BioTrends Vol.6 No.

2 Tahun 2015

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) : PERKEMBANGAN DAN

PERANNYA DALAM DIAGNOSTIK KESEHATAN
Bugi Ratno Budiarto M.Biotech
Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI
Jalan Raya Bogor Km. 46, Cibinong Science Center, Bogor, Jawa Barat

Pendahuluan Bioteknologi modern dan seperti pangan, teknologi ini pun

capaiannya dalam tiga dekade ini telah mampu berkontribusi nyata.
PCR merupakan teknologi yang tidak lepas dari peran vital Perbaikan varietas-varietas padi
mampu melipat gandakan secuplik teknologi PCR. Penemuan protein- melalui teknologi rekayasa
fragmen DNA yang terdapat dalam protein baru yang penting melalui genetikatelah mampu
komplek makromolekul genom teknologi DNA rekombinan seperti menciptakan padi dengan kualitas
dari berbagai sumber (hewan, insulin, hormon faktor perumbuhan unggul baik dari sisi nutrisi yang
tumbuhan, bakteri, dan dan antibodi adalah contoh nyata dikandungnya maupun daya
n
virus)menjadi 2 kali bagaimana teknologi ini sangat adaptasi yang lebih mumpuni
lipatnyasecara enzimatis. signifikan perannya dalam proses dibandingkan padi sejenis hasil
[8-10]
Teknologi ini juga dikenal dengan pencapaian luar biasa umat perkawainan alami . Selain
[3-5]
tingkat sensitifitas yang cukup manusia .Berkat teknologi PCR aplikasi PCR yang semakin
tinggi karena hanya membutuhkan pula pengurutan basa-basa DNA meluas, teknologi PCR pun terus
secuplik sampel DNA saja untuk manusia berhasil dituntaskan menurus mengalami perbaikan
mendapatkan jutaan kopi DNA dalam kurun waktu yang relatif dan modifikasi mengikuti
baru. Sejak pertama kali singkat yang membawa dampak tantangan penelitian yang terus
ditemukan oleh Kary Banks Mullis besar bagi dunia kedokteran yang berkembang dan dinamis dewasa
[11,12]
32 tahun silam, teknologi PCR membawa arah pengobatan ini .
telah merevolusi semua aspek berfokus pada individu pasien atau
biologi molekular di seluruh yang disebut dengan personal Dari sisi ekonomi, penemuan luar
[6,7]
dunia.Para ilmuwan bersepakat medicine . Disisi lain, bidang biasa ini telah menjadi pendorong
bahwa penemuan teknologi PCR pertanian terutama kaitannya bertumbuhnya industri-industri
pantas disejajarkan dengan dengan kebutuhan pokok manusia bioteknologi dunia, seperti(Abbott
penemuan utas
DNA(Deoxyribonucleic acid) oleh
James D. watson and Francis
Crick pada 1953. Teknologi PCR
mampu memberidampak cukup
signifikan diawal dekade
penemuannya terutamapada
teknologi kloning gen yang
semula tidak mungkin dilakukan
menjadi kenyataan yang
membawa era baru bioteknologi
[1]
kearah yang lebih modern .
Signifikansi teknologi ini telah
menyentuh seluruh ranah
penelitian hayati (kesehatan,
lingkungan, dan pertanian) yang
kemudian berkat teknologi ini
pula pengurutan kode genetika
manusia berhasil diselesaikan,
berbagai jenis obat-obatan baru Gambar 1. Kary B. Mullis (kiri) saat menerima Nobel prize bidang kimia
ditemukan, spesies-spesies baru Tahun 1993 (http://www.scienceguardian.com/blog/a-
berhasil diidentifikasi dan reminder-as-to-who-kary-mullis-really-is-thank-god.htm)
penanganan penyakit-penyakit
berbahaya seperti kankerdan
penyakit menular bisa lebih dini
[2]
dideteksi .

