Homeostasis, pertumbuhan dan reproduksi krustasea berada di bawah kendali endokrin seperti yang

terjadi pada hewan lain. Identifikasi hormon krustasea dan penjelasan mekanisme pengaturan
hormon telah dilakukan secara luas. Mekanisme yang ditemukan sebagian mirip, tetapi juga sangat
berbeda dari serangga, walaupun kedua kelompok hewan tersebut adalah arthropoda. Penggerusan
pada serangga, misalnya, secara positif diatur oleh hormon prothoracicotropic (PTTH), yang
disekresikan oleh kompleks otak / korpora allata dan merangsang kelenjar prothoracic untuk
mendorong sintesis dan sekresi ekdisteroid. Di sisi lain, molting di krustasea diatur secara negatif
oleh moltinhibiting hormone (MIH), yang disekresikan oleh kompleks organ X / kelenjar sinus dan
menekan organ Y dari mensintesis ecdysteroid selama periode intermolt. Oleh karena itu, agak sulit
untuk menjelaskan mekanisme fisiologis sepenuhnya pada krustasea hanya berdasarkan hasil yang
diperoleh pada serangga. Menggunakan bukti eksperimental, kami sejauh ini melihat ke dalam peran
hormon mata krustasea dan hormon kelenjar androgenik (AGH). Berbagai hormon eyestalk telah
diisolasi dari kelenjar sinus dan ditandai: mis., Hormon hiperglikemik krustasea (CHH), MIH, hormon
penghambat vitellogenesis (VIH), hormon konsentrat pigmen merah (RPCH) dan hormon pendispersi
pigmen (PDH). CHH, MIH dan VIH secara struktural serupa, membentuk keluarga CHH. Serangga juga
memiliki molekul yang mirip dengan CHH, RPCH dan PDH, tetapi fungsinya berbeda. Selain itu, AGH
telah dipelajari terutama menggunakan isopoda terestrial. Di sini, kami menggambarkan keadaan
saat ini dari pemahaman kami tentang struktur dan fungsi hormon peptida ini, dan mendiskusikan
perspektif masa depan.

Sekitar 25.000 spesies krustasea sejauh ini telah diidentifikasi dan dicatat di Bumi, dan sebagian
besar dari spesies ini hidup di air tawar atau air laut, sementara sejumlah kecil spesies tinggal di
darat. Beberapa spesies krustasea termasuk udang dan kepiting memiliki kepentingan komersial
dalam perikanan dan akuakultur, sementara yang lain memainkan peran kunci sebagai perantara
dalam rantai makanan, menghubungkan phytoplankton dan ikan dalam ekosistem perairan.
Budidaya udang modern pertama kali didirikan di Jepang lebih dari 50 tahun yang lalu menggunakan
udang kuruma Marsupenaeus (sebelumnya Penaeus) japonicus, yang merupakan salah satu spesies
komersial paling penting di Jepang, dan teknik akuakultur kini telah menyebar ke banyak negara,
terutama di daerah tropis dan daerah subtropis.

 Saat ini, Jepang adalah salah satu negara pengimpor udang terbesar di dunia, dengan total lebih dari
200.000 ton per tahun. Sejumlah besar udang, terutama udang windu, Penaeus monodon,
sebelumnya telah diimpor dari Taiwan sekitar 20 tahun yang lalu, tetapi Taiwan kemudian digantikan
oleh berbagai negara Asia Tenggara karena penurunan tiba-tiba dalam produksi udang di Taiwan
sehubungan dengan virus yang serius. wabah penyakit. Meskipun pentingnya budidaya udang di
seluruh dunia sebagai industri, pengetahuan yang ada tentang mekanisme dasar pertumbuhan dan
reproduksi krustasea di seluruh dunia tidak memadai. Karena krustasea termasuk dalam arthropoda,
mungkin mereka mirip dengan serangga dalam semua aspek. Crustacea memang menyerupai
serangga dalam banyak hal, tetapi masih sangat berbeda dari serangga, misalnya, dalam hal kontrol
warna tubuh, sistem molting, sistem neurosekretoris, kalsifikasi exoskeleton, diferensiasi seksual,
kontrol kadar karbohidrat darah dan sebagainya. Dengan demikian, perlu untuk memahami banyak
fenomena aneh pada tingkat molekuler, dan salah satu cara untuk melakukannya adalah dengan
mengkarakterisasi hormon yang terkait dengan fenomena tersebut.

