik proses pemisahan komponen gentamisin, begitu pula sebaliknya.
c. Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantification (LOQ).
LOD adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat diketahui
tanpa perlu diukur. Limit LOQ adalah konsentrasi minimum analit yang dapat diukur
dengan presisi yang sesuai. Larutan baku kerja gentamisin dengan konsentrasi 50
μg/mL ditotolkan hingga jumlah atau volume totolan terkecil sampai noda tidak
teramati secara visual, tetapi alat masih memberikan respon sampai jumlah totolan
tertentu. Setelah dilakukan elusi dan penampakan noda, noda diamati pada panjang
gelombang maksimum dan luas noda diukur.
Batas deteksi (LoD) untuk gentamisin adalah 0,019 µg dan batas kuantitasi (LoQ)
adalah 0,064 µg. Berdasarkan data ini, gentamisin dapat terdeteksi dan ditentukan
apabila kadarnya lebih besar atau sama dengan LoD. Kadar gentamisin dalam sediaan
krim ±0,1% b/v.
d. Presisi
Pada penentuan presisi yang dilakukan dengan penotolan sebanyak 10 kali
dengan volume yang sama. Persyaratan presisi yang umum dan yaitu lebih kecil dari
2%, sedangkan untuk densitometri harga KV lebih kecil dari 5% sudah dianggap
memuaskan. Oleh karena itu, walaupun harga KV gentamisin lebih besar dari 2%,
namun masih memenuhi syarat untuk metode densitometri.
e. Akurasi

15
 Keakuratan prosedur analitis merupakan kedekatan antara nilai yang diterima
baik sebagai nilai sebenarnya (konvensional) atau nilai referensi yang diterima dan
nilai yang ditemukan. Pada penetapan kadar untuk penentuan akurasi, persen
perolehan untuk berbagai macam kadar baku gentamisin memenuhi harga yang
dipersyaratkan secara umum yaitu 95-105 %.

3.6. Aplikasi

3.6.1. Alat dan Bahan

a. Alat:
• Spektrofotometer FTIR
• Shimadzu Dual-Wavelength Chromato Scanner Model CS-930
• Neraca analitik
• Labu takar
• Pipet mikro
• Sonikator
• Bejana kromatografi 20 x 20 x 6 cm3
• Oven
b. Bahan:
• Standar gentamisin sulfat
• Gentamisin sulfat 0,1 %
• Etanol 96%
• Etanol p.a
• Aquadest
• BaCl2
• CaCl2
• Ninhidrin
• KH2PO4
• Pelat KLT Silicagel GF254

3.6.2. Prosedur Kerja

a. Pembuatan larutan standar
• Menimbang seksama gentamisin sulfat 100 mg, dilarutkan dalam aquadest dan
dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL, diencerkan dengan aquadest sampai tanda,
diperoleh larutan standar gentamicin dengan konsentrasi 2000 ppm

16
 • Dari larutan baku induk dibuat larutan baku kerja dengan konsentrasi 10 ppm,
20ppm, 40ppm, 60ppm, 100 ppm, 150 ppm, dan 200 ppm
b. Preprasi eluen / fase gerak
• Ditimbang seksama 10 gram KH2PO4
• Dilarutkan dalam aquadest dan dimasukkan labu takar 50 mL
• Diencerkan dengan aquades sampai tanda, diperoleh larutan KH2PO4 20%
c. Teknik penampakan noda
• Dilakukan secara kimia, yaitu dengan cara pencelupan pelat KLT secara cepat ke
dalam larutan ninhidrin 0,2% (b/v) dalam etanol 96%
• Kemudian dipanaskan pada suhu 100˚C selama 5-10 menit
d. Penyiapan sampel sediaan topikal gentamisin
• Ditimbang seksama 10 gram krim
• Selanjutnya diekstrasi tiga kali dengan aquadest sebanyak 15 mL dalam erlenmeyer
dan dikocok dengan sonikator selama 10 menit
• Ekstrak yang diperoleh dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar 50,0 mL
• Lalu ditambah aquadest sampai tanda
• Setelah dikocok homogen, larutan disaring, filtrat pertama dibuang dan filtrat
selanjutnya ditampung
e. Eluasi Larutan Standar dan Larutan Sampel
• Siapkan lempeng KLT (diusahakan jangan mengotori lempeng KLT dan dipastikan
tangan bersih dan kering)
• Totolkan 6L larutan standar gentamisin sulfat pada lempeng KLT dengan
menggunakan pipet kapiler 3 totolan.
• Totolkan 6L larutan sampel pada lempeng KLT dengan menggunakan pipet kapiler
3 totolan.
• Pastikan chamber jenuh (kertas saring terbasahi eluen semua), lalu masukkan
lempeng KLT ke dalam chamber dengna menggunakan pinset.
• Tunggu eluasi lempeng KLT sampai garis batas, lalu ambil.
• Keringkan lempeng KLT dengan alat pengering.
• Scanning lempeng KLT dengan densitometer camag.
• Scan purity dan identity serta hitung kadar Gentamisin sulfat pada sampel krim.

