LAPORAN RESMI

BIOKIMIA

PERCOBAAN 3

PENETAPAN KADAR KOLESTEROL DALAM DARAH DENGAN

METODE LIBERMANN-BURCHARD

DISUSUN OLEH :

Nama : Abid Hanifi Samha

NIM : 1908010129

Golongan : 05

Kelompok : 01

Asisten Praktikum : Mba Afifah

LABORATORIUM KIMIA ORGANIK

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

2020
 PERCOBAAN 3

PENETAPAN KADAR KOLESTEROL DALAM DARAH DENGAN

METODE LIBERMANN-BURCHARD

I. Tujuan
Mahasiswa mampu menetapkan kadar kolesterol dalam darah atau
serum secara spektroskopi menurut metode Liebermann-Burchard
II. Latar Belakang
Kolestrol adalam metabolit yang mengandung lemak sterol yang
ditemukan pada membran sel dan disirkulasikan dalam plasma darah.
Merupkan sejenis lipid yang merupakan molekul lemak atau yang
menyerupainya. Kolestrol ialah jenis khusus lipid yang disebut steroid.
Steroid ialah lipid yang memiliki struktur kimia khusus. Struktur ini terdiri
dari 4 cairan atom karbon. Lemak merupakan salah satu zat gizi lain seperti
karbohidrat, protein, vitaminm dan mineral. Lemak merupakan salah satu
sumber energi yang memberikan kalori yang paling tinggi. Disamping
sebagai salah satu sumber energi, sebenarnya lemak atau khususnya
kolesterol memang merupakan zat yang sangat dibutuhkan oleh tubuh kita
terutama untuk membentuk dinding sel-sel dalam tubuh

Tubuh manusia dan hewan yang nirmal akan berusaha memelihara

konsentrasi plasma kolestrol dengan cara mengatur sintetis dan sekresi.
Kolestrol yang melebihi kebutuhan tubuh akan di eleminis melalui empedu,
tetapi walaupun begitu jika pasokan kolestrol dari makanan berlebih yang
akhirnya melebihi kebutuhan tubuh kita, maka akan berakibat kurang baik
bagi tubuh dan dapat menimbulkan gangguan pada bagian fisiologi seperti
artherosklierosis yang menifestasinya dapat menjadi penyakit penyakit
jantung koroner atau stroke. Kolesterol merupakan substansi kemah, oleh
karena itu kolesterol tidak larut dalam air, dapat di ekstrasi pada jaringan
dengan kloroform, eter, benzena, dan alkohol keras.
 Dari uraian diatas maka dilakukan praktikum tentang pengukuran
kadar kadar kolesterol dengan harapan kolesterol dari sampel yang
digunakan pada praktikum kali ini bisa diketahui. Sampel yang digunakan
pada praktikum kali ini adalah serum darah. Untuk mengetahui kandungan
kolesterol dalam berbagai metode pengukuran baim secara kualitatif
maupun kuantitatif, dari metode yang sederhana sampai metode yang
kompleks
III. Prinsip Reaksi
a) Metode Lieberman-Burchard Uji kuantitatif untuk kolesterol, pereaksi
Lieberman-Burchard merupakan campuran antara asam asetat anhidrat dan
sulfat pekat untuk membentuk susunan turunan didalam kloroform.
Penambahan kloroform berfungsi untuk melarutkan kolesterol yang
terkandung di dalam sampel. Maka dari itu lemak dilarutkan kloroform
karena sifat dari lemak atau kolesterol adalah non polar, maka akan larut pada
pelarut non polar. Bila kolesterol direaksikan dengan campuran asam asetat
anhidrat dengan asam sulfat pekat dalam lingkungan bebas air maka akan
terbentuk warna hijau akibat pembentukan hidrokarbon tak jenuh. Hasil dari
reaksi tersebut diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer.