Karbohidrat darah pada krustasea terutama terdiri dari glukosa, sedangkan trehalosa ditemukan
pada serangga. Keberadaan faktor hiperglikemik pada kestan mata krustasea telah diketahui sejak
Abramowitz dan rekan-rekannya pertama kali menunjukkan bahwa injeksi ekstrak kantung mata ke
dalam kepiting menyebabkan peningkatan kadar glukosa hemolimf (Abramowitz et al. 1944).
Mekanisme homeostasis karbohidrat pada krustasea dengan demikian sangat berbeda dari pada
serangga. Sifat fisiologis dan biokimia dari faktor hiperglikemik telah diselidiki secara luas (ditinjau
oleh Keller 1992). Hormon krustasea hiperglikemik (CHH) pertama kali ditandai dalam kepiting
pantai Carcinus maenas (Kegel et al. 1989). CHH selalu merupakan neuropeptida utama dalam
kelenjar sinus krustasea dan karena itu telah ditandai dalam banyak spesies decapod dan isopoda
(Santos dan Keller 1993). Studi terbaru telah mengungkapkan bahwa CHH juga terlibat dalam
berbagai proses seperti transportasi ion pada insang dan pengambilan air untuk tujuan
memperbesar ukuran tubuh setelah molting (Chung et al. 1999; Spanings-Pierrot et al. 2000).

Crustacea serta banyak spesies arthropoda lainnya secara khas melepaskan exoskeleton selama
pertumbuhan, karena exoskeleton keras yang terkalsifikasi mengganggu pertumbuhan. Hormon
eyestalk yang bertanggung jawab untuk berganti kulit ditemukan pada awal 1905 (Zeleny 1905),
tetapi identifikasi kimianya pertama kali dilakukan dengan menggunakan lobster Amerika Homarus
americanus sekitar 20 tahun yang lalu (Chang et al. 1990). Pada 1960-an, struktur hormon ganti kulit
pada serangga ditentukan setelah bertahun-tahun upaya oleh kelompok penelitian Jerman; itu
ditemukan sebagai steroid yang sangat terhidroksilasi (Hoppe dan Huber 1965), yang disintesis dari
kolesterol. segera setelah penentuan struktural ini, krustasea juga ditemukan menggunakan
senyawa yang sama dalam molting (Hampshire dan Horn 1966). Dengan demikian, serangga dan
krustasea menggunakan steroid biasa, yang disebut sebagai ecdysteroid, untuk tujuan molting.
Namun, pengaturan produksi hormon pergantian bulu oleh kelenjar prothoracic pada serangga
berbeda dari yang oleh organ-Y di krustasea; pada serangga, kelenjar prothoracic secara positif
diatur oleh hormon prothoracicotropic (PTTH) yang disekresikan oleh kompleks otak / korpora allata
(Kawakami et al. 1990), sedangkan pada krustasea, organ Y diatur secara negatif oleh hormon
penghambat molekuler (MIH) disekresikan dari kompleks kelenjar X-organ / sinus (Keller 1992). Oleh
karena itu, tampaknya ada beberapa keragaman dalam sistem pengaturan molting pada arthropoda.
Perbedaan ini belum dipahami dengan baik, dan perbedaan dalam sistem transduksi sinyal dari
penerimaan hormon menjadi biosintesis hormon molting harus diklarifikasi di masa depan. Baru-
baru ini, beberapa enzim biosintesis yang terlibat dalam jalur biosintesis dari kolesterol ke ecdysone
telah ditandai pada tingkat cDNA di kedua serangga (Gilbert 2004; Truman 2005; Rewitz dan Gilbert
2008) dan krustasea (Rewitz dan Gilbert 2008; Asazuma et al. 2009).

Vitellogenesis adalah peristiwa fisiologis penting dalam reproduksi hewan ovipar. Berbagai nutrisi
termasuk karbohidrat, protein, lipid, mineral, dan vitamin yang diperlukan untuk perkembangan
embrio terakumulasi dalam oosit selama proses ini. Pada krustasea, vitellogenesis diatur secara
negatif oleh neuropeptide, hormon penghambat vitellogenesis (VIH), yang disintesis dan
disekresikan dari kompleks kelenjar X-organ / sinus di eyestalks. Ketika kami mulai belajar tentang
VIH M. japonicus, peptida yang ditunjuk sebagai VIH telah dimurnikan dan dikarakterisasi dari hanya
dua spesies krustasea, lobster Amerika H. americanus (Soyez dkk. 1991) dan isopod terestrial
Armadillidium vulgare (Gréve et al. 1999). Dalam H. americanus, dua isoform VIH (Hoa-VIHI dan -II)
diisolasi dan memiliki urutan yang sama dari 77 residu asam amino (Soyez et al. 1991). Mereka dapat
terjadi melalui transformasi residu asam L-amino menjadi residu asam D-amino pada kedua urutan
melalui modifikasi pasca-translasi (Soyez et al. 1994). Hoa-VIH-I dan A. vulgare VIH (Arv-VIH) terbukti
menghambat timbulnya vitellogenesis dalam bioassay in vivo, dan karenanya secara umum diterima
sebagai VIHs. Dalam Penaeus semisulcatus, vitellogenesis dihambat oleh beberapa CHH yang
dimurnikan dari kelenjar sinus M. japonicus, dan oleh karena itu CHH dari udang ini mungkin
memiliki fungsi ganda dari aktivitas penghambat hiperglikemik dan vitellogenesis yang menghambat
(Khayat et al. 1998).

