SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT

KANDIDAT PROBIOTIK ASAL NIRA AREN (Arenga pinnata

Mer.) PAPUA

PROPOSAL

Oleh
Pipit Novita Sari
NIM : 13010062

PROGRAM STUDI STRATA 1 (S1) FARMASI

SEKOLAH TINGGI TEKNOLOGI INDUSTRI DAN FARMASI
BOGOR
2017
 SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT
KANDIDAT PROBIOTIK ASAL NIRA AREN (Arenga pinnata
Mer.) PAPUA

PROPOSAL

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi Program
Studi S1 Farmasi Sekolah Tinggi Teknologi Industri dan Farmasi Bogor

Oleh
Pipit Novita Sari
NIM : 13010062

PROGRAM STUDI STRATA 1 (S1) FARMASI

SEKOLAH TINGGI TEKNOLOGI INDUSTRI DAN FARMASI
BOGOR
2017
 SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT
KANDIDAT PROBIOTIK ASAL NIRA AREN (Arenga pinnata
Mer.) PAPUA

Oleh
Pipit Novita Sari
NIM 13010004

Proposal ini telah di periksa dan disetujui,

Bogor, Mei 2017

Menyetujui
Tim Pembimbing

Dr. Sulistiani, M.Kes Dr. Anna P. Roswiem, MS.

Mengetahui
Puket I STTIF Bogor

Drs. Herson Cahaya Himawan, M.Si

 KATA PENGANTAR

Puji Syukur Alhamdulillah kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah
melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat meyelesaikan proposal
yang berjudul "Seleksi dan pengujian bakteri asam laktat kandidat probiotik asal nira
aren (Arenga pinnata Mer.) Papua”.
Proposal ini diajukan sebagai pertimbangan untuk melaksanakan penelitian
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi Program Studi Farmasi
di Sekolah Tinggi Teknologi Industri dan Farmasi Bogor.
Pembuatan proposal ini tidak mungkin terwujud tanpa bantuan pihak-pihak
yang memberi dukungan dan dorongan, oleh karena itu pada kesempatan ini peneliti
mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Ibu Siti Mariam, M.Farm., Apt. selaku Ketua Sekolah Tinggi Teknologi Industri
dan Farmasi Bogor
2. Ibu Triyani Sumiati, M.Si., Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Strata Satu
(S1) Sekolah Tinggi Teknologi Industri dan Farmasi Bogor.
3. Ibu Dr. Sulistiani, M. Kes selaku pembimbing 1 di Pusat Penelitian Biologi LIPI
yang telah membantu memberikan pengarahan dalam penulisan proposal ini.
4. Ibu Dr. Anna P. roswiem, M.Si selaku pembimbing 2 di Sekolah Tinggi
Teknologi Industri dan Farmasi Bogor yang telah membantu memberikan
pengarahan dalam penulisan proposal ini.
5. Para dosen pengajar yang memberikan ilmu selama berada di STTIF Bogor.
6. Keluarga yang memberikan doa dan motivasi serta dukungan moril maupun
materil dalam pengerjaan proposal ini.
7. Rekan mahasiswa yg telah banyak memberikan dukungan.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan proposal penelitian ini masih banyak
kekurangan, untuk itu saran dan kritik yang membangun sangat penulis harapkan.
Akhir kata penulis berharap semoga penulisan ini dapat bermanfaat bagi penulis
maupun rekan-rekan lainnya terutama masyarakat.
Bogor, Mei 2017

Penulis
 DAFTAR ISI
Halaman

KATA PENGANTAR..................................................................................................i
DAFTAR ISI...............................................................................................................iii
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................v
BAB 1 PENDAHULUAN............................................................................................1
1.1 Latar Belakang.........................................................................................1
1.2 Identifikasi Masalah................................................................................3
1.3 Batasan Masalah......................................................................................3
1.4 Kerangka Pemikiran................................................................................3
1.5 Hipotesis..................................................................................................3
1.6 Tujuan Penelitian.....................................................................................3
1.7 Manfaat Penelitian...................................................................................3
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA..................................................................................4
2.1 Nira Aren.................................................................................................4
2.2 Bakteri Asam Laktat................................................................................4
2.3 Probiotik..................................................................................................5
2.3.1 Syarat-syarat Bakteri Probiotik......................................................6
2.4 Antimikroba.................................................................................................7
2.4.1 Metode pengujian untuk antimikroba :..........................................8
2.5 Ketahanan terhadap Asam Lambung.......................................................8
2.6 Ketahanan terhadap Garam Empedu.......................................................9
2.7 Pertumbuhan Bakteri.............................................................................10
BAB 3 METODE PENELITIAN.............................................................................12
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian................................................................12
3.2 Bahan.....................................................................................................12
3.3 Alat........................................................................................................12
3.4 Metode dan Cara Kerja..........................................................................13
3.4.1 Sumber Bakteri Asam Laktat (BAL)...........................................13
 3.4.2 Peremajaan Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) asal Papua.........13
3.4.3 Penyiapan Media untuk Penanaman Isolat Bakteri Asam Laktat
(BAL) asal Papua........................................................................13
3.4.4 Penanaman Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) asal Papua.........13
3.4.5 Uji Antimikroba (Buntin et al., 2007)....................................................13
3.4.5.1 Penyiapan Media Uji (BHI, MHB 1,8% agar dan MHB 0,8%
agar)............................................................................................13
3.4.5.2 Penyiapan Bakteri Uji...............................................................14
3.4.5.3 Pengujian Aktivitas Antimikroba BAL terhadap Bacillus cereus
dan Escherichia coli....................................................................14
3.4.6 Uji Ketahanan terhadap Garam Rmpedu (Buntin et al.,2007).............15
3.4.6.1 Penyiapan Media Uji.................................................................15
3.4.6.2 Pengujian Ketahanan terhadap Garam Empedu........................15
3.4.7 Uji Ketahanan terhadap pH Rendah (Buntin et al,. 2007).....................15
3.4.7.1 Penyiapan Media GYP Agar.....................................................15
3.4.7.2 Penyiapan larutan NaCl untuk Pengenceran.............................15
3.4.7.3 Penyiapan PBS..........................................................................16
3.4.7.4 Pengujian Ketahanan terhadap pH Rendah...............................16
3.4.8 Uji Ketahanan terhadap Simulated Gastric Juice dan Simulated
Intestinal Juice......................................................................................16
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................18
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
Lampiran 1. Bagan Alur Penelitian.............................................................................22
Lampiran 2. Uji Antimikroba......................................................................................23
Lampiran 3. Uji Ketahanan garam empedu.................................................................24
Lampiran 4. Uji ketahanan terhadap pH rendah..........................................................25
Lampiran 5. Bagan Alur Penelitian.............................................................................25