29
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
Laboratories (U.S.), Becton,
Dickinson and Co. (U.S.), Bio-Rad
Laboratories (U.S.), Qiagen
(Netherlands), Promega (U.S.),
Sigma-Aldrich (U.S.), Roche
Diagnostics (Switzerland),
Siemens Healthcare (Germany),
dan Thermo Fisher Scientific
(U.S.) dengan omset fantastis
dimana keuntungan pasar hampir
sebagian besarnya diperoleh dari
penjualan enzim polymerase.
Omset penjualan atas mesin dan
produk-produk PCRdiprediksi
akan mencapai angka yang cukup
spektakular yaitu sebesar 13.4
miliar dolarpada tahun 2020
(http://www.genengnews.com/key
wordsandtools/print/3/36590/).
Atas penemuan yang revolusioner
diabad 21inilah akhirnya Kary B.
Mullis dihadiahi nobel kimia pada
tahun 1993 (Gambar 1).
Prinsip-prinsip Dasar PCR
Ide cemerlang itu muncul secara
spontan di dalam kepala Kary B.
Mullis ketika berkendara dari San
Francisco menuju Mendocin. Dua
pasang fragmen oligonukleotida
(primer) yang saling berlawanan
dan berkomplemen terhadap
masing-masing utas DNAnya
dengan mengulang siklus (1)
denaturasi dimana dua untas DNA
dipisahkan secara fisik
menggunakan suhu tinggi, (2)
annealingdimana suhu diturunkan
untuk memfasilitasi penempelan
DNA polymerase secara spesifik
pada untas tunggal DNA yang
sudah berkomplementasi dengan
primer spesifiknya, dan (3)
polimerasidimana utas tunggal
DNA dibaca oleh DNA
polymerase dengan
menambahkan basa-basa DNA
komplemennya (Gambar 3) maka
fragmen DNA dapat diperbanyak
[13]
secara eksponensial .Aplikasi
dariprinsip dasar PCR ini
terkendala ketika dicobakan
diloratorium dikarenakan beberapa
hal berikut: (1) belum
ditemukannya enzim DNA
polimerase yang tahan panas
menyebabkan harus dilakukan
penambahan enzim baru setiap
siklus polimerasi bertambah yang
menyebabkan tidak efisiennya
proses pengerjaan untuk
mendapatkan jumlah kopi DNA
yang ideal dan (2)penggunaan tiga
water bath terpisah menyebabkan
proses PCR secara teknis cukup
[14]
sulitdilakukan .Untunglah
penemuan enzim DNA polimerase
tahan panas dari mikroba
Thermophilus aquaticusmengatasi
kendalapada pada proses
penambahan enzim sekaligus
menurunkan biaya PCR yang
[15]
sebelumnya cukup besar . Tidak
lama setelah itu, revolusi mesin
PCRdimana suhu tiap-tiap langkah
PCR (denaturasi, annealing, dan
polimerasi) dikendalikan secara
otomatis di dalam satu wadah
reaksitertutup juga berhasil
diciptakan dengan nama “Thermal
[16]
Cycler” . Otomatisasi ini selain
memudahkan proses PCR hal
inijuga berdampak
padapemakaian tempat untuk
mesin PCR menjadi lebih efisien
(Gambar 2).
Secara teknis perbanyakan DNA
dengan PCR memerlukan tujuh
komponen yaitu (1)
template/cetakan DNA yang akan
diperbanyak, (2) enzim DNA
polimerase tahan panas, (3) satu
pasang primer, (4) dNTP,
(5)kofaktor MgCl2, (6) larutan
penyangga dan (7) air. Ke-tujuh
komponen tadi dicampurkan di
dalam tubung ukuran 200 µL
dalam kondisi dingin sebelum
dilakukan PCR di dalam mesin
thermal cycler. Metode
konvensional perbanyakan DNA
dengan PCR terdiri dari tiga
langkah/stepyang diulang untuk
suatu siklus tertentuyaitu (1)
denaturasi cetakan/template DNA
30
o
pada suhu 94-95 C, (2)
annealing/penempelan primer-
primer pada segmen tertentu DNA
menggunakan suhu spesifik (suhu
spesifik ini didapatkan dari nilai -
o
Tm primer dikurangi 5 C) dimana
fragmen DNA akan diperbanyak,
o
dan (3) polimerasipada suhu 72 C
yaitu suhu optimal enzim untuk
memanjangkan primer-primer
yang sudah menempel
tadi.Adapun waktu yang
dibutuhkan untuk berpindah dari
satu langkah ke langkah
selanjutnya dalam satu kali siklus
PCR adalah bergantung pada
mesin PCRtetapi secara umum
durasi denaturasi biasanya paling
lama 30 detik, durasi annealing
sangat bergantung pada
spesifikasi dan panjang primer
yang dibuat tetapi untuk
mudahnya durasi tidak kurang dari
15 detik dan tidak lebih lama dari 1
menit, sedangkan durasi
polimerasi sangat ditentukan oleh
panjang fragmen DNA yang
dihasilkan dan secara kasar
ditetapkan untuk memperbanyak
fragmen DNA dengan ukuran 1 kb
dibutuhkan durasi 1 menit
tergantung pada jenis enzim
[17]
polimerase yang digunakan .
Dari tujuh komponen PCR,
perancangan primer yang baik
adalah kunci keberhasilan dalam
proses amplifikasi DNA dengan
metode ini. Adapun pasangan
primer yang optimal yaitu bila
primer tersebut hanya menempel
spesifik pada gen targetnya dan
bila proses amplifikasi DNA
selesai tidak terbentuk dimer
[18]
primer . Perancangan primer
biasanya menggunakan software
bioinformatika dan untungnya saat
ini sudah banyak software gratis
yang bisa diakses secara online
seperti primer3plus
(http://www.bioinformatics.nl/cgi-
bin/primer3plus/primer3plus.cgi/).
 BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