b) Prinsip Reagen KIT Sampel direaksikan dengan reagen atau KIT, kemudian
di inkubasi dalam suhu 37 derajat celcius kemudian dibaca absorbansinya
pada panjang gelombang 550 NM dengan reaksi
IV. Alat dan Bahan
➢ Alat
a. Tabung Reaksi
b. Tabung Sentrifuge
c. Rak Tabung Reaksi
d. Pipet Ukur
e. Mikropipet
f. Gelas Pengaduk
g. Penangas air
h. Sentrifugator
i. Spektrofotometer UV-Vis
j. Beaker Glass
➢ Bahan
a. Sampel (Serum darah praktikan)
b. Pelarut campuran aseton : etanol (1:1 v/v)
c. Kloroform
d. Pereaksi (campuran asam asetat anhidra dan asam sulfat
pekat 30:1)
e. Larutan Stok atau standar kolesterol
f. Reagen kit
V. Cara Kerja I
• Larutan Sampel (Replikasi 2x)
Masukkan 0,2 ml serum ke dalam tabung sentrifuga
↓
Tambahkan pelarut campuran aseton-etanol sebanyak 10,0 ml Aduk
dengan gelas pengaduk
↓
Panaskan tabung dalam penangas air sambil digojog hingga pelarut
mendidih
↓
Ambil tabung tersebut, vortex selama 5 menit
↓
Dinginkan pada suhu kamar lalu sentrifuga selama 20 menit
↓
Cairan supernatant yang didapat dituang ke tabung reaksi kering
Kemudian diuapkan di atas penangas air hingga kering
↓
Sisa pengeringan didinginkan
↓
Residu dilarutkan dalam 3,0 ml kloroform
↓
Tambahkan 2,0 ml pereaksi, aduk sampai homogen
↓
Biarkan pada tempat yang gelap suhu kamar selama beberapa menit
(Replikasi 2x)

• Larutan Standar
Buat seri larutan standar dalam kloroform yang mengandung
kolesterol dengan kadar 1 ml; 1,2 ml; 1,4 ml; 1,6 ml
↓
Tambahkan kloroform pada masing-masing tabung hingga
mencapai volume 3 ml
 ↓
Tambahkan pereaksi (campuran asam asetat anhidrida-asam sulfat
pekat) sebanyak 2 ml. Volume akhir pada tabung reaksi sebanyak 5
ml

• Larutan Blanko
Larutan blanko dibuat dengan kloroform 3ml + pereaksi sebanyak
2ml

• Pengukuran Kadar
Mengukur absorbansi ketiga larutan pada panjang gelombang 400
nm

Cara Kerja II

• Larutan Sampel (Replikasi 2x)

Mengambil 10 µl sampel
↓
Tambahkan 1 ml reagen kit kolesterol
↓
Vortex
↓
Inkubasi pada suhu 37˚C selama 5 menit

• Larutan Blanko
Larutan blanko dibuat dengan 2 ml reagen kit

• Pengukuran Kadar
Larutan diabsorbansi pada panjang gelombang 546 nm
VI. Data percobaan dan Perhitungan

Worksheet P-3. PENETAPAN KADAR KOLESTEROL DALAM DARAH DENGAN

METODE LIEBERMANN-BURCHARD

1. Pembuatan seri konsentrasi

Larutan standar yg digunakan : Larutan standar kolesterol
Konsentrasi larutan standar yg digunakan : 0,4 mg/ml
Pereaksi yang digunakan : Pereaksi Lieberman-Burchard (asam asetat
anhidrat dan asam sulfat pekat)
Warna larutan : Hijau
Standar CHCl3 Pereaksi Volume Konsentrasi Warna
(ml) (ml) (ml) akhir (ml) akhir (mg/ml) larutan
Blangko 3 ml 2 ml 5 ml
Standar 0,8 2,2 2 ml 5 ml 0,064 M Hijau
1 ml
Standar 1,0 2 ml 2 ml 5 ml 0,08 M Hijau
2
Standar 1,2 1,8 2 ml 5 ml 0,096 M Hijau
3 ml
Standar 1,4 1,6 2 ml 5 ml 0,112 M Hijau
4 ml
Standar 1,6 1,4 2 ml 5 ml 0,128 M Hijau
5 ml