v
vi
 BAB 1
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup yang apabila
dikonsumsi dalam jumlah yang cukup dapat memberikan manfaat kesehatan bagi
yang mengkonsumsinya (FAO, 2002). Definisi lain disampaikan oleh Havenar et al.,
(1992) probiotik merupakan sebagai kultur mikroba tunggal atau campuran yang
dapat diaplikasikan pada hewan atau manusia yang memiliki efek menguntungkan
dengan cara memperbaiki sifat-sifat mikroflora indigenus pada saluran pencernaan.
Definisi lain juga di kemukakan oleh Waspodo (1997) minuman probiotik adalah
minuman yang mengandung bakteri seperti bakteri asam laktat (BAL) yang
menguntungkan bagi saluran pencernaan karena dapat meningkatkan keseimbangan
mikroflora usus dan mampu bertahan hidup dalam keasaman lambung sehingga dapat
menempati usus dalam kuantitas yang cukup banyak.
Manfaat probiotik sangat beraneka ragam yaitu antara lain meningkatkan
ketahanan terhadap penyakit infeksi saluran pencernaan dan menurunkan risiko
terjadinya tumor dan kanker kolon (Roos dan Katan, 2000), menurunkan konsentrasi
kolesterol serum darah (Rodas et al., 1996), mengurangi reaksi lactose intolerance
(Mustapha et al., 1997), menurunkan tekanan darah/antihipertensi (Yamamoto et al.,
1999), mempengaruhi respon imun (Erickson dan Hubbard, 2000), bersifat
antimutagenik (Usman dan Hosono, 1999), serta bersifat antikarsinogenik (Fernandes
dan Shahani, 1990).
Menurut Rolfe (2000) probiotik terdiri dari bakteri asam laktat yang memiliki
kemampuan untuk memelihara keseimbangan mikroflora normal usus, menghambat
bakteri patogen, dan meningkatkan sistem imun. Kemampuan dan sifat asam laktat
yaitu dapat mengasamkan lingkungan dalam usus sehingga dapat menghilangkan
bakteri patogen dan berdampak pada penyerapan nutrisi yang baik.

1
 2

Bakteri asam laktat mampu hidup didalam saluran pencernaan, maka dari itu
BAL memiliki peran yang cukup penting bagi kehidupan manusia. Selain itu, BAL
juga memiliki kemampuan untuk menjaga kesehatan tubuh karena BAL dapat hidup
disaluran cerna yang mampu menekan pertumbuhan bakteri patogen. Parameter ini
yang dapat membuat BAL dapat memiliki potensi sebagai probiotik.
Beberapa penelitian yang berkembang belakangan ini yaitu mengisolasi BAL
dari bahan - bahan asli Indonesia dan juga beberapa minuman fermentasi Indonesia.
Penelitian tentang BAL yang berasal dari produk dan minuman fermentasi asli
Indonesia ini memiliki tujuan untuk meningkatkan derajat kesehatan masyarakat
Indonesia, dimana bahan - bahan yang digunakan mudah didapat dan cukup
ekonomis. Salah satu tanaman yang mempunyai potensi untuk diisolasi BAL nya
adalah nira aren (Arenga pinnata Mer.)
Tanaman aren merupakan salah satu jenis tanaman palma yang penyebaran
cukup luas di berbagai daerah di Indonesia (Ditjenbun, 2004). Nira merupakan cairan
yang disadap dari bagian pangkal bunga jantan aren yang belum mekar (Abdullah et
al., 2015). Muralidharan dan Deepthi (2013) menyatakan bahwa total kandungan
gula yang terdapat pada 100 mL nira yaitu sebanyak 14,40 gram. Nira juga
mengandung protein sebanyak 0,23 – 0,32 gram dan juga berbagai vitamin seperti
asam sitrat 0,050 gram, asam askorbat 16 – 30 gram, fosfor 7,59 gram, besi 0,15
gram. Tingginya kandungan nutrisi pada nira ini menjadi penyebab mudahnya
terkontaminasi oleh berbagai mikroorganisme salah satunya yaitu BAL.
Sumanti (1994) menyatakan bahwa perubahan nira aren segar dimulai dari
terbentuknya senyawa asam laktat, alkohol dan asam asetat. Jenis bakteri yang
mengkontaminasi nira terdiri dari golongan bakteri asam laktat (BAL), khamir dan
bakteri asam asetat. Beberapa jenis BAL yang tumbuh pada nira segar adalah
Leuconostoc spp. dan Lactobacillus spp. Jenis khamir umum yang mengubah menjadi
alkohol adalah Saccharomyces cerevisiae. Fermentasi akhir dilakukan oleh
Acetobacter spp., Schizosaccha, Pichia spp., Aspergillus, Mucor dan Rhyzopus spp.
Jenis mikroba dan jumlah mikroba yang tumbuh pada nira selama fermentasi sangat
beragam tergantung komposisi nira, musim dan cara penyadapannya.
 3

Untuk itu perlu dilakukan penelitian mengenai potensi BAL asal nira aren
yang berasal dari Papua yang kemudian diseleksi dan diuji untuk mendapatkan
kandidat dari probiotik.

1.2 Identifikasi Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas maka perlu dilakukan seleksi nira aren yang
berasal dari Papua untuk mencari kandidat probiotik.

1.3 Batasan Masalah

Penelitian ini difokuskan dalam seleksi BAL asal nira aren dalam mencari
kandidat dari probiotik. Isolat nira aren ini akan dilakukan beberapa uji untuk
menentukan apakah isolat dari Nira Papua dapat menjadi kandidat dari probiotik.

1.4 Kerangka Pemikiran

Sebanyak 52 isolat BAL yang telah diisolasi dari nira aren Papua di seleksi
dan diuji secara in vitro. Uji in vitro yang dilakukan meliputi uji anti mikroba, uji
garam empedu. Isolat yang tahan pada garam empedu kemudian di uji ketahanan
terhadap pH. Dari uji pH dilanjutkan dengan uji pankreatin dan uji pepsin. Setelah
isolat yang telah di uji secara in vitro kemudian diperbanyak pada media semi padat
(beras, dedak, tapioka dan terigu).

