Pemeriksaan Dengue IgM

Hari/Tanggal :Selasa,8 Oktober 2016

Tujuan :Untuk mendeteksi adanya antibodi dengue IgM pada serum seseorang

Metode : ELISA

Prinsip :Dengue IgM ELISA didasarkan pada teknik sandwich ELISA, strip
mikrotiter sebagai fase padat dilapisi dengan Dengue-antigen (DEN-
Ag), antibodi spesifik yang sesuai (DEN-IgM-Ab) dalam spesimen
pasien atau kontrol mengikat antigen pada fase padat. , komponen
yang tidak terikat dicuci, anti-IgM konjugat (antibodi anti-IgM manusia,
peroksidase terkonjugasi ) ditambahkan, yang mengikat secara
khusus antibodi kelas IgM mengakibatkan pembentukan imun
komplek yang khas. pencucian dilakukan untuk membuang kelebihan
konjugat,TMB/substrat ditambahkan Warna biru yang terbentuk akan
berubah menjadi kuning setelah reaksi berhenti. Intensitas warna
berbanding lurus dengan konsentrasi DEN-IgM-Ab dalam spesimen

Alat :
 Strip Mikrotiter
 Mikropipet & Tip
 Multichanel pipet
 Rak tabung
 Tisu
 Wadah Limbah
 Strip perekat
 Alumunum foil

Bahan :
 Kontrol positif
 Kontrol Negatif
 Buffer Pengencer
 Anti-IgM conjugate
 Larutan Pencuci
 Reagen Substrat
 Stopping solution

Sampel : Serum

Cara Kerja :
1. Reagen dan spesimen disiapkan dan harus pada suhu ruang sebelum
digunakan
2. Lakukan Persiapan Sampel : Larutkan serum pasien 1 + 100 dengan DIL
misalnya 10 µl serum + 1 ml DIL , campurkan semua. Untuk kontrol reagen
sudah siap digunakan
 3. Dimasukkan masung-masing 100 µl NC ke dalam well B1 dan C1 untuk duplo
4. Dimasukkan masing-masing 100 µl PC ke dalam well D1 dan E1 untuk duplo
5. Sampel yang sudah diencerkan dimasukan kedalam well F1 sebanyak 100
µl,jika ada lebih dari satu sampel masukan ke well selanjutnya setelah F1
(missal : G1,H1)
6. Strip mikrotiter ditutup dengan strip perekat
7. Kemudian di inkubasi selama 60 menit pada suhu 37⁰C
8. Setelah di inkubasi cuci 3 kali dengan cara sebagai berikut :
 Lepaskan strip perekat.Hisap keluar semua isi ke dalam 5% larutan
sodium hipoklorit dan tambahkan WASH pada masing-masing
sumur,hisap semua setelah 30 detik.waktu merendam dan ulangi
mencuci dua kali.
 Dalam hal ini, pencuci otomatis diisi dan diutamakan dengan WASH
kemudian cuci strip sebanyak 3 kali. pastikan pencuci mengisi semua
sumur sepenuhnya dan hisap semua dengan efisien setelah 30 detik
(tersisa cairan : <15 µl)
 setelah pencucian, keluarkan cairan yang tersisa dengan menekan
lempeng secara terbalik di atas kertas tisu.
9. Setelah pencucian,konjugat ditambahkan pada tiap well kecuali pada well A1
(Blank).
10. Strip mikrotiter ditutup dengan strip perekat
11. Kemudian di inkubasi selama 30 menit pada suhu 30⁰C
12. Cuci kembali dengan cara yang sudah dijelaskan
13. Setelah pencucian selesai,tambahkan substrat ke semua well masing masing
sebanyak 100 µl
14. Kemudian tutup dengan alumunium foil dan inkubasi selama 15 menit pada
suhu 17-25⁰C
15. Setelah itu tambahkan Stopping solution sebanyak 100 µl
16. Baca absorban pada panajng gelombang 405 nm sesegera mungkin atau
dalam waktu 30 menit setelah berakhirnya reaksi ,gunakan panjang
gelombang referensi dari 630-690 nm jika tersedia.

Uji coba dianggap sah apabila memenuhi kriteria sebagai berikut:

1. Substrat blank di dalam well A1 < 0.100
2. MNC  0.300
3. PC: nilai absorbans sama atau lebih besar dari nilai cutt off

Cut-off value (COV) = MNC + 0.35

Interpretasi Hasil :
Sampel dianggap POSITIF jika nilai absorbans lebih tinggi dari 10% di atas nilai cut-
off.
Sampel dengan nilai absorbansi 10% di atas atau di bawah cut-off tidak dapat
dianggap sebagai positif atau negatif dengan jelas – ZONA ABU-ABU.
Sampel dianggap NEGATIF jika nilai absorbansi lebih rendah dari 10% di bawah
nilai cut-off.
A450 (pasien) ≥COV + 10% : anti-DEN-IgM-Ab-positif
A450 (pasien) ≤ COV – 10% : anti-DEN-IgM-Ab-negatif

Hasil Pemeriksaan :

Perhitungan :
-0.101 < 0.100  valid
0.257+0.929
MNC =
2
= 0.196
= 0.196 ≤ 0.300  Valid

COV = 0.196 + 0.35

= 0.546

PC1 = 0.929 ≥ 0.546  Valid

PC2 = 0.947 ≥ 0.546  Valid

Hasil :

10 % COV : 0.0546

+ 10% COV : 0.546 + 0.0546 = 0.6006  ≥ 0.6006 (Positif)

− 10% COV : 0.546 – 0.0546 = 0.4914  ≤ 0.4914 (Negatif)

Absorbans sampel 1 : 0.421 ≤ 0.4914  Negatif

Absorbans sampel 2 : 0.096 ≤ 0.4914  Negatif

Absorbans sampel 3 : 0.092 ≤ 0.0914  Negatif

Kesimpulan : Berdasarkan hasil pemeriksaan antibody dengue IgM pasien pada

sampel 1,2, dan 3 menunjukan hasil negatif dan hasil yang
didapatkan dinyatakan valid.