Gambar 2. Prinsip dasar perbanyakan fragmen DNA dengan teknologi PCR

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/)

31
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

Gambar 3. Alat PCR (kiri) yang digunakan untuk Perbanyakan kopi DNA pada awal sebelum ditemukan
mesin Thermal-Cycler PCR (kanan) (http://galleryhip.com/thermal-cycler-pcr.html)

Perkembangan Teknologi PCR polimerase. Sampai tahun 2013 mikroorganisme-miroorganisme

Teknologi PCR selalu mengalami
inovasi mengikuti dan menjawab
kebutuhan-kebutuhan di bidang
riset maupun diagnostik dan
inovasi tersebut terjadi pada
komponen “software” yaitu enzim
dan komponen kimia
pendukungnya, komponen
“technique” yaitu metodologi PCR
dan komponen “hardware” yaitu
mesin PCR.isolasi, kloning gen
dan modifikasi dari enzim DNA
saja sudah diketahui ada 19 jenis
DNA polimerase baik type A
maupun B dengan karakteristik
unik hasil pengisolasiandari
berbagai jenis thermotolerant
bakteri (genus Themus,
Thermoccocus, dan
Pyrococcus)sehingga tidak heran
dewasa ini persaingan untuk
memunculkan DNA polimerase
dengan fungsi unggul sangat
digencar dilakukan oleh berbagai
peneliti di dunia.Pencarian
baru di ekosistem yang ekstrim
serta modifikasi DNA
polimeraseyang sudah ada
dengan teknik mutagenesis dan
rekayasa genetika merupakan
bagian dari upaya untuk
mendapatkan DNA polimerase
terbarukan yang diharapkan
memiliki aktivitas, spesifitas dan
stabilitas tinggi sehingga bisa
[19-21]
meningkatkan efisiensi PCR .

Tabel 1. Jenis-jenisDNA polimerase yang sudah ada di pasar dan digunakan sebagai tools dalam biologi
molekular berserta karakteristiknya
Karakteristik
Jenis Enzim Type DNA Aktivitas Aktivitas Panambahan Referens
polimerase eksonukleas eksonukleas Fidelity adenin pada i
e 5→3 e 3→5 ujung 3 DNA
Taq:
[22]
Thermus √ - Rendah √
aquaticus
Tfl:
Tidak
Thermus Tipe A √ - √ [23]
diketahui
flavus
Tma:
Thermotoga - √ Sedang - [24]
maritima
KOD:
Thermococcu
- √ Tinggi - [25]
s
Tipe B
kodacaraensis
Pfu:
- √ Tinggi - [22]
Pyrococcus

32
 BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

furiosus
Pwo:
Tidak
Pyrococcus - √ - [26]
diketahui
woesei

Metodologi PCR yang semula
digunakan hanya untuk
perbanyakaan DNA saja sekarang
sudah jauh mengalami
perkembangan yang cukup
memukau mengikuti kebutuhan
akan analisa berdasarkan kasus
yang sedang terjadi. Inovasi terkait
technique” PCR yang kini
berkembang memiliki peranan
cukup signifikan pada hasil-hasil
penelitian dewasa ini terutama
pada bidang kedokteran seperti
prediksi suatu penyakti atau
mengukur efektivitas suatu obat
melalui perhitungan jumlah kopi
gen, analisa keragaman gen
pembawa penyakit atau analisa
mutasi gen. Metode-metode itu
antara lain COLD (Coamplification
at Low Denaturation
[27]
Temperature)-PCR , PNAC
(Peptide Nucleic Acid
[28]
clamp)PCR ,Supression
[29]
PCR dan TETRA ARMS
(AmplificationRefractory
[30]
MutationSystem)-PCR . Adapun
prinsip dan aplikasi dari masing-
masing metode tersebut dapat
dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Metode-metode PCR terkini