1.5 Hipotesis
Didapatkan BAL kandidat probiotik yang berasal dari nira aren Papua.

1.6 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan seleksi BAL asal nira aren Papua yang mempunyai
potensi menjadi kandidat probiotik.

1.7 Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang
BAL asal nira aren Papua dapat menjadi kandidat probiotik.
 BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Nira Aren

Arenga pinnata Mer. (tanaman aren) adalah salah satu tanaman dari famili
Arecaceae yang banyak ditanam di India (Muralidharan dan Deepthi, 2013). Nira
merupakan cairan manis yang diperoleh dari air batang atau padat pula dari getah
tandan bunga tanaman seperti bit, tebu, sergum, siwalan, dan dari tanaman palma
lainnya seperti kelapa, aren, sagu, dan lain sebagainya. Nira aren merupakan salah
satu sumber bahan pangan dalam proses pembuatan gula. Pada umumnya, tumbuhan
aren tumbuh secara liar. Keberadaan tumbuhan aren pun merata di seluruh Indonesia.
Secara Tradisional, masyarakat mengolah nira aren menjadi gula batu atau gula
merah, dan juga gula semut yang berbentuk kristal (Burhanuddin 2005).
Komposisi Kimia Nira Aren dicantumkan dalam tabel 1:
Table 1. Komposisi nira aren dalam 100 mL

Komponen Jumlah

Sukrosa 3%
Glukosa 1,2%
Fruktosa 12%
Rafinosa 0.8%
Air 82,76%
Abu 0,24%

Sumber : Depkes. R.I., (1981).

2.2 Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat didefenisikan sebagai kelompok bakteri yang memproduksi
asam laktat, baik sebagai satu – satunya produk maupun sebagai produk utama pada
metabolisme karbohidrat (Hasan, 2006). Bakteri asam laktat merupakan bakteri gram

4
positif, berbentuk batang atau bulat, tidak membentuk spora, fermentasi fakultatif
anaeorob, tidak mempunyai sitokrom, tidak memiliki kemampuan untuk mereduksi

5
 6

nitrat, oksidasi negatif, katalase negatif, motilitas negatif dan kemampuan

memfermentasi glukosa menjadi asam laktat (Carr et al., 2002). Istilah lain
dikemukakan oleh Pato (2003), BAL didefinisikan sebagai suatu kelompok bakteri
gram positif, tidak menghasilkan spora, berbentuk bulat atau batang yang
memproduksi asam laktat sebagai produk akhir metabolik utama selama fermentasi
karbohidrat.
Bakteri Asam Laktat memiliki 2 tipe fermentasi, yaitu homofermentatif dan
heterofermentatif (Davidson dan Braner, 1983). Bakteri asam laktat yang tergolong
homofermentatif dapat mengubah 95 % dari glukosa atau heksosa lainnya menjadi
asam laktat. Bakteri asam laktat heterofermentatif mengubah glukosa dan heksosa
lainnya menjadi asam laktat, etanol, asam asetat, asam format dan CO 2 dalam jumlah
yang hampir sama (Frazier dan Westhoff, 1988). BAL ada yang bersifat fakultatif
anaerob, yaitu BAL dapat hidup pada keadaan adanya oksigen, tetapi tidak dapat
menggunakannya untuk respirasi, sabaliknya satu – satunya cara BAL memperoleh
energi adalah melalui fermentasi gula (Brock dan Madigan, 1991).

2.3 Probiotik
Probiotik memiliki sejarah yang cukup panjang, yang dimulai dari pencatatan
pertama dikonsumsinya minuman yang mengandung bakteri oleh manusia yakni lebih
dari 2000 tahun yang lalu. Peradaban awal dari probiotik ditetapkan secara ilmiah
oleh Metchnikoff pada Pasteur Institue di Paris. Metchnikoff (1907) mengamati umur
petani di Bugarian yang panjang dan dihubungkan dengan tingginya konsumsi susu
asam. Pada penelitian tersebut, ia berhipotesis bahwa mikroflora normal usus dapat
memberikan efek samping pada inang dan konsumsi beberapa bakteri dapat
memberikan efek sebaliknya (Desai, 2008).
Aktivitas probiotik terbagi atas 3 aspek seperti sebagai nutrisi, fisiologis dan
aspek antimikroba. Aspek nutrisi yaitu adanya enzim laktase untuk membantu
metabolisme komponen makanan, sintesis beberapa jenis vitamin (K, folat,
piridoksin, pantotenat, biotin dan riboflavin) dan mengurangi senyawa racun yang
ada pada makanan dalam usus. Aspek fisiologis meliputi kemampuan menjaga
 7

keseimbangan komposisi mikroflora usus dan menstimulasi sistem kekebalan usus.

Aspek efek antimikroba meliputi kemampuan untuk meningkatkan ketahanan
terhadap mikroba patogen (Naidu dan Clemens, 2000).
Didalam tubuh, probiotik harus dapat bertahan dalam kondisi di lingkungan
lambung yang memiliki suasana asam. Probiotik juga harus bertahan dalam usus. Di
usus terdapat enzim enzim pancreas dan empedu yang bersifat basa. Setelah probiotik
masuk ke dalam usus halus, probiotik akan membentuk suatu koloni dilapisan
mukosa usus. Koloni dari probiotik inilah yang akan meningkatkan sistem kekebalan
usus, dengan cara koloni ini menggantikan posisi bakteri yang bersifat patogen,
menghasilkan antioksidan dan juga efek lainnya yang bermanfaat bagi tubuh
manusia. (Shah, 2000)
Rolfe (2000) menyatakan bahwa probiotik dapat berupa bakteri Gram positif,
Gram Negatif, khamir atau fungi. Namun mikroba-mikroba yang umum digunakan
dalam pembuatan minuman dan makanan probiotik terutama berasal dari kelompok
BAL. Bakteri asam laktat sering digunakan sebagai probiotik karena kebanyakan
strainnya tidak patogen, bahkan beberapa strain telah mendapatkan status GRAS
(Generally Recognized As Safe) dari FDA (Food and Drug Administration). Selain itu,
kemampuannya untuk hidup di dalam saluran pencernaan dapat menekan
pertumbuhan bakteri patogen enterik sehingga dapat dimanfaatkan untuk menjaga
kesehatan tubuh dan potensi ini yang menyebabkan BAL digunakan sebagai
probiotik.
Secara umum bakteri probiotik hidup didalam saluran pencernaan dan
bermutualisme dengan tubuh inangnya, hidup pada pH 2-4, tidak mengakibatkan hal
yang negatif pada tubuh, tidak patogen, umumnya tidak membentuk spora, umumnya
anaerob, tidak mengganggu ekosistem tubuh, hidup dan tumbuh didalam usus (Fuller,
1989).

