LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PANGAN DAN PENGOLAHAN

ACARA 7
Penyimpanan  Mikrobia Industri Lactobacillus Plantarum Dengan Pembekuan Lambat
Suhu -25◦C  Menggunakan Cryoprotectant ( Gliserol 10% Dan Sukrosa 10%)

Disusun Oleh:

Nama : Devinta Berliana Puteri

NIM : 19/446856/TP/12659
Gol/Kel : 1/6
Hari, tanggal : Rabu,11 November 2020
Nama Asisten : Angela Yubiliana

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

DEPARTEMEN TEKNOLOGI PANGAN DAN HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS GADJAH MADA

2020
Penyimpanan  Mikrobia Industri Lactobacillus Plantarum Dengan Pembekuan Lambat
Suhu -25◦C  Menggunakan Cryoprotectant ( Gliserol 10% Dan Sukrosa 10%)

I. Tujuan

1. Praktikan dapat melakukan penyimpanan mikrobia industri (kultur

lactobacillus plantarum) dengan pembekuan lambat suhu -25◦C 

2. Praktikan dapat mengevaluasi jenis cryoprotectant mana yang lebih efektif

untuk pembekuan lambat suhu -25◦C 

II. Logbook

Hari/Tanggal Cara Kerja Keterangan

Senin, 21
September
2020
 Rabu, 23
September
2020

Enumerasi Sel :

III. Pembahasan
 Menurut Rohana (2002) pembekuan adalah pemindahan panas dari bahan yang di
sertai dengan perubahan fase cair kepada, dan merupakan salah satu proses
pengawetan yang umum dilakukan untuk penanganan bahan pangan. Tujuan
pendinginan ini adalah agar berbagai mikrobia yang mempunyai berbagai potensi
di bidang industri dapat terjaga potensinya agar stabil. sehingga dapat dikatakan
bahwa tujuannya adalah agar proses produksi dapat berlangsung secara kontinu
atau tidak terjadi perubahan sifat pada mikrobia yang mampu mengganggu proses
produksi karena potensinya stabil. pada praktikum ini pembekuan dilakukan pada
bakteri lactobacillus plantarum.

Sardjono (1988) menyatakan terdapat tiga jenis pembekuan berdasarkan lajunya,

yaitu:

1. Pembekuan lambat:  laju pembekuannya <10◦C /menit. Konsentrasi larutan

nya lebih pekat dan terjadi plasmolisis atau keluarnya cairan sel yang dapat
menyebabkan kematian sel pada pembekuan lambat, terbentuknya kristal es
berukuran relatif besar. Hal ini menyebabkan konsentrasi zat di luar sel menjadi
meningkat titik terdapatnya beda potensial ini didalam dan diluar sel sehingga
cairan sel keluar (plasmolisis). kristal es yang terbentuk pun berukuran besar
terjadi karena permeabilitas membran tinggi sehingga Sel akan membeku melalui
pembekuan kristal es secara ekstraseluler dan terjadi plasmolisis sel kemudian
mengalami dehidrasi.

2. Pembekuan cepat:   laju pembekuannya 10-100◦C/menit. Terbentuknya kristal

es di dalam dan di luar sel ukurannya beragam namun tidak sebanyak pada
pembekuan lambat. terjadi pemekatan karena sebagian air di dalam sel
mengkristal, menyebabkan sel mengalami plasmolisis, namun tidak sebanyak
plasmolisis pembekuan lambat.

3. Pembekuan sangat cepat:  laju pembekuannya >1000◦C/menit.  Pembekuan

ini, lajunya sangat cepat menyebabkan terjadinya pembentukan kristal es secara
intraseluler karena baru permeabelitas sel sangat rendah kristal yang terbentuk di
dalam dan di luar sel seimbang serta kristal es nya berukuran kecil. perbedaan
tekanan atau beda potensial sangat kecil atau tidak ada, sehingga tidak terjadi
plasmolisis sel.

