Biotinylated Detection Ab Hitung jumlah yang diperlukan sebelum pecobaan

(50L/lubang). Persiapkan 100~200L lebih. Sentrifugasi tube stock sebelum digunakan,

encerkan (dilusi) Biotinylated Detection Ab terkonsentrasi ke dalam working concentration
menggunakan Biotinylated Detection Ab Diluent (1:100).
Concentrated HRP Conjugate Hitung jumlah yang diperlukan sebelum pecobaan
(100L/lubang). Persiapkan 100~200L lebih. Sentrifugasi tube stock sebelum digunakan,
encerkan (dilusi) HRP Conjugate terkonsentrasi ke dalam working concentration
menggunakan HRP Conjugate Diluent (1:100).
Reagen Substrat Sensitif terhadap cahaya dan kontaminan, jangan buka vial hingga ketika
akan digunakan! Pengambilan reagen diaspirasi dengan sterilized tips dan sisa reagen yang
tidak terpakai tidak boleh dibuang kembali ke vial lagi.
Catatan: Jangan mempersiapkan reagen langsung dalam vial Diluent yang disediakan dalam
kit. Kontaminasi dengan air atau container dalam persiapan reagen akan mempengaruhi hasil.

Washing Procedure:
1. Automated Washer: Tambahkan 350L Wash Buffer ke dalam setiap lubang, interval
antara injeksi dan suction paling tidak 60 detik.
2. Manual wash: Tambahkan 350L Wash Buffer ke dalam setiap lubang, rendam selama 12 menit. Setelah pencucian terakhir, tuang Wash Buffer yang tersisa dengan membalik
plate lalu keringkan.
Assay Procedure:
Bawa semua reagen dan sampel sebelum digunakan ke suhu kamar. Sebelum dilakukan
pengujian, sentrifugasi sampel setelah thawing. Semua reagen harus dicampur secara
menyeluruh sebelum pipetting. Hindari berbusa (foaming). Direkomendasikan untuk semua
sampel dan standard dalam pengujian dibuat rangkap dua.
1. Tambahkan sampel dan Biotinylated Detection Ab: Tambahkan 50l dari larutan
Standard, Blank dan Sampel pada setiap lubang. Pada blank ditambahkan dengan
Reference Standard & Sample Diluent. Segera tambahkan 50 l Biotinylated Detection
Ab working solution ke dalam setiap lubang. Tutup dengan Plate sealer yang disediakan.
Tekan plate dengan lembut untuk memastikan pencampuran yang menyeluruh. Inkubasi
selama 45 menit pada suhu 37C. (Larutan ditambahkan ke bagian bawah lubang mikro
ELISA plate, hindari menyentuh permukaan dinding dan berbusa).
2. Cuci: Aspirasi setiap lubang dan cuci, ulangi proses pencucian tersebut tiga kali dengan
mengisi setiap lubang dengan Wash Buffer (sekitar 350l) menggunakan botol semprot,
multi-channel pipet, manifold dispenser atau automated washer. Penghilangan cairan
pada setiap langkah penting untuk memberikan hasil yang baik. Setelah pencucian
terakhir, hilangkan Wash Buffer dengan cara aspirasi. Balik plate dan keringkan
menggunakan absorbent paper bersih dengan cara menepuk-nepuk.
3. HRP Conjugate: Tambahkan 100l HRP Conjugate working solution ke dalam setiap
lubang. Tutup dengan Plate sealer baru. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37C.
4. Cuci: Ulangi aspirasi/ proses pencucian pada step 2 sebanyak lima kali.
5. Substrat: Tambahkan 90l larutan Substrat ke dalam setiap lubang. Tutup dengan Plate
sealer baru. Inkubasi selama 15 menit pada suhu 37C. Lindungi dari cahaya. Waktu
reaksi dapat dipersingkat atau diperpanjang sesuai dengan perubahan warna, tetapi tidak
lebih dari 30 menit. Kerika muncul gradient yang jelas pada lubang Standard, reaksi dapat
diakhiri/diterminasi.