17
f. Perhitungan
• Pembuatan larutan standar induk gentamisin konsentrasi 2000 ppm
100 𝑚𝑔 𝑚𝐿
× 1000 = 2000 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿 𝐿
• Pembuatan larutan standar
a) Konsentrasi 10 ppm

𝑥 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 10 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿

𝑥 = 0,25 𝑚𝐿
b) Konsentrasi 20 ppm
𝑥 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 20 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿
𝑥 = 0,5 𝑚𝐿
c) Konsentrasi 40 ppm
𝑥 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 40 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿
𝑥 = 1 𝑚𝐿
d) Konsentrasi 60 ppm
𝑥 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 60 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿
𝑥 = 1,5 𝑚𝐿
e) Konsentrasi 100 ppm
𝑥 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 100 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿
𝑥 = 2,5 𝑚𝐿
f) Konsentrasi 150 ppm
𝑥 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 150 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿
𝑥 = 3,75 𝑚𝐿
g) Konsentrasi 200 ppm
𝑥 𝑚𝐿
× 2000 𝑝𝑝𝑚 = 200 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿
𝑥 = 5 𝑚𝐿
• Larutan Sampel
Setiap 5 mg mengandung gentamisin sulfat 0,1 %
10 𝑚𝑔
× 1000 𝑝𝑝𝑚 = 200 𝑝𝑝𝑚
50 𝑚𝐿
Diencerkan menjadi

18
50 𝑚𝐿 × 200 𝑝𝑝𝑚 = 𝑥 𝑚𝑙 × 1000 𝑝𝑝𝑚
𝑥 = 0,1 𝑚𝐿

19
 Bab IV
Kesimpulan
• Krim merupakan sediaan setengah padat yang mengandung satu atau lebih bahan obat terlarut
dalam bahan dasar yang sesuai yang ditujukan untuk penggunaan topikal. Formulasi krim bisa
sebagai emulsi air dalam minyak ataupun minyak dalam air.
• Gentamisin merupakan obat antibiotik yang termasuk dalam golongan aminoglikosida yang
didapatkan dari isolasi microspora purpurea (Katzung, 2010). Aminoglikosida merupakan obat
bakterisid yang berasal dari berbagai spesies Streptomyces. Gentamisin adalah antibiotika
golongan aminoglikosida yang secara klinis digunakan untuk melawan bakteri gram negatif.
• Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan
fase gerak (cair atau gas) yang menyebabkan terjadinya perbedaan migrasi dari masing-masing
komponen. Perbedaan migrasi merupakan hasil dari perbedaan tingkat afinitas masing-masing
komponen dalam fase diam dan fase gerak.
• Kondisi analisis pada uji ini adalah:
- Pelarut : aquadest
- Fase diam : silika gel F254
- Fase gerak : KH2PO4 20% (b/v)
- Konsentrasi uji : 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200 ppm
- Penampak noda : ninhidrin 2% dalam etanol 96%
- 𝜆pengamatan : 400 nm
- Visualisasi hasil : densitometer
• Larutan standar yang digunakan yaitu larutan dengan konsentrasi sebesar 2000 ppm

20
 Daftar Pustaka
Rowe, Raymond C. 2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 6th ed. London: Pharmaceutical
Press.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2008. Farmakope Indonesia edisi V, Jakarta:
Departemen Kesehatan.
Sweetman, S.C. 2009. Martindale The Complete Drug Reference 36. London: Pharmaceutical Press
Hubicka, U., Krzek, J., Woltyska, H., & Stachacz, B. 2009. Simultaneous Identification and
Quantitative Determination of Selected Aminoglycoside Antibiotics by Thin-Layer
Chromatography and Densitometry. Journal of AOAC INTERNATIONAL, 92(4), 1068–1075
Isnaeni, A. Burhanudin, A. T. Poernomo. 2016. Penetapan Kadar Gentamisin dalam Sediaan Krim
dengan Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri. Pharmaciana Vol. 6, No. 2, 107-116
Wulandari, L. 2011. Kromatografi Lapis Tipis. Jember: PT Taman Kampus Presindo.
Anwar. 2012. Eksipien Dalam Sediaan Farmasi Karakterisasi dan Aplikasi. Jakarta: Penerbit Dian
Rakyat
Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia IV. Jakarta: Depkes RI
Widodo, Hendra. 2013. Ilmu Meracik Obat untuk Apoteker. Jogjakarta: D-Medika.
Abubakar, Tribudhi M., Widodo S. 2003. Pengaruh Penambahan Aroma dan Penggunaan Jenis Gula
Terhadap Mutu Organoleptik Susu Pasteurisasi. Seminar Nasional dan Pertemuan Tahunan
Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia (PATPI). Yogyakarta.
Ansel, H.C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Jakarta: UI Press.
Katzung, Bertram G. 2010. Farmakologi Dasar dan Klinik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC
Katzung, B.G., Masters, S.B., Trevor, A.J. 2009. Basic & Clinical Pharmacology, 11th Ed. New York:
McGraw-Hill
Hardjosaputra, S.L., dkk. .2008. Data Obat di Indonesia. Jakarta: PT. Muliapurna Jayaterbit.
Leibovici, L., L. Vidal ., M. Paul. 2009. Aminoglycosides drugs in clinical practice : an evidence
approach. Journal of Antimicrobial Chemotherapy

21