Metode
Prinsip Fungsi Aplikasi Ref.
PCR
COLD Denaturasi selektif Pengayaan 1. Pengayaan gen KRAS [31][32]
PCR missmatch/heterodu fragmen DNA yang dan gen P53 yang
pleks DNA mengandung membawa mutasi yang
(campuran DNA tipe mutasi pada jumlahnya sedikit pada
mutan dengan tipe populasi suatu sel kanker paru
wildnya) pada Tc sel dan deteksi 2. Deteksi mutasi DNA
(suhu critikal) mutasi gen BRAF dan K-ras pada
kolon kanker
3. meningkatkan akurasi
deteksi mutasi K-ras
dengan metode analisa
kurva leleh (melting curve)
PNAC Penghambatan Deteksi mutasi gen Deteksi mutasi KRAS [33]
PCR secara selektif pada kanker kolon dengan
perbanyakan tingkat sensitivtas dan
fragmen DNA tipe spesifitas yang cukup
wild menggunakan tinggi
oligo peptida
Supressio Ampflifikasi spesifik Deteksi keragaman Deteksi type alele gen [34]
n PCR pada daerah SS loop gen thrombin III, interleukin 1α,
dari hairpin DNA insulin like growth factor II,
yang terbentuk dari aldolase B, alfa
ikatan komplemetari microglobulin, Low Density
yang kuat pada Lipoprotein
ujung-ujung linker
menggunakan primer
spesifik gen
TETRA Amplifikasi fragmen Deteksi keragaman Deteksi mutasi gen [35]
ARMS gen spesifik gen dan mutasi PI3KCA exon 9 dan 20
PCR menggunakan pada kanker payudara
sepasang primer
pengamit (flanking
primer) dan
sepasang primer
internal yang
berposisi saling
berlawanan arah