6. Stop: Tambahkan 50l of Larutan Stop ke dalam setiap lubang. Warna akan segera
berubah menjadi kuning. Urutan penambahan larutan stop sama dengan larutan substrat.
7. Penghitungan OD: Tentukan optical density (nilai OD) pada setiap lubang sekaligus,
menggunakan microplate reader 450 nm. Anda harus membuka microplate reader,
panaskan instrumen dan mengatur parameter pengujian.
8. Setelah percobaan, taruh semua reagen yang tidak terpakai ke dalam kulkas sesuai dengan
suhu penyimpanan yang ditentukan hingga masa expired.
Catatan penting:
1. ELISA Plate: ELISA Plate yang baru dibuka dapat terlihat seperti air (water-like
substance), hal tersebut normal dan tidak akan memiliki dampak pada hasil eksperimen.
2. Penambahan sampel: Interval penambahan sampel antara lubang pertama hingga
terakhir tidak boleh terlalu lama, jika tidak akan menyebabkan perbedaan waktu pre
inkubasi, yang secara signifikan akan mempengaruhi akurasi percobaan dan pengulangan.
3. Inkubasi: Untuk mencegah penguapan dan memastikan hasil yang akurat, diperlukan
adhesi yang tepat pada plate sealer selama langkah inkubasi. Jangan biarkan lubang tidak
tertutuo dalam waktu yang lama diantara langkah inkubasi. Patuhi ketentuan waktu
inkubasi yang diberikan dan suhu.
4. Pencucian: Prosedur pencucian sangat penting. Pencucian yang tidak baik akan
menyebabkan presisi buruk dan pembacaan absorbsi meningkat palsu. Sisa cairan dalam
lubang reaksi harus dikeringkan menggunakan kertas penyerap (absorbent paper) dalam
proses pencucian. Tapi jangan meletakkan kertas penyerap dalam lubang reaksi langsung.
Penting utnuk membersihkan cairan sisa dan sidik jari di bagian bawah sebelum
pengukuran, sehingga tidak mempengaruhi micro-titer plate reader.
5. Preparasi Reagen: Karena volume dari Biotinylated Detection Ab terkonsentrasi dan
HRP Conjugate terkonsentrasi sangat kecil, cairan mungkin menempel pada dinding tube
atau or tutup tabung saat dipindahkan. Baiknya dilakukan sentrifugasi terlebih dulu
selama 1 menit pada 1000 rpm. Pipet larutan 4-5 kali sebelum pippeting. Hati-hati dalam
membuat Standard, larutan kerja Detection Ab dan HRP Conjugate harus sesuai dengan
instruksi. Untuk meminimalkan impresisi karena pipetting, pastikan bahwa pipet
dikalibrasi. Tidak direkomendasikan untuk menghisap lebih dari 10L pada sekali
pipetting. Jangan menggunakan kembali larutan standard, larutan kerja Detection Ab dan
HRP Conjugate yang telah diencerkan (dilusi). Jika Anda perlu menggunakan standar
berulang kali, Anda dapat membagi standar ke dalam small pack sesuai dengan jumlah

masing-masing uji, jaga pada suhu -20 hingga -80 dan menghindari hindari
pembekuan berulang dan pencairan.
6. Kontrol Waktu Reaksi: Kontrol waktu reaksi dengan ketat sesuai dengan deskripsi
dalam produk ini!
7. Substrat: Larutan Substrat mudah terkontaminasi. Lindungi dari cahaya.
8. Larutan Stop: Karena sifat larutan asam, harap memperhatikan perlindungan mata ,
tangan, wajah dan pakaian saat menggunakan larutan ini.
9. Mixing: Anda sebaiknya menggunakan micro-osilator pada frekuensi terendah,
pencampuran cukup dan gentle sangat penting untuk hasil reaksi. Jika tidak ada mikro osilator, Anda dapat mengetuk frame ELISA plate lembut dengan jari Anda sebelum
reaksi.
10. Keamanan: Gunakan jas lab dan sarung tangan lateks sebagai perlindungan, teutama
dalam mendeteksi sampel darah atau cairan tubuh lainnya. Lakukan sesuai prosedur
keamanan nasional.
11. Jangan menggunakan komponen yang berbeda dari kit (kecuali washing buffer and stop
solution).
12. Untuk menghindari kontaminasi silang, ubah pipet tip ketika menambahkan masingmasing standar, ketika menambahkan sampel dan ketika menambahkan reagen. Gunakan
reservoir terpisah untuk setiap reagen. Jika tidak, hasilnya akan tidak akurat!
Penghitungan Hasil
Buat rata-rata pembacaan duplikasi setiap standard dan sampel. Buat kurva standard dengan
memplot nilai OD untuk masing-masing standard pada sumbu y terhadap konsentrasi pada
sumbu y dan tarik garis melalui titik-titik pada grafik untuk membentuk kurva. Disarankan
untuk menggunakan beberapa software untuk melakukan perhitungan ini, seperti curve expert
1.3. Jika sampel telah diencerkan, konsentrasi yang dihitung dari kurva standar harus
dikalikan dengan faktor pengenceran. Jika OD sampel melampaui batas atas dari kurva
standar, Anda harus menguji kembali setelah pengenceran yang tepat. Konsentrasi yang
sebenarnya adalah konsentrasi terhitung dikalikan faktor pengenceran.
RINGKASAN
1. Tambahkan 50L standard atau sampel ke dalam masing-masing lubang
2. Segera tambahkan 50L Biotinylated Detection Ab pada masing-masing lubang
3. Inkubasi selama 45 menit pada suhu 37

4. Aspirasi dan cuci sebanyak 3 kali

5. Tambahkan 100L HRP Conjugate ke dalam masing-masing lubang. Inkubasi
selama 30 menit pada suhu 37
6. Aspirasi dan cuci sebanyak 5 kali
7. Tambahkan 90L Reagen Substrat. Inkubasi selama 15 menit pada suhu 37
8. Tambahkan 50L Larutan Stop. Segera baca pada 450 nm
9. Hitung hasilnya