Syarat-syarat Bakteri Probiotik

Salminen et al., (2004) mengemukakan bahwa terdapat beberapa kriteria yang
harus dipenuhi oleh suatu probiotik, diantaranya adalah :
 8

1. Bersifat nonpatogenik dan mewakili mikrobiota normal pada usus inangnya, dan
terus hidup pada kondisi asam lambung dan konsentrasi garam empedu yang tinggi
dalam usus halus.
2. Dapat bermetabolisme dan tumbuh dengan cepat, dan juga terdapat dalam jumlah
yang tinggi dalam usus halus.
3. Mampu mengkolonisasi beberapa bagian dari saluran usus inangnya,
4. Mampu memproduksi asam-asam organik secara efisien dan memiliki sifat
antimikroba terhadap bakteri patogen,
5. Mudah diproduksi, mampu tumbuh dalam sistem produksi skala besar, dan hidup
selama kondisi penyimpanan.

Beberapa kriteria menurut Shortt (1999), yang harus dipertimbangkan untuk

mendapatkan produk probiotik diantaranya yaitu :
a. Spesies bakteri probiotik sebaiknya merupakan flora yang normal di dalam usus,
guna mempermudah bakteri untuk menyesuaikan diri dengan lingkungannya.
b. Tidak memiliki sifat patogen.
c. Bersifat toleran terhadap asam dan garam empedu.
d. Mampu untuk dapat menempel dan mengkolonisasi sel usus.
e. Memiliki aktivitas antagonistik terhadap mikroba patogen enterik.
f. Memiliki pengaruh yang menguntungkan terhadap kesehatan.
g. Dapat bertahan dalam proses pengolahan dan selama waktu penyimpanan.
h. Produk dari probiotik diharapkan dapat memiliki jumlah sel yang dapat hidup yang
besar (107 – 109) CFU/mL.

2.4 Antimikroba
Antimikroba merupakan suatu bahan yang dapat mengganggu pertumbuhan
dan metabolisme mikroorganisme. Penggunaan bahan antimikroba merupakan suatu
usaha untuk dapat mengendalikan bakteri maupun jamur, yaitu segala kegiatan yang
dapat menghambat, atau mematikan mikroorganisme. Tujuan utama pengendalian
mikroorganisme untuk mencegah penyebaran penyakit, mematikan mikroorganisme
 9

patogen pada inang, dan mencegah pembusukan serta perusakan oleh

mikroorganisme. Beberapa hal yang harus dipenuhi oleh suatu bahan antimikroba,
yaitu mampu mematikan mikroorganisme, mudah larut dan bersifat stabil, tidak
bersifat racun bagi manusia dan hewan, efektif pada suhu kamar dan suhu tubuh,
tidak menimbulkan karat dan warna, berkemampuan menghilangkan bau yang kurang
sedap, murah dan mudah diperoleh (Pelczar & Chan 1988). Antimikroba memiliki
dua cara untuk menghambat pertumbuhan mikroba, yaitu bakteriostatik atau
bakterisida (Suwandi, 1992).

2.4.1 Metode pengujian untuk antimikroba :

Pengujian antimikroba dapat dilakukan dengan 2 metode sebagai berikut :
1. Metode dilusi
Metode ini digunakan untuk menentukan konsentrasi minimum dari zat
antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Metode ini dimulai
dengan mencampurkan zat pada suatu media pertumbuhan, dan kemudian
diinokulasikan dengan bakteri indikator (uji) yang selanjutnya diinkubasikan.
Hasilnya dapat dilihat dengan mengamati ada atau tidaknya pertumbuhan
bakteri uji.
2. Metode difusi
Metode ini dilakukan untuk mengetahui daya hambat pertumbuhan antimikroba
dengan cara mengukur diameter daya hambat (DDH) di daerah cakram atau
silinder yang berisi antimikroba/antibakteri (Pratiwi, 2008).

2.5 Ketahanan terhadap Asam Lambung

Ketahanan terhadap asam lambung merupakan salah satu syarat penting suatu
isolat untuk dapat menjadi probiotik. Hal ini disebabkan bila isolat tersebut masuk ke
dalam saluran pencernaan manusia, maka ia harus mampu bertahan dari pH asam
lambung yaitu sekitar 2,5 (Jacobsen et al, 1999).
Getah lambung merupakan hasil sekresi dari lambung. Getah lambung merupakan
cairan jernih berwarna kuning pucat yang mengandung HCl 0,2 – 0,5% dengan pH
sekitar 1 (bila lambung dalam kondisi benar-benar kosong). Getah lambung
 10

mengandung air (97 – 99%), musin (lendir) serta garam anorganik, enzim pencernaan
(pepsin serta renin) dan lipase.
Chou dan Weimer (1999) menyatakan bahwa waktu yang diperlukan saat
bakteri mulai masuk sampai keluar dari lambung sekitar 90 menit. Jadi isolat yang
diseleksi untuk digunakan sebagai probiotik harus mampu bertahan dalam keadaan
asam lambung selama sedikitnya 90 menit.