Cryopreservation adalah pemeliharaan bahan biologi pada suhu -80◦C

dibawahnya. Tahapan suatu cryopreservation dimulai dari tahap hipotermi, tahap
Glassy, dan sebaliknya untuk mencairkan kembali melalui proses thawing
(Effendi, 2009). Sedangkan, Cryoprotectan  adalah zat yang dapat menghambat
pertumbuhan kristal es, sehingga, mampu mempertahankan viabilitas sel selama
pembekuan.  Cryoprotectan memiliki kelarutan yang cukup tinggi di air yang
berfungsi untuk melindungi sel dari kerusakan yang disebut yang mungkin terjadi
selama proses pembekuan dengan mencegah pembentukan kristal es pada sel
(Porcu, 2001).

Cryoprotectant terbagi menjadi dua jenis, koligatif dan non koligatif. menurut
(Porcu,2001), dalam keadaan normal, titik beku (Tf) sama dengan titik leleh (Mp).
Mekanisme Cryoprotectant koligatif akan menurunkan Fp dan MP.  Namun,
Cryoprotectant non koligatif akan mengurangi FP dan membiarkan Mp seperti
dalam keadaan normal.  Berikut penjelasan lebih lanjutnya:

1. Cryoprotectant Non koligatif: Cryoprotectant yang tidak dapat terpenetrasi ke

dalam sel sehingga digunakan konsentrasi rendah contoh: Sukrosa, skim milk,
dextran. Selama pembekuan, Cryoprotectant akan mengurangi pembentukan
kristal es ekstraseluler. pembentukan kristal es ekstraseluler yang menurun
mengakibatkan tidak akan ada terjadinya perbedaan tekanan atmosfer antara
cairan didalam dan diluar sel sehingga kematian sel akibat lisis karena difusi
dapat diturunkan (Mazur,1969).

2. Cryoprotectant Koligatif: Cryoprotectant yang dapat terpenetrasi ke dalam sel

sehingga dapat memengaruhi titik bekusistem pada penggunaan dengan
konsentrasi tinggi. Jenis ini cocok untuk pembekuan cepat. Contoh: glisrol,
dimethyl sulfoxide, glukosa (Mazur,1969). Selama proses
pembekuan,Cryoprotectant akan terpenetrasi kedalam sel  karena sifatnya yang
lipofilik terhadap membran fosfolipid. dari perbedaan konsentrasi antara bagian
dalam dan luar sel dengan masuknya Cryoprotectant sel, konsep konsentrat cair
 aki meningkat beku berkurang akan menurunkan pembentukan kristal es sehingga
menurunkan kerusakan sel akibat pembekuan, dimana kristal es di dalam sel akan
mendesak membran sitoplasma karena terjadinya kerusakan membran maka akan
mengurangi tingkat selektifitas sel tersebut. (Porcu,2001)

Lactobacillus plantarum adalah anggota genus lactobacillus yang tersebar luas,

umumnya ditemukan dalam banyak produk makanan fermentasi serta materi
tanaman anaerobik. lactobacillus adalah bakteri gram positif berbentuk basil
dengan ujung sel batangnya bulat- lurus, panjangnya 3-8µm (Landae, dkk., 2010).

Lactobacillus plantarum dikenal diantara bakteri asam  laktat dan merupakan

spesies yang sangat fleksibel dan serbaguna kemampuannya memungkinkannya
untuk tumbuh di mana saja pada suhu 15-45◦C pH 3,2 atau lebih (De Vries, dkk.,
2011).

Penerapan Lactobacillus plantarum di industry pengolahan pangan salah satunya

bakteriosin pada Lactobacillus plantarum dapat digunakan sebagai bahan
pengawet dalam produk bakso.

a. Tabulasi Data Sebelum Pembekuan

Ulangan
Seri Pengenceran
1 2

10−6 69 51

10−7 10 -

10−8 - -

CFU/ml 6,00 x 107

Berdasarkan hasil percobaan, jumlah Lactobacillus plantarum sebelum

pembekuan adalah 6,00 x 107CFU/ml
b. Tabulasi data setelah pembekuan dengan cryoprotectant dan aquades