Perhitungan konsentrasi :
o Standar 1
M1.V1= M2.V2
0,8.0,4= M2.5
 0,32 = M2

5
0,064 M =M2

o Standar 2
M1.V1=M2.V2
1 . 0,4 = M2.5
0,4 = M2
5
0,08 M= M2
o Standar 3
M1.V1 = M2.V2
1,2.0,4 = M2.5
0,48 = M2
5
0,096 M = M2
o Standar 4
M1.V1=M2.V2
1,4.0,4= M2.5
0,56 = M2
5
0,112 M = M2
o Standar 5
M1.V1=M2.V2
1,6.0,4= M2.5
0,64 = M2
5
0,128 M = M2

2. Persiapan sampel
Sampel yang digunakan Serum darah
 Pelarut Aseton dan etanol 1:1
Cara persiapan sampel Larutan Sampel (Replikasi 2x)
Masukkan 0,2 ml serum ke dalam tabung
sentrifuga
↓
Tambahkan pelarut campuran aseton-etanol
sebanyak 10,0 ml Aduk dengan gelas pengaduk
↓
Panaskan tabung dalam penangas air sambil
digojog hingga pelarut mendidih
↓
Ambil tabung tersebut, vortex selama 5 menit
↓
Dinginkan pada suhu kamar lalu sentrifuga
selama 20 menit
↓
Cairan supernatant yang didapat dituang ke
tabung reaksi kering Kemudian diuapkan di atas
penangas air hingga kering
↓
Sisa pengeringan didinginkan
↓
Residu dilarutkan dalam 3,0 ml kloroform
↓
Tambahkan 2,0 ml pereaksi, aduk sampai
homogen
↓
Biarkan pada tempat yang gelap suhu kamar
selama beberapa menit (Replikasi 2x)

3. Penetapan kadar dalam sampel

Panjang gelombang : 550 nm
 Data simulasi
Absorbansi
Blangko -
Standar 1 0,225
Standar 2 0,274
Standar 3 0,328
Standar 4 0,380
Standar 5 0,415
Sampel 1 0,284
Sampel 2 0,296

Nilai a = 0,0328
Nilai b = 3,0375
Nilai r = 0,9976
Persamaan kurva baku :
Y = bx + a

Persamaan Kurva Baku

0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
standar 1 standar 2 standar 3 standar 4 standar 5
Perhitungan kadar
Sampel 1 = y-a
b

= 0,284-0,328
3,0375

= 0,0826 mg/dl

Sampel 2 = y-a

= 0,296-0,0328 / 3,0375

= 0,0866 mg/dl

Keterangan Kadar (mg/ml)

Sampel 1 0,0826 mg/dl
Sampel 2 0,0866 mg/dl
Rata-rata 0,0846 mg/dl

Kadar kolesterol dalam darah menggunakan metode Lieberman-Burchard adalah

0,0846 mg/dl dan kolesterol normalnya 120 mg/dl/ hal ini menandakan bahwa
kolesterolnya rendah
VII. Pembahasan

Kolesterol merupakan salah satu sterol penting yang terdapat dalam

jaringan dan lipoprotein plasma. Biasanya terdapat bentuk kolesterol bebas
atau gabungan dalam asam lemak rantai panjang seperti ester, kolestoril.
Kolesterol tidak larut dalam air karena adanya kepolaran. Akan tetapi
kolesterol larut dalam pelarut lemak dan sangat nonpolar seperti petroleum
benzin (Fessenden, 2009)

Jenis jenis kolesterol ada 3 :