33
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
Berkat teknologi PCR pula
pengurutan basa-basa DNA
manusia berhasil dituntaskan
dalam kurun waktu yang relatif
singkat yang membawa
dampak besar bagi dunia
kedokteran yang membawa
arah pengobatan berfokus
pada individu pasien atau
yang disebut dengan personal
medicine
Inovasi “hardware” PCR
setidaknya pada saat ini terdapat
empat jenis mesin PCR yang
sudah dikembangkandan
digunakan pada penelitian dan
diagnostik yaitu (1) mesin PCR
konvensional biasa (2) mesin PCR
konvensional dengan
programgradient temperature, (3)
Real-Time PCR,dan (4) droplet
digital PCR. Mesin PCR yang
dilengkapi dengan gradient
temperaturememiliki fungsi utama
yaitu optimasi suhu annealing
primer secara paralel pada
pemakainya untuk mendapatkan
suhu annealing terbaik yang akan
diterapkan pada perbanyakan
DNA selanjutnya. Pengguna
tinggal memilih suhu annealing
yang diingikan yang mengacu
pada nilai Tm (Melting
Temperature) primer
o [36]
dikurangi5 C . Real-Time PCR
dengan teknologi komputerisasi
yang handal dimana feature yang
[37]
tawarkan sudah sangat lengkap
termasuk program gradient
temperature. Real Time PCR
memiliki keunggulan dalam hal (1)
kemampuan dalam menghitung
secara tepat jumlah DNA yang
diperbanyak tiap siklusnya yang
memungkinkan material genetika
yang terdapat pada sampel dapat
dihitung secara tepat pula, (2),
perbanyakan DNA selama proses
PCR berlangsung bisa diamati
secara langsung (Real-Time), (3)
menawakan beragam jenis deteksi
seperti mutasi, genotyping,
perhitungan jumlah sel dan
ekspresi gendan (4)
mengeliminasi keharusan analisa
[38]
lebih lanjut seperti elektroforesis
yang merupakan keterbatasan dari
PCR konvesional. Teknologi
terkini dari mesin PCR yaitu
droplet digital PCR yang
dikembangkan oleh perusahaan
ternama Bio-Rad-Ltd. Alih-alih
proses amplifikasi DNA dilakukan
dalam sistem aquoes, dalam
droplet digital PCR sintesis DNA
dilakukan secara enkapsulasi air
yang teremulsi dalam minyak.
Metode partisi ini menyebabkan
perhitungan atau analisa DNA
dengan droplet digital PCR begitu
tinggi ketepatannya. PCR jenis ini
memberikan keunggulan-
keunggulan luar biasa untuk
berbagai tujuan penelitian maupun
diagnostik seperti (1) analisa
[39]
keragaman jumlah kopi DNA ,
(2) deteksi mutasi DNA yang
[40]
langka , (3) ekspresi gen dan
[41]
analisa microRNA , (4)
aplikasinya dalam Next
[42]
Generation Sequencing (NGS)
dan (5) analisa aktivitas enzim
dengan resolusi skala sel tunggal
34
[43]
(single cell) . Tidak tertutup
kemungkinan beberapa tahun lagi
dari sekarang dengan semakin
canggihnya teknologi komputer
dan berkembangannya ilmu
material dan bioteknologi bisa
terwujudnya mesin portable PCR
dengan dimensi fisik yang cukup
kecil tetapi tetap memilikifeature-
featuretercanggih didalamnya
sehingga dengan mesin PCR
seperti ini akan sangat membantu
bagi para penggunayang dinamis
(peneliti kepurbakalaan, petugas
kesehatan dan petugas
konservasi)yang
mengharuskanproses PCR dan
olah data di lapangan sehingga
data yang didapatkan akan lebih
cepat dan akurat.
Peranan PCR dalam Diagnostik
Kesehatan
Diagnostik klasik,sebelum PCR
dipopulerkan sebagai metode
deteksi dalam klinis,
menggunakan metode analisa
protein sebagai sarana dalam
melakukan deteksi suatu penyakit.
Tidak mengejutkan bahwa sistem
deteksi yang banyak dipakai atau
ditawarkan pada suatu institusi
kesehatan seperti rumah sakit
pada umumnya menggunakan
metode yang mengacu pada
prinsip-prinsipimunokimia, sebagai
contoh yang terkenal yaitu deteksi
human papiloma virus
mengunakan tes Pap Smear atau
deteksi kelainan sel menggunakan
metode imunohistokimia.Namun
terkadang, deteksi semacam itu
riskan akan terjadinya kesalahan
dalam penafsiran hasil
dikarenakan rendahnya sensitifitas
metode yang mungkin terjadi
karenarusaknya antibodi yang
digunakan (misalkan salah proses
penyimpanan atau kadaluarsa)
atau rendahnya kualitas sampel
jaringan akibat proses
[44]
penyimpanan yang terlalu lama .
Untuk mengkonfirmasi salah
penafsiran data maka diperlukan
suatu metode mumpuni baik
sifatnya sebagai metode tunggal
deteksi atau komplemen untuk
mengatasi batasan tadi. Aplikasi
PCR dalam diagnostik kesehatan
telah banyak dilakukan dewasa ini
 BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

dengan tingkat sensitifitas dan yang sudah diakui sebagai gold prinsip kerja yaitu pengurutan
[45]
spesifitas yang cukup tinggi . standard dalam diagnostik klinis basa-basa DNA oleh DNA
seperti FISH (Flouresence In Situ
Oleh sebab ituwajar jika teknologi polymerase dengan
[46]
ini cukup mumpuni dalam Hybdridization) yang memasangkan basa-basa DNA
mendeteksi mikroorganism menggunakan prinsip kerja yaitu yang sudah dimodifikasi secara
berbahaya yang titernya cukup pelabelan DNA target pada kimia hanya dengan melibatkan
kecil sekalipun dalam beragam jaringan secara in situ penggunaan satu primer.Dibawah
sampel, mendeteksi suatu mutasi menggunakan probe ini adalah tabel 3 kompilasi dari
gen tertentu pada pasien berflourensensi, IHC beberapa hasil penelitian beserta
[47]
penderita kanker, dan mendeteksi(ImmunoHistoChemistry) yang aplikasi klinis PCR dalam
kelainan gen-gen bawaan. menggunakan prinsip yaitu deteksi diagnostik kesehatan terkait
protein menggunakan antibodi deteksi penyakit berbahaya,
Secara teknis, metode PCR dapat spesifik yang sudah ditempelkan penyakait turunan dan penyakit
dipakai sebagai metode probe khusus, maupun sanger kanker.
[48]
komplemen terhadap metode baku sequensing yang menggunakan