Seri Aquades Gliserol 10% Sukrosa 10%

Pengeceran 1 2 1 2 1 2

10−4 486 684 192 178 1524 744

10−5 144 144 45 75 192 236

10−6 18 14 6 11 36 24

CFU/ml 1,44 x 10 7 1,85 x 106 2,87 x 10 7

c. Tabulasi data %viabilitas setelah pemebekuan dengan cryoprotectant dan

aquades

Jumlah Sel Rata- Jumlah Sel Rata-

Rata Sebelum Rata Setelah
Perlakuan %Viabilitas
Pembekuan Pembekuan
(CFU/ml) (CFU/ml)

Aquades 1,44 x 10 7 24%

Gliserol 10% 6,00 x 107 1,85 x 106 3,08%

Sukrosa 10% 2,87 x 10 7 47,83%

Berikut adalah perhitungan viabilitas sel Lactobacillus Plantarum secara rata rata:
a. Aquades
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan 1,44 x 107
%Viabilitas= x 100 %= = 24%
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan 6,00 x 107

b. Gliserol 10%
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan 0,185 x 10 7
%Viabilitas= x 100 %= =
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan 6,00 x 10 7
3,08%
 c. Sukrosa 10%
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan 2,87 x 107
%Viabilitas= x 100 %= =¿
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan 6,00 x 107
47,83%

Berikut adalah perhitungan penurunan log cycle sel Lactobacillus plantarum:

a. Aquades

Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan

Penurunan log Cycle =log
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan

6,00 x 107
¿ log =0,619
1,44 x 107

b. Gliserol 10%
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan
Penurunan log Cycle =log
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan
6,00 x 107
¿ log =1,510
0,185 x 107

c. Sukrosa 10%
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan
Penurunan log Cycle =log
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan
6,00 x 107
¿ log =0,320
2,87 x 107

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat diurutkan % viabilitas sel dari
yang paling besar ke paling kecil adalah Sukrosa 10%> Aquades > Gliserol 10%.
Jika dilihat, penurunan log cycle pada tiap cryoprotectantnya adalah :
 1) Sampel yang ditambahakan cryoprotectant aquades dapat mempertahankan
jumlah sel atau tidak mengalami penurunan atau penambahan log cycle
2) Sampel yang ditambahakan cryoprotectant gliserol 10% mengalami penurunan
log cycle sebanyak 1 log cycle dari 107 ke 106
3) Sampel yang ditambahakan cryoprotectant sukrosa 10% dapat mempertahankan
jumlah sel atau tidak mengalami penurunan atau penambahan log cycle.

Keefektifan Cryoprotectant dapat dilihat dari % viabilitas selnya. dapat diketahui

dengan melihat data rerata viabilitas di atas diperoleh rata-rata %viabilitas gliserol
10% adalah 3,08%, sukrosa 10% adalah 47,83%, dan aquades adalah 24%. %
viabilitas dapat diperoleh dari rumus dibawah ini :

Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan

%Viabilitas= x 100 %
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan

Jumlah sel sebelum dan setelah pembekuan didapat dari rata-rata jumlah
sel penelitian. Jika dibandingkan dengan teori yang ada, cryoprotectant yang tepat
digunakan untuk proses pembekuan lambat ialah sukrosa 10%. hal ini terjadi
karena di pembekuan lambat kristal es terbentuk pada lingkungan eksternal
sehingga cryoprotectant non koligatif tepat digunakan karena melindungi sel dari
luar agar tidak terjadi pengkristalan di luar(Mazar,1969). Hasil percobaan telah
sesuai dengan teori karena pada hasil percobaan sukrosa 10% menduduki
peringkat pertama cryoprotectant terbesar, sehingga dianggap paling efektif untuk
pembekuan jenis lambat ini. menurut Sudarmadji (2005), cryoprotectant sukrosa
ini bekerja dengan mengikat air di luar sel menjaga keseimbangan solute diluar
dan didalam sel yang cocok lambat dengan cara menyelimuti sel di bagian luar
sehingga mencegah plasmolisis. tetapi seharusnya urutan persen viabilitas mulai
yang tertinggi yaitu pada penambahan sukrosa 10%, gliserol 10%, kemudian
aquades. Hasil percobaan menyimpang dari teori dan urutan persen viabilitas
yaitu gliserol 10% adalah 3,08%, aquades adalah 24%, dan sukrosa 10% adalah
47,83%. Hal ini dapat dikarenakan waktu penyimpangan kultur hanya beberapa
hari(± 2 hari) sehingga keefektifan cryoprotectant melindungi sel belum dapat
 diamati, selain % viabilitas gliserol yang sangat rendah bisa terjadi karena gliserol
dapat bersifat toksik dan jika dibiarkan tercampur dengan kultur terdapat
kemungkinan berkurangnya % viabilitas yang cukup signifikan.