2.6 Ketahanan terhadap Garam Empedu

Garam Empedu merupakan sebuah senyawa amphipatik, yaitu suatu senyawa
yang salah satu sisinya dapat larut dengan air (polar), dan salah satu sisinya yang lain
larut dalam lemak (non polar) (Saunders et al., 2005). Garam empedu merupakan
senyawa amphipatik, hal tersebut yang menyebabkan garam empedu mampu
mengemulsifikasi lemak dan juga mempengaruhi kehidupan mikroorganisme dalam
saluran pencernaan saat memasuki usus halus. Fungsi garam empedu di dalam usus
halus yaitu sebagai emulgator pada proses pencernaan lemak (emulsifikasi lemak).
Emulsifikasi lemak adalah tahapan proses awal dari metabolisme lemak, yaitu
proses pencampuran (emulsi) lemak yang berukuran besar menjadi ukuran lebih
kecil, sehingga lemak yang telah diemulsifikasikan tadi pada larut dalam air dan
memungkinkan enzim lipase pankreas bekerja (Guyton dan Hall, 1996).
Keberadaan garam empedu di dalam usus halus bagi mikroorganisme disebut
“Biological detergents”, yaitu cairan yang memiliki kemampuan untuk melarutkan
fosfolipid, kolesterol dan protein. Sebagian besar dari senyawa tersebut dapat
menyusun membran sel, sehingga menyebabkan sel mikroorganisme menjadi hancur
(lysis). Konsentrasi garam empedu yang tinggi akan menjadi racun dan zat
antimikroba yang sangat keras (Belgey et al., 2002). Menurut Bezkorovainy (2001),
cairan empedu yang terdapat di usus halus juga dapat menghambat pertumbuhan
mikroba yang ada. Maka dari itu bakteri harus dapat tahan terhadap pengaruh garam
empedu.
 11

2.7 Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan dapat diartikan sebagai pertambahan secara teratur disemua
komponen dalam sel hidup. Pertumbuhan pada mikroorganisme bersel satu
merupakan bertambahnya jumlah sel. Pada pertumbuhan bakteri asam laktat polanya
mengikuti pertumbuhan mikroorganisme pada umumnya. Waktu yang dibutuhkan
dan bentuk yang dihasilkan pada setiap fase pertumbuhan tergantung dari jenis dan
media biakan yang digunakan.
Pada umumnya, pola pertumbuhan pada bakteri dibagi menjadi 4 fase, yakni :
(Ferdiaz, 1992)
1. Lag Phase (Fase Penyesuaian diri)
Pada fase ini bakteri akan menyesuaikan diri pada lingkungan barunya, di fase
belum terjadi pembelahan sel sehingga tidak ada kenaikan jumlah sel
melainkan pertambahan ukuran sel, peningkatan kandungan protein sel, DNA,
dan metabolismenya.
2. Logaritmik phase (Fase pembelahan)
Pembelahan sel mengikuti kurva logaritmik. Sel akan membelah dengan cepat
dan juga konstan. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi
oleh medium tempat tumbuhnya, seperti pH kandungan nutrient dan kondisi
lingkungan.
3. Stasionery phase (fase stasioner)
Pada fase ini nutrisi mulai berkurang. Pada fase ini sel – sel mulai ada yang
mati dan pertumbuhannnya terhambat. Selain itu, dengan bertambahnya
jumlah sel, mengakibatkan meningkatnya produk metabolisme yang mungkin
beracun atau dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme tersebut
sehingga populasi sel tetap (jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel
yang mati).
4. Period of decline (Fase kematian)
 12

Pada fase ini terjadi akumulasi bahan toksik, nutrien yang diperlukan oleh
mikroorganisme berkurang sehingga bakteri akan memasuki fase kematian.
Kecepatan kematian dipengaruhi oleh kondisi nutrien, lingkungan dan bakteri
itu sendiri
 BAB 3
METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei sampai juli 2017 di Laboratorium
Mikrobiologi Industri, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI, Cibinong
Science Center, Cibinong, Jawa Barat.

3.2 Bahan
Brain-Heart Infussion (BHI) (OXOID CM1135), de Man Rogosa Sharpe
Broth (MRSB) (MERCK 1.10661.0500), Agar Powder-Bacteriological (HIMEDIA
GRM026), Potato Dextrose Agar (PDA) (DIFCOTM 213400), Yeast Extract
(BACTOTM 212750), Mueller-Hinton Broth (MHB) (OXOID CM0405), Tween 80
(OMNIPUR), D-Glukosa (MERCK 1.08337.1000), Pepton (BACTOTM 211677),
Kalsium Karbonat (CaCO3) (MERCK 1.02066.0250), Ox-Bile Dehydrated Purified
(FLUKA 70168), HCl 5M, NaOH 0,1M, NaCl 0,85%, pepsin (MERCK), KCl
(MERCK) dan NaHCO3 (MERCK), KH2PO4 (MERCK), Na2HPO4.2H2O (MERCK),
NaCl (MERCK), Spiritus, bakteri Escherichia coli, bakteri Bacillus cereus, isolat
Nira Aren asal Papua koleksi LIPI dan akuadest.

3.3 Alat
Cawan petri steril (NORMAX), Botol schott (100mL, 250mL, 500mL)
(DURAN), Pipet tetes, Bunsen, Alat Gelas (PYREX), Micropipet (100-1000µL)
(GILSON), Micropipet (2-20µL) (EPPENDORF), Micropipet (1-5mL) (PIPETPAL),
Autoclave (HICLAVE HVE-50), Laminar Air Flow (SANYO MCV – B9IF (T)),
Microtube, Sentrifuge (), Vortex mixer (FISHER SCIENTIFIC), pH meter (TOA-DK
HM-25G), Inkubator (ISUZU), Oven (ISUZU), Microwave (PANASONIC),
Timbangan Analitik (VIBRA AJ), Anaerocult, Kertas Perkamen, Speader, Penggaris.

13
 14

3.4 Metode dan Cara Kerja

3.4.1 Sumber Bakteri Asam Laktat (BAL)

Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) yang digunakan merupakan koleksi

dari laboratorium Mikrobiologi Industri, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian
Biologi, Lembaga Ilmu Penelitian (LIPI), Cibinong, Kabupaten Bogor.

3.4.2 Peremajaan Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) asal Papua

Sebanyak satu ose single koloni 52 isolat BAL Papua masing – masing
diinokulasikan ke dalam media GYPA steril dengan metode double kuadran
kemudian diinkubasikan selama 24 jam dengan suhu 37ºC.

3.4.3 Penyiapan Media untuk Penanaman Isolat Bakteri Asam Laktat

(BAL) asal Papua
Sebanyak 10,4 gram MRS broth dilarutkan dalam 200 mL akuadest.
Kemudian dipanaskan menggunakan microwave hingga semua bahan larut.
Setelah larut, media ditunggu hingga hangat dan kemudian dituang sebanyak 1
mL ke dalam microtube. Selanjutnya disterilisasi pada suhu 121ºC selama 15
menit.

3.4.4 Penanaman Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) asal Papua

Sebanyak satu ose single koloni 52 Isolat BAL Papua masing – masing
diinokulasikan ke dalam 1 mL media MRS broth steril pada microtube
kemudian diinokulasikan pada suhu 37ºC selama 24 jam.