Ditemukan bahwa CHH secara struktural mirip dengan MIH, membentuk keluarga peptida yang
ditunjuk sebagai keluarga CHH (Keller 1992). Banyak peptida milik keluarga CHH telah dikarakterisasi
dari berbagai spesies krustasea dan juga dari serangga dan laba-laba (Gasparini et al. 1994). VIH dan
hormon penghambat organ mandibula (MOIH), yang menghambat sintesis metil farnesoat oleh
organ mandibula (Wainwright et al. 1996), juga diproduksi di eyestalk krustasea, dan dimasukkan
sebagai anggota keluarga CHH. Ion transport peptide (ITP) dikarakterisasi dalam belalang (Audsley et
al. 1992), dan protein berat molekul rendah (LMWP) ditemukan dalam racun laba-laba (Gasparini et
al. 1994). Oleh karena itu, peptida keluarga CHH cenderung memainkan berbagai peran dalam
artropoda. Peptida keluarga CHH belum ditemukan pada hewan apa pun selain arthropoda, dan
karena itu dianggap sebagai molekul unik untuk arthropoda.
Banyak krustasea memiliki kemampuan untuk mengubah warna tubuh untuk beradaptasi dengan
latar belakang sekitarnya, dan perubahan ini dilakukan oleh sel khusus yang disebut kromatofora.
Perubahan warna tubuh dihasilkan dari dispersi atau konsentrasi butiran pigmen bergerak dalam
kromatofora, yang dalam krustasea meliputi empat jenis: eritrophor, xanthophor, leucophores dan
melanophores. Sampai saat ini, hormon konsentrat pigmen merah (RPCH) dan hormon pendispersi
pigmen (PDH), yang diproduksi oleh dan dilepaskan dari kompleks kelenjar organ-sinus / X di
eyestalk, dikenal sebagai neuropeptida pengatur kromatofor (Keller 1992). RPCH pertama kali
diisolasi dan diurutkan dari udang merah muda Pandalus borealis (Fernlund dan Josefsson 1972).
Molekul ini adalah octapeptide dengan C-terminus yang sedang, dan merupakan neuropeptida
pertama yang dikarakterisasi tidak hanya pada krustasea tetapi juga pada invertebrata. Kemudian,
hormon adipokinetik (AKH) pada serangga ditemukan secara struktural terkait dengan RPCH
(Mordue dan Stone 1976; Gäde 1991). Dengan demikian, keluarga besar peptida AKH / RPCH
didirikan. PDH awalnya diidentifikasi sebagai hormon pigmen retina distal (DRPH), dan diisolasi dari
P. borealis dan diurutkan (Fernlund 1976). PDH terdiri dari 18 residu asam amino dengan terminal-C
sedang. Sejauh ini, PDH telah terbukti ada secara luas tidak hanya di krustasea tetapi juga pada
serangga (Rao dan Riehm 1993). Peptida homolog terhadap PDH pada serangga dikenal sebagai
faktor pendispersi pigmen (PDF), dan beberapa laporan menyarankan bahwa PDF mungkin
memainkan peran penting dalam pengaturan ritme sirkadian pada serangga (Park and Hall 1998;
Park et al. 2000)

Penentuan jenis kelamin dan diferensiasi seksual pada vertebrata telah dipelajari secara luas, dan
telah diklarifikasi berada di bawah regulasi genetik dan hormonal. Sebaliknya, pada invertebrata
sedikit yang diketahui tentang penentuan jenis kelamin dan diferensiasi seksual dengan
pengecualian lalat buah, di mana tidak ada regulasi hormonal (Schütt dan Nöthiger 2000).
Mekanisme diferensiasi seksual pada krustasea tampaknya sangat berbeda dari pada serangga, dan
krustasea tampaknya lebih mirip dengan vertebrata daripada serangga sehubungan dengan berada
di bawah regulasi endokrin (Charniaux-Cotton 1967). Hormon androgenik kelenjar (AGH), yang
diproduksi oleh kelenjar androgenik (AG) dan bertanggung jawab untuk diferensiasi seksual pada
krustasea, ditemukan pada tahun 1954 (CharniauxCotton 1954). Sejak itu, banyak upaya telah
dilakukan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi AGH. Pada tahun 1999, AGH berhasil diisolasi
dari isopoda A. vulgare terestrial, dan strukturnya ditentukan menjadi peptida heterodimerik seperti
insulin yang memiliki glikus N-linked (Martin et al. 1999; Okuno et al. 1999).