Pada percobaan ini seri pengecerannya berbeda setelah dengan sebelum karena
sewaktu praktikan melakukan pengujian ini, sebelum pembekuan praktikan belum
mengetahui berapa jumlah sel yang kana tumbuh maka praktikan menggunakan
seri pengenceran seperti tahun lalu, namun setelah dilakukan pengujiaan ternyata
hasil yang didapat tidak sesuai ekpektasi yaitu jumlah koloninya hanya sedikit.
Kemudian, dilakukan diskusi, sehingga ditetapkan bahwa setelah pembekuan
dilakuakan kenaikan seri pengenceran agar hasilnya dapat dihitung dalam laporan.
Penyimpangan penyimpangan ini seprti sel yang tidak tumbuh di cawan petri atau
penyimpangan lainnya dapat terjadi mungkin karena kurang homogennya larutan
yang berisi bakteri lactobacillus plantarum dengan seri pengenceran yang
beragam atau pemipetan sampel kurang teliti atau kurang akurat atau pada saat
dilakukan metode pour plate dengan media MRS, pemanasan pada MRS terlalu
panas sehingga menyebabkan sel mati karena suhu pada MRS terlalu tinggi atau
karena persiapan yang kurang matang setelah kultur dikeluarkan dari suhu rendah
untuk di uji.

IV. Kesimpulan
Penyimpanan bakteri dengan pembekuaan dapat ditambahkan dengan
cryoprotectant untuk menjaga sel dari plasmolysis akibat pembentukan kristal es
eksternal maupun internal. Cryoprotectant paling efektif adalah sukrosa 10%
karena % viabilitasnya paling besar.

Jumlah Sel Rata-Rata

Jumlah Sel Rata-Rata Setelah
Perlakuan Sebelum Pembekuan
Pembekuan (CFU/ml)
(CFU/ml)

Aquades 1,44 x 10 7

Gliserol 10% 6,00 x 107 1,85 x 106

Sukrosa 10% 2,87 x 10 7

 % viabilitas untuk setipa perlakuan

Perlakuan %viabilitas rata rata

Penambahan Aquades 24%

Penambahan Sukrosa 10% 47,83%

Penambahan gliserol 10% 3,08%

Sehingga, dapat diurutkan % viabilitas sel dari yang paling besar ke paling kecil
adalah Sukrosa 10% > Aquades > Gliserol 10%, namun urutan % viabilitas yang
benar adalah Sukrosa 10% > Gliserol 10% > Aquades. Sehingga, dapat
disimpulkan apabila dilakukan penambahan gliserol dan sukrosa maka seharusnya
cryoprotectant dapat lebih efektif dalam melindungi sel dari luar pada uji
pemebekuan lambat ini sedangkan penambahan aquades kurang efektif jika
ditambahkan untuk melindungi sel dari luar pada uji pembekuan lambat ini. Hal
itu disebabkan karena apabila log cycle nya semakin kecil maka cryoprotectant
tersebut semakin baik dalam melindungi sel dari luar agar tidak terjadi
pengkristalan diluar sel dan jika %viabilitas nya semakin besar maka
cryoprotectant tersebut juga semakin baik dalam melindungi sel dari luar agar
tidak terjadi pengkristalan diluar sel.

V. Daftar Pustaka

Porcu,E., Fabbri,R., Marsella et al. 2001. Human Oocyte Cryoproservation : New

Prespective Regarding Oocyte Survival. Human Reprod 16: 411-416

Rohannah,A. 2002. Pembekuan. Univeristas Sumatera Utara Medan

Sardjono dan D. Wibowo. 1987/1988. Mikrobiologi Pengolahan Pangan.