1. Kolesterol LDL (low Density Lipoprotein) adalah jenis kolesterol
yang berbahaya, karena jika kadarnya tinggi menimbulkan resiko
penyakit jantung dan stroke. Kadar yang baik dari kolesterol ini
adalah kurang dari 100 mg/dl, ukuran yang cukup antara 130-150
mg/dl, ukuran yang normal antara 100-129 mg/dl, ukuran yang
tinggi antara 100-180 mg/dl dan ukuran paling tinggi melebihi nilai
190 mg/dl
2. Kolesterol HDL (High Density Lipoprotein) adalah kolesterol yang
baik karena dapat membuang atau mengurangi kolesterol jahat yang
berlebihan pada pembuluh darah. Kadar normal dari kolesterol ini
adalah 40-50 mg serta antara 20-60 mg/dl
3. Trigliserida adalah jenis lemak yang ada dalam darah serta terdapat
dalam berbagai organ tubuh. Beberapa faktor yang dapat memicu
trigliserida dalam aliran darah dalam obesitas, gula, akoholis, serta
makanan yang berlemak. Kadar normal kolesterol ini adalah kurang
dari 150-199 mg/dl, kadar tinggi antara 200-499 mg/dl dan kadar
paling tinggi mencapai angka 500 mg/dl

Pada percobaan ketiga ini diperlukan alat dan bahan. Alat yang
digunakan antara lain, tabung reaksi, tabung sentrifuge, rak tabung reaksi,
pipet ukur, mikro pipet, gelas pengaduk, penangas air, sentrifugator,
spektrofotometri UV-Vis, dan beaker glass. Tabung reaksi berfungsi
sebagai tempat mereaksikan larutan, tabung sentrifuge berfungsi untuk
sebagai tempat darah yang berfungsi sebagai sampel percobaan, rak tabung
reaksi berfungsi sebagai tempat untuk menaruh tabung teaksi agar larutan
tidak tumpah atau tercecer, pipet ukur berfungsi sebagai alat yang
membantu mengambil larutan dalam volume tertentu dibantu dengan
bantuan alat yang bernama propipet, mikropipet berfungsiuntuk mengambil
larutan dalam jumlah yang sangat tinggi ketelitian alat ini sangatlah tinggi,
gelas pengaduk berfungsi untuk mengaduk larutan, dan pengangas air
berfungsi untuk memanaskan larutan

Lalu bahan yang digunakan ada sampel darah, pelarut campuran

aseton : etanol (1 : 1 v/v), kloroform, pereaksi (campuran asam asetat
anhidrida dan asam sulfat pekat)(30:1), larutan stok, dan reagen. Sampel
darah berfungsi sebagai bahan yang diuji kadar kolesterolnya yang nantinya
darah akan di sentrifugasi yang bertujuan untuk memisahkan serum dan
plasma darah, pelarut campuran aseton dan etanol berfungsi sebagai pelarut
zat yang bersifat polar, kloroform berfungsi sebagai yag melarutkan
kolesterol, pereaksi yang dibuat dari asam asetat anhidrida dan asam sulfat
pekat, asam asetat anhidrida berfungsi untuk mengekstraksi kolesterol dan
menjamin media bebas air sedangkan asam sulfat pekat berfungsi sebagai
pembentuk kompleks warna pada percobaan kali ini, larutan stok berfungsi
sebagai, dan reagen.

Selanjutnya adalah mengenai langkah kerja yang kami lakukan.

Dalam praktikum percobaan ke-tiga ini kita akan membuat tiga larutan yaitu
ada larutan sampel, larutan standar, dan larutan blanko. Yang pertama yaitu
membuat larutan sampel. Mencampurkan aseton dan etanol sebanyak 10 ml
dalam tabung sentrifus yang tertutup, kemudian ditambahkan dengan 0,2 ml
serum darah yang didapatkan dengan di sentrifugasi dengan alat selama 10
menit. Lalu diaduk. Tujuan dari pengadukan ini adalah agar kedua larutan
tersebut dapat tercampur rata. Lalu larutan tadi di panaskan diatas penangas
air dengan sambil digojog agar lebih tercampur hingga mendidih. Lalu
setelah mendidih, larutan tadi di vortex selama 5 menit dengan tujuan agar
larutan lebih tercampur rata. Lalu setelah itu larutan yang telah di vortex
didiamkan atau disentrifuge pada suhu kamar selama 20 menit. Setelah 20
menit, larutan akan terbagi menjadi dua fase larutan. Yaitu cairan
supernatant dan cairan presipirat.

Cairan supernatant adalah cairan yang mengandung kolesterol.