Dalam monograf ini, kami akan mempresentasikan temuan kami tentang pemurnian, penentuan
struktural, kloning cDNA, ekspresi gen dan fungsi intrinsik hormon peptida krustasea ini, dan
membahas perspektif masa depan endokrinologi molekul krustasea.
Hormon peptida eyestalk I: peptida CHH-family

Telah terbukti bahwa berbagai jenis neuropeptida diproduksi di mata krustasea (Keller 1992).
Sebagian besar disintesis dalam organ-X dan ditransfer ke kelenjar sinus, dari mana mereka
dilepaskan ke dalam hemolymph. Di antara ini, urutan asam amino dari empat neuropeptida, CHH,
MIH, VIH dan MOIH, serupa, membentuk keluarga peptida yang disebut sebagai keluarga CHH (Keller
1992). Peptida keluarga CHH sebagian besar adalah 72 hingga 78 residu asam amino yang lama
memiliki enam residu sistein terkonservasi yang membentuk tiga ikatan disulfida intramolekul.
Dipercayai bahwa mereka telah berevolusi dari molekul leluhur yang sama. Peptida keluarga CHH
telah diisolasi tidak hanya dari dekapoda dan krustasea isopoda, tetapi juga dari serangga (Audsley
et al. 1992) dan seekor laba-laba (Gasparini et al. 1994).

CHH

2-1A. Bioassay dan pemurnian A

CHH pertama kali diisolasi dan diurutkan dari kepiting pantai C. maenas (Kegel et al. 1989). Setelah
itu, urutan asam amino CHHs dalam berbagai spesies decapod telah ditentukan (ditinjau oleh Santos
dan Keller 1993). Namun, tidak ada informasi mengenai struktur CHH dalam udang atau udang yang
tersedia ketika kami mulai mempelajari hormon mata krustasea. Oleh karena itu, kami mulai
memurnikan molekul CHH dari kelenjar sinus kuruma prawn M. japonicus dan menentukan
strukturnya (Yang et al. 1995, 1996, 1997; Yang 1997; Nagasawa et al. 1999). Dalam penelitian kami,
bioassay injeksi in vivo menggunakan M. japonicus dilakukan pada dasarnya sesuai dengan metode
yang dijelaskan sebelumnya (Leuven et al. 1982), tetapi sedikit dimodifikasi seperti yang dijelaskan di
bawah ini (Yang et al. 1995, 1996, 1997). Kadar glukosa dalam hemolimf udang normal adalah 220 ±
30 μg / mL. Mereka secara dramatis menurun menjadi 35 ± 10 μg / mL 2 hari (hari) setelah ablasi
bilateral mata. Untuk menentukan waktu yang tepat untuk pengambilan sampel hemolymph setelah
injeksi, percobaan timecourse dilakukan. Setelah injeksi masing-masing CHH ke udang yang
dihilangkan dengan mata, kadar glukosa diukur. Tingkat meningkat dengan waktu, mencapai
maksimum dalam 2 jam (jam) setelah injeksi, dan menurun secara bertahap sesudahnya. Dengan
demikian, kami menyusun kondisi bioassay untuk aktivitas hiperglikemik sebagai berikut.