Tabel 3. Aplikasi metode PCR dalam deteksi berbagai macam penyebab penyakit
Metode Keampuhan metode PCR Referensi
Aplikasi Gen/krom
Deteksi Metode pembandin Sensitifita Spesifisitas
PCR osom
g s
Diagnost Salmonella Lokus Real- Metode *** *** [49]
ik sp. pada ttrRSBCA Time kultur bakteri
penyeba pangan PCR
b Mycobacteri IS6110 Nested- - ** ** [50]
Penyakit um PCR
berbaha tuberculosis
ya pada darah
dan urin
Plasmodium 18s RNA Multiplex Blood smear *** *** [51]
sp. pada Real- menggunaka
darah Time n Microskopi
PCR
Diagnost Down’s Duplikasi Quantitai Analisa *** *** [52]
ik syndrome gen TTC3 ve Real- karyotipe
penyakit pada Time kromosom
turunan kromosom PCR
21 dan
KDM2A
pada
kromosom
11
48,XXYY kromosom Quantitati Anilsa *** *** [53]
syndrome sex ve karyotipe
flouresce kromosom
nce PCR
Ret MEPC2 Quantitati DHPLC, *** *** [54]
syndrome ve real DGGE, dan
time PCR SSCP
Diagnost Otak EGFR, Droplet Sequencing *** *** [55]
ik TP53, Digital
kanker KRAS, dan PCR
Neurofibro
min 2 dan
NF2p.R57
Hati P16 Metilasi- Deteksi ** ** [56]
PCR stabilitas
mikrosatelite
DNA atau
deteksi
mutasi P53
Payudara Her-2 Real- IHC *** *** [57]
Time (ImmunoHys
PCR toChemistry)
*** sangat tinggi** tinggi* sedang