3.4.5 Uji Antimikroba (Buntin et al., 2007)

3.4.5.1 Penyiapan Media Uji (BHI, MHB 1,8% agar dan MHB 0,8% agar)
 Sebanyak 10,44 gram BHI dilarutkan dalam 200 mL akuadest di botol
schott, dipanaskan dalam microwave hingga larut dan dituang ke
 15

dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL per tabung. Kemudian disterilkan

pada suhu 121ºC selama 15 menit.
 Sebanyak 4,2 gram MHB 1,8% agar dilarutkan dalam 200 mL
akuadest di botol schott, dipanaskan dalam microwave hingga larut.
Dituang masing – masing 20 mL pada tabung falcon. Kemudian
disterilkan pada suhu 121ºC selama 15 menit. Media uji MHB 1,8%
agar yang telah disterilisasi kemudian dituang pada cawan petri steril
dan ditunggu hingga beku.
 Sebanyak 2,1 gram MHB 0,8% agar dilarutkan dalam 100 mL
akuadest di botol schott. Kemudian disterilkan pada suhu 121ºC
selama 15 menit.

3.4.5.2 Penyiapan Bakteri Uji

Sebanyak satu ose single koloni bakteri Escherichia coli dan Bacillus
cereus diinokulasikan pada masing – masing 5 mL media BHI steril kemudian
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam.

3.4.5.3 Pengujian Aktivitas Antimikroba BAL terhadap Bacillus cereus

dan Escherichia coli
Sebanyak 7 µL bakteri uji yang telah diinkubasi selama 24 jam
dimasukan ke dalam 100 mL MHB 0,8% agar steril, diaduk hingga homogen.
Kemudian sebanyak 5 mL bakteri uji pada media MHB 0,8% agar tadi di tuang
ke dalam cawan petri steril yang berisi 20 mL MHB 1,8% agar steril yang telah
beku dan ditunggu hingga beku. Selanjutnya media yang berisi kombinasi MHB
1,8% agar dengan 0,8% agar yang berisi bakteri uji diberi nomor sesuai kode
isolat. Kemudian media tersebut dilubangi menggunakan sedotan steril yang
memiliki diameter 5mm. Setelah itu sebanyak 50 µL isolat BAL Papua pada
media MRS broth dipipet dan dituang pada media yang mengandung bakteri uji
(pengujian dilakukan secara duplo). Kemudian diinkubasi 37ºC selama 48 jam.
Kontrol positif uji ini digunakan antibiotik kloramfenikol. Selanjutnya masing –
masing isolat diukur zona hambatnya dengan menggunakan penggaris.
 16

3.4.6 Uji Ketahanan terhadap Garam Rmpedu (Buntin et al.,2007)

3.4.6.1 Penyiapan Media Uji

Dibuat media MRS broth 1,8% agar dengan konsentrasi garam empedu
(oxgall) 1000, 2000, 3000, dan 4000 ppm dan 0,5% CaCO3 masing – masing
200 mL. Kemudian media disterilisasi pada suhu 121ºC selama 15 menit.

3.4.6.2 Pengujian Ketahanan terhadap Garam Empedu

Media uji yang telah disterilisasi dengan konsentrasi oxgall 1000, 2000,
3000, dan 4000 ppm dituang pada cawan petri steril. Kemudian media
ditunggu hingga beku. Media yang telah beku selanjutnya diberi nomor sesuai
kode isolat BAL Papua. MRS yang mengandung oxgall 1000, 2000, 3000, dan
4000 ppm yang telah membeku kemudian diinokulasikan mesing – masing 5
µL. Isolat BAL yang telah ditumbuhkan dalam media MRS broth (uji
dilakukan secara duplo). Selanjutnya BAL diinkubasi secara anaerobic pada
suhu 37ºC selama 48 jam. Kemudian setelah 48 jam diamati pertumbuhannya.

3.4.7 Uji Ketahanan terhadap pH Rendah (Buntin et al,. 2007)

3.4.7.1 Penyiapan Media GYP Agar
Media GYP agar dibuat sebanyak 3000 mL dengan komposisi glukosa
(10g/L), yeast extract (5 g/L), pepton (5 g/L), tween 80 (0,5 mL/L), salt
solution 5 mL/L, CaCO3 (0,5%), dan agar (1,8%). Kemudian disterilisasi pada
suhu 121ºC selama 15 menit. Selanjutnya dituang pada cawan peti steril dan
ditunggu hingga beku.

3.4.7.2 Penyiapan larutan NaCl untuk Pengenceran

Sebanyak 4,25 gram NaCl 0,85% dilarutkan dalam 500 mL akuadest di
botol schott kemudian dipipet 0,9 mL dan dimasukan ke dalam microtube.
Kemudian disterilisasi pada suhu 121ºC selama 15 menit.
 17

3.4.7.3 Penyiapan PBS

Phosphate – Buffered Saline (PBS) dibuat dengan komposisi NaCl (9
g/L), Na2HPO4.2H2O (9 g/L) dan KH2PO4 (1,5 g/L) pH 7,4; 2,0; dan 2,5 masing
– masing sebanyak 100 mL. Campuran bahan – bahan tersebut dihomogenkan
menggunakan magnetic stirrer. Kemudian disterilisasi pada suhu 121ºC selama
15 menit. Setelah dilakukan sterilisasi dicek kembali pHnya menggunakan pH
meter (apabila pH tidak sesuai, ditambahkan HCl atau NaOH). Setelah pH
sesuai kemudian disterilisasi ulang pada suhu 121ºC selama 15 menit.

3.4.7.4 Pengujian Ketahanan terhadap pH Rendah

Isolat BAL yang tahan terhadap garam empedu dipipet masing – masing
sebanyak 20 µL kemudian dimasukkan kedalam microtube yang berisi 0,5 mL
MRS broth. Diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah 24 jam isolat
tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 5400 rpm selama 15 menit. Supernatan
dibuang. Sel kemudian dicuci dengan PBS pH 7,4 sebanyak 1 mL, kemudian
disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5400 rpm selama 5 menit (pencucian
dilakukan 1 kali). Setelah sel dicuci, ditambahkan PBS pH 2,5 dan 2,0 pada
masing – masing microtube sebanyak 1 mL. Selanjutnya sebanyak 100 µL
ditambahkan ke dalam 900 µL NaCl 0,85% kemudian dilakukan pengenceran
sampai 10-5 untuk pengamatan pada jam ke-0 dan jam ke-4. Dari 5 pengenceran
tersebut diambil masing – masing pH (2,0 dan 2,5) sebanyak 100 µL,
ditumbuhkan pada media GYP agar kemudian disebar menggunakan spreader.
Diinkubasi pada suhu 37º C selama 48 jam. Koloni BAL yang tumbuh
kemudian dihitung.