Udang kuruma hidup diperoleh di pasar ikan di Tokyo, Jepang dan disimpan di akuarium pada suhu
20 ° C selama percobaan. Sampel dilarutkan dalam 100 μL larutan salin disuntikkan ke dalam udang
(berat badan rata-rata, 20 g) yang eyestalksnya telah dihapus 2 hari sebelum percobaan injeksi.
Hemolymph (masing-masing 200 μ L) diambil sesaat sebelum injeksi dan 2 jam setelah injeksi. Kadar
glukosa hemolimfa ditentukan menggunakan metode glukosa oksidase peroksidase (Papadopoulos
dan Hess 1960). Aktivitas hiperglikemik dinilai dengan peningkatan kadar glukosa hemolimf setelah
injeksi. Untuk memurnikan molekul CHH M. japonicus, peptida diekstraksi dari kelenjar sinus dan
difraksionasi dengan satu langkah tunggal HPLC fase terbalik (Yang et al. 1995, 1996, 1997; Yang
1997; Nagasawa et al. 1999). Sebuah kromatogram khas dari 300 kelenjar sinus ditunjukkan pada
Gambar. 1. Tujuh bahan puncak ditetapkan sebagai Pej-SGP-I ke -VII dalam urutan elusi. Aktivitas
hiperglikemik dari tujuh puncak itu dinilai dengan metode yang dijelaskan di atas, mengungkapkan
bahwa Pej-SGP-I, II, III, V, VI dan VII menunjukkan aktivitas hiperglikemik yang cukup besar.
Sebaliknya, Pej-SGP-IV menunjukkan hampir tidak ada aktivitas hiperglikemik, sedangkan itu
menunjukkan aktivitas penghambatan mol yang kuat (Tabel 1), seperti yang dijelaskan dalam Subbab
2-2A. Oleh karena itu, dalam M. japonicus, Pej-SGP-I, II, III, V, VI dan VII dianggap sebagai CHH,
sedangkan Pej-SGP-IV dianggap sebagai MIH.

2-1B. Penentuan structural

Selanjutnya, kami fokus pada penentuan struktural tujuh Pej-SGP. Tujuh bahan puncak berkurang,
karboksimetilasi, dan selanjutnya mengalami analisis urutan asam amino N-terminal (Yang et al.
1995, 1996, 1997; Yang 1997; Nagasawa et al. 1999). Hasilnya, lebih dari 43 residu asam amino
untuk setiap peptida diidentifikasi. Urutan asam amino Nterminal dari Pej-SGP-I, II, III, V, VI dan VII
sangat mirip satu sama lain dan sedikit kurang mirip dengan CHH yang diketahui dari krustasea
lainnya. Sebaliknya, Pej-SGP-IV lebih mirip dengan C. maenas MIH dan H. americanus VIH
dibandingkan dengan Pej-SGP-I, II, III, V, VI, VII dan CHH yang dikenal. Hasil ini menunjukkan
persetujuan yang baik dengan bioassay seperti dijelaskan di atas.

Karena Pej-SGP-III adalah molekul CHH yang melimpah di kelenjar sinus M. japonicus, analisis
struktural lebih lanjut dari peptida ini pertama kali dilakukan (Yang et al. 1995). Pencernaan trypsin
dari Pej-SGP-III yang utuh menghasilkan fragmen peptida bernama T3 (Gbr. 2). Fragmen ini terdiri
dari empat rantai peptida, di antaranya tiga urutan (T3-1, -2 dan -3) dengan mudah ditetapkan
berdasarkan urutan terminal-N. Peptida keempat (T3-4) mulai dari Ser41 ditugaskan dengan
mengurangi tiga urutan di atas dari total. T3-4 dianggap sebagai peptida terminal-C, tetapi residu
dapat diidentifikasi hingga residu ke-70 dan, dilihat dari data spektral massa, dua residu yang tidak
teridentifikasi mungkin tetap berada di Cterminus.

Untuk menentukan urutan terminal-C, Pej-SGP-III yang utuh dicerna dengan endoproteinase Glu-C.
Empat peptida fragmen utama bernama E1-E4 diperoleh. E1 ditemukan dengan analisis urutan
menjadi fragmen terminal-C, dan satu residu lagi, Thr71, dapat diidentifikasi. Dengan demikian,
hanya tersisa residu tak dikenal Cterminal. Spektrum massa FAB resolusi tinggi E1 menunjukkan
puncak ion molekuler terprotonasi pada m / z 887,43. Satu-satunya kemungkinan untuk residu
Cterminal yang dapat memenuhi nilai ini adalah Val dengan struktur di tengah (nilai yang dihitung,
887,42). Dengan demikian urutan asam amino lengkap Pej-SGPIII ditentukan secara jelas (Gbr. 2).