35
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
Kebutuhan diagnostik
kesehatansaat inikaitannya
dengan metode molekular yaitu
tersedianya metode molekular
yang memenuhi kriteria (1)
akurat, (2) cepat, dan (3) murah.
Akurasi metode PCR sangat
ditentukan oleh kemampuan kita
dalam hal (1) merancang
pasangan primer spesifik dari gen
yang akan diperbanyak, (2)
pemilihan gennya, (3) beserta
pemilihan metode PCR yang akan
dipakai. Pemilihan gen untuk
diagnostik menggunakan PCR
akan ditentukan oleh kebutuhan
dari jenis deteksi. Untuk deteksi
bakteri biasanya menggunakan
16sRNA, deteksi jamur
menggunakan 18sRNA atau ITS,
deteksi kanker menggunakan
onkogen spesifik kanker.
Pemilihan metode PCR mana
yang dipakai tergantung seberapa
besar tingkat deteksi yang
diinginkan. Deteksi jenis mikroba
pada suatu jaringan misalkan,
cukup digunakan metode PCR
biasa yang digabungkan analisa
post-PCR dengan sanger
[58]
seqeuncing . Sedangkan untuk
deteksi mutasi gen pada jaringan
kanker yang memerlukan tingkat
akurasi tinggi maka biasanya
digunakan metode PCR yang
telah dimodifikasi seperti telah
dipaparkan sebelumnya pada
tabel 2.Beberapa hasil penelitian
membuktikan metode-metode
tersebut memiliki akurasi
bervariasi namun secara umum
tingkat deteksi mutasi meningkat
sebesar 10-100 kalinya jika
dibandikan dengan deteksi mutasi
dengan metode sanger
sequensingdimana produk
PCRnya hasil dari perbanyakan
metode konvensional PCR. Untuk
kecepatan dalam proses
mendapatkan hasil, pengolahan
sampel (ektrasi DNA, proses
pencampuran komponen PCR,
proses PCR dan analisa hasil)
dengan metode PCR jauh lebih
cepat dibandingkan dengan
pengolahan sampel yang sama
dengan metode IHC hal ini
disebabkan karena kompleksitas
prosedur IHC dan sulitnya
penafsiran hasil pewarnaan yang
mengharuskan adanya personel
khusus yang sudah terlatih.Lebih Souriau, Christelle, and Peter J.
lanjut, diagnostik gen
menggunakan metode PCR sudah
banyak dipakai di rumah sakit dan
pusat-pusat diagnostik sehingga
dengan pemeriksaan rutin dan
masif akan berdampak pada
ongkos pemeriksaan yang murah
dan tentu itu akan tergantung
pada teknologi PCR yang
digunakan semakin sensitif
metode yang dipakai maka ongkos
diagnostik yang ditawarkanakan
sedikit lebih mahal.
Kesimpulan
Teknologi PCR akan terus
mengalami inovasi seiring dengan
perkembangan ilmu pengetahuan
hayati yang dewasa ini begitu
dinamis dan kompleks. Inovasi
teknologi PCR mencakup tiga
komponen utama yaitu ‘software”,
“hardware” dan “technique”.
Penemuan-penemuan baru pada
ketiga komponen tersebut telah
memperkuat PCR sebagai salah
satu tools bioteknologi yang
mumpuni dalam menjawab
tantangan penelitian maupun
diagnostik kedepan.
Daftar Pustaka
Bartlett, John MS, and David
Stirling. "A short history of the
polymerase chain reaction."
PCR protocols. Humana
Press, 2003. 3-6.
Gibbs, Richard A. "DNA
amplification by the
polymerase chain reaction."
Analytical Chemistry 62.13
(1990): 1202-1214.
Ladisch, Michael R., and Karen L.
Kohlmann. "Recombinant
human insulin." Biotechnology
progress 8.6 (1992): 469-478.
Robson, Martin C., Thomas A. DeGraves, Fred J., Dongya Gao,
Mustoe, and Thomas K. Hunt.
"The future of recombinant
growth factors in wound
healing." The American
journal of surgery 176.2
(1998): 80S-82S. Shampo, Marc A., and Robert A.
36
Hudson. "Recombinant
antibodies for cancer
diagnosis and therapy."
Expert opinion on biological
therapy 3.2 (2003): 305-318.
Wilson, Brenda J., and Stuart G.
Nicholls. "The Human
Genome Project, and recent
advances in personalized
genomics." Risk management
and healthcare policy 8
(2015): 9.
Lunshof, Jeantine E., et al.
"Personal genomes in
progress: from the human
genome project to the
personal genome project."
Dialogues in clinical
neuroscience 12.1 (2010): 47.
Ma, Xujun, Qian Qian, and Dahai
Zhu. "Expression of a
calcineurin gene improves
salt stress tolerance in
transgenic rice." Plant
molecular biology 58.4
(2005): 483-495.
Singh, Anil K., et al. "Raising
salinity tolerant rice: recent
progress and future
perspectives." Physiology and
Molecular Biology of Plants
14.1-2 (2008): 137-154.
Key, Suzie, Julian KC Ma, and
Pascal MW Drake.
"Genetically modified plants
and human health." Journal of
the Royal Society of Medicine
101.6 (2008): 290-298.
Garibyan, Lilit, and Nidhi Avashia.
"Research Techniques Made
Simple: Polymerase Chain
Reaction (PCR)." The Journal
of investigative dermatology
133.3 (2013): e6.
and Bernhard Kaltenboeck.
"High-sensitivity quantitative
PCR platform." Biotechniques
34.1 (2003): 106-115.
Kyle. "Kary B. Mullis—Nobel
Laureate for procedure to