Cairan tersebut berwarna bening pada bagian atas. Sedangkan cairan
presipirat adalah cairan sisa sentrifugasi yang tidak mengandung kolesterol.
Lalu cairan supernatant tadi di pindahkan ke dalam tabung reaksi kering dan
diuapkan kembali pada penangas air hingga terbentuk residu supernatant.
Untuk mendapakan residu supernatant diperlukan waktu kurang lebih
selama 20 menit.

Setelah menunggu 20 menit, dan sudah kering. Residu didinginkan

dan dialarutkan dalam 3 ml kloroform dan ditambahkan pereaksi. Pereaksi
dibuat dari campuran asam asetat anhidrida dan asam sulfat pekat.
Penambahan asam sulfat pekat berfungsi untuk membentuk kompleks
warna sedangkan asam asetat anhidrida berfungsi untuk mengekstraksi
kolesterol dan menjamin media bebas air. Lalu dibiarkan pada tempat gelap
dan suhu ruangselama beberapa menit. Dengan tujuan agar larutan dapat
berubah warna menjadi warna hijau.larutan berubah warna selang waktu 15-
20 menit setelah di diamkan.

Larutan standar dalam klorform yang mengandung kolesterol

dengan kadar 0,8 ml;1 ml; 1,2 ml; 1,4 ml; dan 1,6 ml. lalu ditambahkan
kloroform hingga volume mencapai 3 ml. setelah itu ditambahkan pereaksi
(asam asetat anhidrida dan asam sulfat pekat) sebanyak 2 ml hingga volume
akhir larutan menjadi 5 ml. asam sulfat pekat berfungsi sebagai pemutus
ikatan ester lipid. Mekanisme yang terjadi ketika asam sulfat di tambahkan
dalam campuran berisi kolesterol. Maka molekul air berpindah dari gugus
C3 kolesterol, kolesterol teroksidasi membentuk 3,5-kolestediena. Warna
 hijau menunjukkan hasil positif. Dari hasil perhitungan, kadar kolesterol
dalam praktikum ini menggunakan metode Lieberman Burchard adalah 0,
0846 md/dl dan ini termasuk rendah karena range normal yaitu 120 – 200
md/dl

adapun penyakit penyakit karena kolesterol rendah :

1. Aberalipoproteinemia
2. Hypobetolipoproteinemia
Penyakit karena kadar kolesterol tinggi :
1. Familia Tliperchoesterolemia
2. Xonchomas
3. Hipertensi
4. Diabetes
VIII. Kesimpulan

1. Prinsip pengukuran kadar kolesterol Lieberman-Burchard adalah

menggunakan alat spesifik berupa spektrofotometer dimana sampel
telah mengalami pengenceran sesuai volume pengenceran masing
masing
2. Kolesterol merupakan salah satu sterol penting yang terdapat
dalam jaringan dan lipoprotein plasma
3. Kadar kolesterol normal kurang dari 200 mg/dl
4. Pembagian kolesterol
a) Kolesterol LDL adalah jenis kolesterol yang berbahaya
karena jika kadarnya tinggi beresiko terkena penyakit
jantung dan stroke
b) Kolesterol HDL adalah kolesterol baik, karena akan
mengurangi kolesterol jahat
c) Tigliserida adalah lemak yang ada didalam darah dan di
berbagai organ tubuh
5. Hasil percobaan menunjukan bahwa sampel darah praktikan
memiliki kadar kolesterol yang rendah karena kadar kolesterol
yang nromal adalah 160-200 mg/dl
6. Fungsi Kolesterol :
a. Membuat hormon seks
b. membuat hormon korteks ordenal
c. membuat vitamin D
d. membuat garam empedu untuk menyerap lemak
IX. Daftar Pustaka
Fassenden, Ralp J Joan S. Fessenden. 2009. Kimia Organik jilid 2. Jakarta :
Erlangga
Murray, Robert K. 2014. Biokimia harper. Jakarta : EGC
Nilawati, Sri. 2008. Care Yourself Kolesterol. Jakarta : Penerbit plus