Selanjutnya, urutan asam amino lengkap dari lima CHH yang tersisa, Pej-SGP-I, II, V, VI dan VII (Yang
et al. 1997; Yang 1997; Nagasawa et al. 1999), dan MIH, Pej-SGP -IV (lihat Subbab 2-2B), juga
ditentukan mirip dengan karakterisasi struktural Pej-SGP-III. Urutan asam amino dari tujuh peptida
ditunjukkan pada Gambar. 3. Peptida ini menunjukkan kesamaan urutan yang cukup besar dengan
CHH peptida keluarga yang dikarakterisasi sebelumnya, dan khususnya ditemukan memiliki enam
residu sistein yang terkonservasi yang terlibat dalam pembentukan tiga jembatan disulfida. Oleh
karena itu, tujuh peptida dianggap sebagai anggota peptida keluarga CHH di M. japonicus. Peptida
famili CHH dibagi menjadi dua subtipe berdasarkan tidak adanya (tipe I) atau ada (tipe II) residu glisin
pada posisi 12 dalam peptida matang. Menurut pengelompokan ini, enam CHH (Pej-SGP-I, II, III, V, VI
dan VII) dapat diklasifikasikan ke dalam tipe I dan MIH (Pej-SGP-IV) milik tipe II. Klasifikasi ini
konsisten dengan penelitian sebelumnya bahwa semua molekul CHH yang dikenal diklasifikasikan
sebagai tipe I, dan MIH, MOIH dan molekul VIH diklasifikasikan sebagai tipe II (Lacombe et al. 1999).

2-1C. Lokalisasi imunohistokimia Untuk menjelaskan lokalisasi sel yang memproduksi peptida
keluarga CHH di M. japonicus, kami mengembangkan lima antibodi spesifik terhadap Pej-SGP-I, -II,
-III, -IV dan -V (Shih et al. 1997, 1998). Studi imunohistokimia menggunakan antibodi ini
menunjukkan bahwa sel-sel neurosekretoris Pej-SGP-III dan IV terletak di cluster yang sama dari
medula terminalis ganglionik X-organ (MTGX), dan bahwa tiga jenis sel neurosekresi diwarnai
dengan anti-Pej-SGP -III antiserum dan / atau antiserum anti-Pej-SGP-IV hadir (Gambar 4a, b).
Jumlah sel-sel neurosecretory yang diwarnai dengan kedua antisera jauh lebih kecil daripada sel-sel
neurosecretory yang diwarnai dengan satu antiserum saja. Co-lokalisasi dua peptida keluarga CHH
telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya pada sel yang memproduksi CHH dan VIH
menggunakan imunohistokimia dan hibridisasi in situ dalam Homarus gammarus (Rotllant et al.
1993) dan H. americanus (De Kleijn et al. 1992 ). Sebaliknya, tidak ada colocalization MIH dan CHH
yang diamati pada tingkat mRNA atau peptida di C. maenas (Klein et al. 1993).

Lokalisasi diagram dari sel-sel neurosecretory yang diwarnai dengan lima antibodi ditunjukkan pada
Gambar. 5. Sel Pej-SGP-I ditemukan dalam tiga kelompok. Cluster pertama berada di medulla interna
ganglionic X organ (MIGX) (Posisi A pada Gambar 5). Cluster kedua berada di MTGX dekat dengan
kelenjar sinus (Posisi B pada Gambar. 5). Cluster ketiga juga di MTGX, tetapi terletak di sisi ventral
dari medula terminalis (MT) dekat dengan akar eyestalk (Posisi C pada Gambar. 5). Sel Pej-SGP-II
ditemukan di MTGX dekat dengan kelenjar sinus (Posisi B pada Gambar. 5). Sel-sel Pej-SGP-V ada di
MTGX yang berlawanan dengan kelenjar sinus, yang dari cluster yang sama dengan yang dari Pej-
SGP-III dan IV (Posisi D pada Gambar. 5). Sejauh yang kita tahu, sel-sel neurosekretori peptida
keluarga CHH dalam krustasea diketahui ada di kluster yang sama dari MTGX yang terletak di sisi
berlawanan dari kelenjar sinus (Jaros dan Keller 1979). Oleh karena itu, hasil penelitian kami adalah
yang pertama menunjukkan bahwa tidak semua peptida keluarga CHH diproduksi dalam kelompok
sel yang sama. Berbagai pola lokalisasi sel-sel neurosekretoris ini untuk peptida M. japonicus CHH
mungkin menyiratkan bahwa mereka memiliki peran fisiologis dan peraturan yang berbeda.

2-1D. Kloning cDNA

Ketika kami memulai penelitian kami tentang CHH dari udang kuruma M. japonicus, cDNA yang
mengkode CHH telah diisolasi dari kepiting pantai C. maenas (Weidemann et al. 1989), lobster
Amerika H. americanus (De Kleijn et al. 1995), dan udang karang Orconectes limosus (De Kleijn et al.
1994a). Struktur umum untuk prekursor CHH ini ditunjukkan oleh analisis urutan cDNA. Prekursor
CHH terdiri dari peptida sinyal, peptida terkait prekursor CHH (CPRP), dan CHH. CPRP memiliki 33-38
residu yang lama dan secara struktural dilestarikan. CPRP telah dimurnikan dari kelenjar sinus dari
tiga spesies krustasea di atas (Tensen et al. 1991), tetapi fungsi biologis mereka belum diklarifikasi.
Selain itu, tidak ada informasi mengenai struktur prekursor CHH di udang atau udang pada saat itu.
Oleh karena itu, kami berusaha untuk mengisolasi cDNA yang mengkode prekursor PejSGP-III, yang
merupakan CHH pertama yang dikarakterisasi di antara enam CHH di M. japonicus (Ohira et al.
1997a).