3.4.8 Uji Ketahanan terhadap Simulated Gastric Juice dan Simulated Intestinal
Juice
Uji ketahanan terhadap Simulated Gastric Juice (SGJ) dilakukan dengan
metode plate count. Ketahanan BAL dilakukan dalam larutan saline 5% yang
ditambahkan pepsin (3 g/L), KCl (1,25 M) dan NaHCO 3 (0,45 M). Kemudian
 18

ditambahkan HCl hingga diperoleh pH 2,0. Isolat kemudian diinokulasi ke dalam 10

mL larutan SGC steril, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37ºC selama 90 menit.
Setelah dilakukan pengujian dalam SGJ. Isolat selanjutnya diuji terhadap
Simulated Intestinal Juice (SIJ). Uji ini menggunakan konsentrasi garam empedu
yang terbuat dari larutan KH2PO4 0,05M dengan pH 8,2 ditambah dengan garam
empedu sebesar 0,5% dan pancreatin (1 mg/mL). Isolat BAL yang telah
diinokulasikan di dalam SGJ steril di atas kemudian diambil sebanyak 1mL dan
diinokulasikan kembali ke dalam 10 mL larutan SIJ steril. Selanjutnya, diinkubasi
pada suhu 37ºC selama 60 menit. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh kemudian
dihitung.
 DAFTAR PUSTAKA

Abdullah, W.,Usman, R., Raden, I., Sitti, A., Ilma, S.,Zulfikar, L., Rianda, B dan
Abdi, L. 2015. Potency of Natural Sweetener : Brown Sugar. Transactions on
Business and Economics.12(1).12-23.

Begley, M., C. G. M. Gahan, and C. Hill. 2002. Bile Stress Response In Listeria
monocytogenes LO28: Adaptation, Cross-Protection, And Identification Of
Genetic Loci Involved In Bile Resistance. Appl. Environ. Microbiol.

Bezkorovainy, A., 2001. Probiotics: Determinants Of Survival And Growth In The

Gut. Am.J. Clin. Nutr. 73

Brock, T.D., M. J. Madigan.1991. Biology of Microorganisms. 6th Edition. New

Jaersey: Prentice Hall.

Buntin N, Chanthachum S, dan Hongpattarakere T. 2007. Screening of Lactic Acid

Bacteria from Gastrointestinal tracts of Marine Fish for their Potemtial use
as Probiotics. Songklanakarin Journal of Science and Technology. 30 (1): 141
– 148

Burhanuddin, R. 2005. Prospek Pengembangan Usaha Koperasi Dalam Produksi

Gula Aren. Jakarta

Carr FJ, Hill D, Maida N. 2002. The lactic acid bacteria: a literature survey. Crit Rev
Microbiol 28: 281-370.

Chou, L.S. dan Weimer, B. 1999. Isolation and Characterization of Acid- and Bile-
Tolerant Isolates From Strains of Lactobacillus Acidophilus. J. Dairy Sci. 82:
23-31.

Davidson, P.M. dan A.L. Braner. 1983. Antimicrobials in Food. 2nd Ed. New York,
Marcel Dekker Inc.

De Roos NM dan Katan MB. 2000. Effect of probiotic bacteria on diarrhea, lipid
metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988
and 1998.

19
Ditjend Perkebunan, 2004. Perkembangan Aren di Indonesia. Prosiding Seminar
Nasional . Tondano. 9 juni 2004. Balai Penelitian Tanaman Kelapa dan Palma
Lain.

20
 21

Ferdiaz S. Mikrobiologi Pangan. Cetakan 1. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta

1992.
Fernandes, C. F. and Shahani, K. M. 1990. Anticarcinogenic and Immunological
Properties of Dietary Lactobacilli. J. Food Prot. 53:704.

Frazier, W. C.dan D. C. Westhoff. 1978. Food Microbiology 4 th edition. New York:

McGrawHill Book. Publishing. Co. Ltd.

Fuller. 1989. Energetics of Microbial Growth. John Wiley and Sons, New York

Guyton, A.C. and Hall, J.E., 2006. Textbook of Medical Physiology. 11th ed.
Philadelphia, PA, USA: Elsevier Saunders

Havenar R, BT Brink dan JHJ Huis in’t Veld. 1992. Selection of strains for probiotic
use.

Hassan, Z. H. 2006. Isolasi Lactobacillus, Bakteri Asam Laktat dari Feses dan Organ
Saluran Pencernaan Ayam. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan
Veteriner. Banjarbaru. Kalimantan Selatan.
Jacobsen, C.N., Rosenfeldt Nielsen, V., Hayford, A.E., Moller, P.L., Michaelsen,
K.F., Paerregaard, A., Sandstrom, B., Tvede, M., and Jakobsen, M. 1999.
Screening of probiotic activities of forty-seven strains of Lactobacillus spp. by
in vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected
strains in humans. Appl. Environ. Microbiol. 65

Kozaki M, Uchimura Y, Okada S. 1992. Manual for isolation and identification of

lactic acid bacteria. Japan. Asakura Shioteng.

Muralidharan, K and Deepthi, N. 2013. Coconut Neera- the Hidden Unexplored

Treasure. Indian Coconut Journal.4(8):1-20.

Mustapha, A., Tianan-Jiang, and Savaiano, D. A. 1997. Improvement of Lactose

Digestion by Human Following Ingestion of Unfermentes Acidophilus Milk:
Influence of Bile Sensitivity, Lactose Transport and Acid Tolerance of L.
acidophilus. J. Dairy Sci. 80:1537-1545

Naidu AS, dan RA Clemens. 2000. Probiotics. in: Natural Food Antimicrobial
Systems. Naidu A.S. (Ed). Cambridge: CRC Press, LLC

Pato,U. 2003. Potensi Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari Dadih untuk
Menurunkan Resiko Penyakit Kanker. Jurnal Natur Indonesia 5(2): 162166.
 22

Pelczar, M.J. dan Chan, E. C. S., 1988, Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 1, UI Press,
Jakarta.