Yogyakarta: PAU Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada.

Sumardji,s. 2005. Mikrobiologi Pangan. Yogyakarta : PAU Pangan Gizi UGM

Journal:
 De vries, Maaike,C., Vaughan, Elaine,E., Kleerebezem,M., Devos,W.M. 2006.
Lactobacillus Plantarum Survival Functional And Potential Probiotic Properties
In The Human Intestinal Tract. International dairy Journal. 1619:1018-1028

Landele, J.M., Rodriguez, H., Curiel, J.A, Delas Rivas,B., Defelipe,F.L,

Munoz,R. 2010. Degradation Of Phenofelic Compounds Foundin Olive Product
By Lactobacillus Plantarum Strains. Olives and olive oil in Healthand Disease
Prevention.

Mazur, Peter. 1969. Physical and Chemical Basil of Injury in Single Cell.
London: Academic Press.

VI. Lembar Pengesahan

Yogyakarta, 22 September 2020

Asisten Praktikum, Praktikan,

(Angela Yubiliana) (Devinta Berliana P.)

19/446856/TP/12659

VII. Lampiran

a. Perhitungan
1. Sebelum pembekuan

69+51
Jumlah Sel= −6
=6,00 x 10 7
2 x 1 x 10

2. Setelah Pembekuan
a. Aquades
 144+144
Jumlah Sel= −5
=1,44 x 107
2 x 1 x 10

b. Gliserol 10%

192+178
Jumlah Sel 10−4 = −4
=1,85 x 106
2 x 1 x 10

45+ 75
Jumlah Sel 10−5= −5
=0,6 x 10 7
2 x 1 x 10

0,6 x 107
¿ =3,243lebih dari 2 maka pakai kons . pekat
1,85 x 106

= 1,85 x 106 CFU/mL

c. Sukrosa 10%

192+236
Jumlah Sel 10−5= −5
=2,14 x 107
2 x 1 x 10

36
Jumlah Sel 10−6= −6
=3 , 6 x 107
1 x 1 x 10

3 , 6 x 107
¿ =1,68 kurang dari2 maka pakai ratarata hasil
2,14 x 107
 3 ,6 x 107 +2,14 x 10 6 7
= =2,87 x 10 CFU /mL
2

3. % Viabilitas

a. Aquades
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan 1,44 x 107
%Viabilitas= x 100 %= = 24%
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan 6,00 x 107

b. Gliserol 10%
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan 0,185 x 10 7
%Viabilitas= x 100 %= =
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan 6,00 x 10 7
3,08%

c. Sukrosa 10%
Jumlah Sel Rata−Rata Setelah Pembekuan 2,87 x 107
%Viabilitas= x 100 %= =¿
Jumlah Sel Rata−Rata Sebelum Pembekuan 6,00 x 107
47,83%

b. Hasil Diskusi
- Pada pengamatan sebelum pembekuan, di seri pengenceran 10-7 dan 10-8 ada yang
tidak terdapat sel Lactobacillus plantarum. Hal ini dapat disebabkan oleh jumlah sel
yang diinokulasi semakin sedikit , ketika pemvortexan kurang homogen, sel bakteri
tidak terambil, MRS panas sehingga sel mati, atau kultur awal yang tadinya disimpan
di suhu rendah lalu sebelum perlakuan dikeluarkan terlebih dahulu sehingga kultur
bisa mati.
- Pada percobaan ini seri pengecerannya berbeda setelah dengan sebelum karena
sewaktu praktikan melakukan pengujian ini, sebelum pembekuan praktikan belum
mengetahui berapa jumlah sel yang kana tumbuh maka praktikan menggunakan seri
pengenceran seperti tahun lalu, namun setelah dilakukan pengujiaan ternyata hasil
yang didapat tidak sesuai ekpektasi yaitu jumlah koloninya hanya sedikit. Kemudian,
dilakukan diskusi, sehingga ditetapkan bahwa setelah pembekuan dilakuakan
kenaikan seri pengenceran agar hasilnya dapat dihitung dalam laporan.