Total RNA yang diisolasi dari eyestalk M. japonicus menjadi sasaran RT-PCR untuk mendapatkan
fragmen cDNA yang mengkode Pej-SGP-III. Produk reaksi digunakan sebagai penyelidikan untuk
menyaring pustaka mata-mata cDNA, dan kemudian tiga klon yang mengkode prekursor Pej-SGP-III
diisolasi. Urutan nukleotida dari salah satu klona cDNA ditunjukkan pada Gambar. 6. Sebuah frame
membaca terbuka (ORF) 354 bp ditemukan, dan ORF ini secara konseptual diterjemahkan menjadi
protein diduga dari residu asam amino 117. Seperti yang diharapkan, urutan Ser20-Val91 dari
protein ini identik dengan Pej SGP-III. Segmen Ser20 – Val91 ini diapit Cterminally oleh Gly92-Lys93
dan diikuti oleh kodon stop. Val91 Pej-SGP-III matang sedang ditengah-tengah (Yang et al. 1995);
Lys93, oleh karena itu, diharapkan akan dihapus dari prekursor, dan Gly92 mungkin menjadi donor
amida untuk Val91. Segmen Met-24-Ala-1 memiliki inti yang sangat hidrofobik (Met-19-Leu-7) dan
karenanya cenderung membentuk peptida sinyal (Von Heijne 1986). Urutan sisa dari Arg1-Asn17 dan
Lys18-Arg19 dianggap sebagai CPRP diduga dan situs pembelahan putatif dibasic, masing-masing.
CDNA ini juga mencakup urutan flanking 5 ((46 bp) dan daerah rans 3 rans yang tidak diterjemahkan
(374 bp) yang mengandung situs sinyal polyadenylation konsensus dan varian satu (AATTTAAA) 132
bp dan 16 bp hulu dari ekor (A), masing-masing.

Budidaya udang adalah industri global yang signifikan di seluruh dunia. Untuk mencapai
pengembangan lebih lanjut, diperlukan teknik produksi benih yang lebih efisien. Oleh karena itu,
diinginkan untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik tentang reproduksi udang. Namun,
pengetahuan vitellogenesis pada udang masih terbatas, dan masih sulit untuk mengontrol
reproduksi dalam kondisi buatan untuk sejumlah besar spesies yang penting secara komersial. Oleh
karena itu, saat ini, sudah umum bahwa udang yang sepenuhnya dewasa untuk spesies yang penting
secara komersial ditangkap dari alam liar dan dibiarkan berkembang biak di tempat penetasan.
Namun, akhir-akhir ini semakin sulit untuk mendapatkan jumlah udang dewasa liar yang cukup,
karena penangkapan ikan yang berlebihan dan / atau adanya penyakit virus udang yang serius di
banyak bidang utama. Memang, pengembangan strain yang resisten terhadap penyakit atau strain
yang mengandung fenotipe tertentu sekarang diperlukan. Untuk alasan ini, kami telah bekerja pada
isolasi hormon yang mengatur reproduksi udang.