Pratiwi, ST. (2008). Mikrobiologi Farmasi. Yogyakarta: Penerbit Erlangga.

Rodas, B. Z. de, Gilliland, S. E., and Maxwell, C. V. 1996. Hypocholesterolemic
Action of L. acidophilus ATCC 43121 and Calcium in Swine with
Hypercholesterolemia Induced by Diet. J. Dairy Sci 79:2121-2128.

Roos, N. M. de, and Katan, M. B. 2000. Effect of Probiotic Bacteria on Diarrhea,

Lipid Metabolism, and Carcinogenesis: A Review of Papers Published
between 1988 and 1998. Am J Clin Nutr. 71:405-411.

Rolfe, R.D. (2000). The Role Of Probiotic Culture In The Control Of Gastrointestinal
Health. In Symposium: Probiotic Bacteria: Implication for Human Health.
American Society for Nutritional Science. Journal of Nutrition Vol. 13

Salminen, S., Wright, AV., Ouwehand A. 2004. Lactic Acid Bacteria. New York :
Marckel Dekker.

Sapari, A. 1994. Teknik Pembuatan Gula Aren. Karya Anda. Surabaya.

Saunders D.R., C.E. Rubin, dan J.D. Ostrow, 2005. Small Bowel; The Gut Course
(HUBIO551) On Line Syllabus

Shah, N.P. 2000. Symposium: probiotic Bacteria. Selective Enumeration and

Survival in Dairy Foods. Journal of Daily Science.

Shortt C. 1999. The probiotic century: historical and current perspectives. Review on
Trend Food Science and Technology 10

Sumanti D, Tjahjadi C, Betty DS, Cucu SA, Abdul R. 1994. Efek bahan pengawet
alami terhadap pertumbuhan mikroorganisme kontaminan nira aren. Laporan
penelitian Fakultas Pertanian Universitas Padjajaran, Jatinangor.

Suwandi, U. Resistensi mikroba terhadap antibiotik. Cermin Dunia Kedokteran.

Jakarta, 1991; Vol.70

Triyanto I, 2007. Kembali Tentang Probiotik.

Usman dan Hasono, A. 1999. Bile Tolerance, Taurocholate Deconjugation and

Binding of Cholesterol by Lactobacillus gasseri Strains. J. Dairy Sci. 82:243-
248.

Waspodo. 1997. Probiotik Bakteri Pencegah Kanker. Intisar Pres : Yogyakarta.

 23

Yamamoto, N., Maino, M. and Takano, T. 1999. Purification and Characterization

of Antihypertensive Peptide from a Yoghurt-like Product Fermented by L.
helveticus CPN4. J. Dairy Sci. 77:917-92
LAMPIRAN

24
 25

Lampiran 1. Bagan Alur Penelitian

Peremajaan 52 Isolat
Nira Papua

Ditumbuhkan dalam media

MRSB sebanyak 1 mL

Diuji antimikroba dan ketahan

terhadap garam empedu

Isolat tidak lolos uji Isolat lolos uji garam

garam empedu empedu

Duji ketahanan terhadap pH

Diuji terhadap rendah dan Simulated Gastric
mikroba patogen lain Juice (SGJ) dan Simulated
Intestinal Juice (SIJ)

Dua isolat unggul

dipebanyak dalam media
semi padat yaitu beras,
terigu, tapioka, dan
dedak.
 26

Lampiran 2. Uji Antimikroba

Penyiapan bakteri uji (Escherichia coli dan

Bacillus cereus)

Bakteri uji yang sudah di inkubasi 7µL di

masukan kedalam 100 mL media MHB 0,8%
agar. Kemudian diambil 5mL bakteri tersebut
dituang kedalam cawan petri yang telah berisi
20ml MHB 1,8%

Setelah beku, petri di beri nomer sesuai dengan

nomer isolat. Kemudian Dilubangi media
menggunakan sedotan dengan diameter 5 mm

Sebanyak 50 µL BAL dalam media MRS broth

dipipet ke dalam lubang pada media. Dan
diinkubasi selama 37ºC selama 48 jam.

Diukur zona hambatnya.

Lampiran 3. Uji Ketahanan garam empedu

 27

Dibuat media MRS broth dengan konsetrasi

garam empedu 1000,2000, 3000, dan 4000 ppm

Media yang sudah steril dituang ke dalam petri

dan diberi nomer sesuai dengan isolat

Diinokulasikan isolat BAL ke dalam petri yang

berisi media MRS yang mengandung oxgal.
Uji dilakukan secara duplo.

Diinkubasi secara anaerobic selama 37ºC

selama 48 jam. Dan diamati pertumbuhannya.

Lampiran 4. Uji ketahanan terhadap pH rendah

 28

Penyiapan media GYPA

Penyiapan larutan NaCl

Penyiapan PBS

Penanaman isolat BAL pada media

MRS broth yang tahan pada garam
empedu diinkubasi pada suhu 37º
selama 24 jam.

Disentrifugasi 5400 rpm selama 15

Ditambahkan pH 2 menit. Dicuci selnya dengan PBS
dan 2,5 pada disentrifugasi kembali 5 menit 5400
masing masing rpm.

Masing – masing
pH diambil 100µL Dilakukan pengenceran sampai 105
ditambahkan dalam
Lampiran 5. Bagan Alur Penelitian pada jam ke-0 dan ke-4
900µL 0,85%.

Dari 5 pengenceran (pH 2 dan 2,5)

ditumbuhkan dalam media GYPA
sebanyak 100µL, dan disebar
menggunakan spreader.

Diinkubasi pada suhu 37ºC selama

Lampiran 6. Uji ketahana terhadap Simulated Gastric Juice dan
48 jam. Dan dihitung koloni yang
Simulated Intestinal Juice
tumbuh.
 29

Larutan saline 5% (+) Pepsin, KCl, NaHCO3

(+) HCl sampai pH 2.

Isolat diinokulasikan ke dalam 10 mL SGC

steril

Diinkubasi pada suhu 37ºC selama 90menit.

Larutan SIJ:Larutan
KH2PO4 0,05 dengan pH Isolat yang
8,2 (+) Garam empedu diinokulasi dalam
0,05% dan pancreatin SGJ diambil 1 mL
(1mg/mL)

Diinokuasikan kedalam SIJ steril

Diinkubasi pada suhu 37°C selama

60 menit. Dihitung jumlah koloni.