Ablasi eyestalk dikenal untuk menginduksi vitellogenesis, yang memungkinkan kita untuk
menganggap bahwa ada VIH di dalam eyestalk. VIH pertama kali diisolasi dari lobster Amerika H.
americanus (Soyez et al. 1991) dan kemudian dari isopoda A. vulgare terestrial (Gréve et al. 1999).
Anehnya, pada awal tahun 2000-an, VIH belum diisolasi dari udang. CHH dari M. japonicus
ditemukan menghambat transkripsi dan terjemahan dalam ovarium berkembang dari udang lain, P.
semisulcatus, dalam cara yang tidak spesifik, sedangkan MIH dari M. japonicus tidak (Khayat et al.
1998). Di sisi lain, dapat dianggap bahwa fungsi pertama VIH adalah sintesis vitellogenin (VG). Baru-
baru ini, cDNA VG telah dikloning dari beberapa spesies krustasea (ditinjau oleh Wilder et al., 2010).
Dimungkinkan untuk mengembangkan bioassay VIH dengan melihat pengurangan tingkat ekspresi
VG mRNA di organ yang memproduksi, misalnya, ovarium atau hepatopankreas sebagai respons
terhadap berbagai faktor. Sejalan dengan ini, kami menguji aktivitas VIH in vitro peptida keluarga M.
japonicus CHH berdasarkan pada eksperimen PCR kuantitatif pada ekspresi gen VG. Sebagai hasilnya,
kami menemukan bahwa CHH dari M. japonicus menekan ekspresi gen VG, sedangkan M. japonicus
MIH dan MIH-B tidak (Tsutsui et al. 2005a, 2013). Meskipun sejauh ini kami telah mengisolasi
peptida utama keluarga CHH, kami tidak tahu apakah VIH adalah salah satu peptida keluarga CHH
yang diketahui, atau peptida yang tidak diketahui. Karena, peptida keluarga CHH kecil lainnya, CHH
diduga dan diduga MIH-C, ditemukan di M. japonicus dengan analisis EST (Yamano dan Unuma
2006). Di masa depan, kita akan mencari lagi VIH dalam ekstrak kelenjar sinus dari kuruma prawn M.
japonicus. Selain itu, kami akan menganalisis kadar hemolymph peptida ini selama vitellogenesis
untuk menguraikan molekul VIH nyata dalam M. japonicus
Ablasi eyestalk juga menyebabkan berbagai perubahan fisiologis, seperti penurunan kadar
karbohidrat dalam hemolimf, memperpendek interval mol, dan mempromosikan sintesis metil
farnesoate pada organ mandibula. Fenomena ini diketahui terkait dengan peptida keluarga CHH.
Dalam percobaan kami, meskipun delapan peptida keluarga CHH telah dimurnikan dan ditandai dari
M. japonicus eyestalks, kami telah menunjukkan hanya tiga fungsi, kegiatan CHH, MIH dan VIH. Di
sisi lain, hormon mandibula organinhibiting (MOIH) terbukti menjadi peptida keluarga CHH
(Wainwright et al. 1996). Selain itu, baru-baru ini terungkap bahwa peptida keluarga CHH juga
terlibat dalam berbagai proses seperti pengangkutan ion ke insang dan pengambilan air untuk tujuan
memperbesar ukuran tubuh setelah berganti kulit (Chung et al. 1999; Spanings-Pierrot et al. 2000).
Untuk menentukan fungsi intrinsik dari masing-masing peptida, studi lebih lanjut mungkin
diperlukan.

AGH sangat spesifik spesies, dan oleh karena itu kita tahu struktur hanya tiga spesies isopoda
terestrial, yang secara filogenetis sangat dekat satu sama lain (Ohira et al. 2003b). Adapun struktur
AGH dalam dekapoda krustasea, kita tahu bahwa mirip dengan kasus AGH isopoda, gen IAG
diekspresikan secara khusus dalam AG, dan IAG dianggap milik superfamili insulin, sangat
menyarankan bahwa IAG adalah dekapoda intrinsik AGH . Namun, IAG berbagi sedikit kesamaan
urutan dengan AGH isopoda, dan situs Nglycosylation yang signifikan untuk menganugerahkan
aktivitas AGH di A. vulgare tidak dilestarikan dalam IAG dekapoda. Selain itu, bukti langsung bahwa
IAG menunjukkan aktivitas AGH belum dilaporkan baik in vivo atau in vitro. Untuk menjelaskan
aktivitas biologis IAG, diperlukan sistem uji aktivitas AGH menggunakan spesies dekapoda. Hormon
eyestalk terlibat dalam pengendalian berbagai proses seperti yang disebutkan di atas. Meskipun
hormon-hormon mata telah dipelajari secara luas oleh banyak peneliti, masih banyak masalah yang
masih harus dipecahkan. Salah satu masalah yang belum terpecahkan adalah bagaimana AG diatur
oleh kelenjar sinus. Aktivitas AG diperkirakan berada di bawah kendali hormon eyestalk tertentu
atas dasar menemukan bahwa ablasi eyestalk menyebabkan pembesaran sel-sel AG (Khalaila et al.
2002). Baru-baru ini, dilaporkan bahwa ekspresi gen IAG dalam AG ditingkatkan oleh ablasi mata
pada C. sapidus (Chung et al. 2011). Kita perlu mengkarakterisasi lebih lanjut neuropeptida kelenjar
sinus, baik secara biologis maupun kimia, untuk mengklarifikasi mekanisme endokrin tidak hanya
dari diferensiasi seksual tetapi juga pertumbuhan dan reproduksi, hasil yang kami harapkan akan
mengarah pada teknik baru yang berguna untuk budidaya udang.