replicate DNA." Mayo Clinic
Proceedings. Vol. 77. No. 7.
Elsevier, 2002.
Mullis, K. B., et al. "Specific
enzymatic amplification of
DNA in vitro: the polymerase
chain reaction."
Biotechnology Series (1992):
17-17.
Saiki, Randall K., et al. "Primer-
directed enzymatic
amplification of DNA with a
thermostable DNA
polymerase." Science
239.4839 (1988): 487-491.
Weier, Heinz Ulrich, and Joe W.
Gray. "A programmable
system to perform the
polymerase chain reaction."
DNA 7.6 (1988): 441-447.
van Pelt-Verkuil, Elizabeth, Alex
Van Belkum, and John P.
Hays. Principles and technical
aspects of PCR amplification.
Springer Science & Business
Media, 2008.
He, Q., et al. "Primers are decisive Takagi, Masahiro, et al.
for sensitivity of PCR."
Biotechniques 17.1 (1994):
82-84.
Kim, Kee Pum, et al. "Improved
thermostability and PCR
efficiency of Thermococcus
celericrescens DNA
polymerase via site-directed
mutagenesis." Journal of
biotechnology 155.2 (2011):
156-163.
Lee, Jong Il, et al.
"Characterization and PCR
application of a thermostable
DNA polymerase from
Thermococcus pacificus."
Enzyme and Microbial
Technology 47.4 (2010): 147-
152.
Song, Jung Min, et al.
"Characterization and PCR
performance of a family B-
type DNA polymerase from
the hyperthermophilic
crenarchaeon
Staphylothermus marinus."
Enzyme and Microbial
Technology 40.6 (2007):
1475-1483.
Cline, Janice, Jeffery C. Braman,
and Holly H. Hogrefe. "PCR
fidelity of Pfu DNA
polymerase and other
thermostable DNA
polymerases." Nucleic acids
research 24.18 (1996): 3546-
3551.
Kaledin, A. S., A. G. Sliusarenko,
and S. I. Gorodetskiĭ.
"[Isolation and properties of
DNA polymerase from
extreme thermophylic
bacteria Thermus aquaticus
YT-1]." Biokhimiia (Moscow,
Russia) 45.4 (1980): 644-651.
Diaz, R. S., and E. C. Sabino.
"Accuracy of replication in the
polymerase chain reaction.
Comparison between
Thermotoga maritima DNA
polymerase and Thermus
aquaticus DNA polymerase."
Brazilian journal of medical
and biological research 31.10
(1998): 1239-1242.
"Characterization of DNA
polymerase from Pyrococcus
sp. strain KOD1 and its
application to PCR." Applied
and environmental
microbiology 63.11 (1997):
4504-4510.
Dąbrowski, Sławomir, and Józef
Kur. "Cloning and Expression Taback B, Bilchik AJ., et al.
inEscherichia coliof the
Recombinant His-Tagged
DNA Polymerases
fromPyrococcus
furiosusandPyrococcus
woesei." Protein expression
and purification 14.1 (1998):
131-138.
Carotenuto, Pietro, et al.
"Detection of KRAS mutations
in colorectal cancer with Fast
COLD-PCR." International
journal of oncology 40.2
(2012): 378-384.
Taback, Bret, et al. "Peptide
nucleic acid clamp PCR: A
novel K‐ras mutation
37
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
detection assay for colorectal
cancer micrometastases in
lymph nodes." International
journal of cancer 111.3
(2004): 409-414.
Kaur, Manjit, and G. Mike
Makrigiorgos. "Novel
amplification of DNA in a
hairpin structure: towards a
radical elimination of PCR
errors from amplified DNA."
Nucleic acids research 31.6
(2003): e26-e26.
Machnicki, Marcin M., et al.
"ARMS-PCR for detection of
BRAF V600E hotspot
mutation in comparison with
Real-Time PCR-based
techniques." Acta Biochimica
Polonica 60.1 (2013): 57-64.
Mancini, Santucci., et al. “The use
of COLD-PCR and high-
resolution melting analysis
improves the limit of detection
of KRAS and BRAF mutations
in colorectal cancer. Journal
of Molecular Diagnostics.
12.5 (2010): 705- 711.
Castellanos-Rizaldos E, Liu P., et
al. “Temperature-Tolerant
COLD-PCR reduces
temperature stringency and
enables robust mutation
enrichment. Clinical
Chemistry. 58.7 (2012): 1130-
1138.
”Peptide nucleic acid clamp
PCR: A novel K-ras mutation
detection assay for colorectal
cancer micrometastases in
lymph nodes. International
Journal of Cancer. 111
(2004): 409-414.
Broude NE, Zhang L., et al.
“Multiplex allel-specific target
amplification based on PCR
supression. Protocol National
of Academic Science. 98.1
(2001): 206-211.
Harle A, Lion M., et al. “Analysis of
PIK3CA exon 9and 20
mutations in breast cancers
using PCR HRM and PCR-
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
ARMS: correlation with
clinicophatological criteria.
Oncology Reports. 29 (2013):
1043-1052.
Danssaert, J., et al. "RoboCycler
96 cyclers: Higher throughput
with 96-well format."
Strategies 7 (1994): 66-67.
Deepak, S. A., et al. "Real-time
PCR: revolutionizing
detection and expression
analysis of genes." Current
genomics 8.4 (2007): 234.
Valasek, Mark A., and Joyce J.
Repa. "The power of real-time
PCR." Advances in
physiology education 29.3
(2005): 151-159.
Ruelle, Jean, et al. "Validation of
an ultrasensitive digital
droplet PCR assay for HIV-2
plasma RNA quantification."
Journal of the International
AIDS Society 17.4 (2014).
Zhu, Guanshan, et al. "Highly
Sensitive Droplet Digital PCR Wang, Wei, et al. "Molecular
Method for Detection of
EGFR-Activating Mutations in
Plasma Cell–Free DNA from
Patients with Advanced Non–
Small Cell Lung Cancer." The
Journal of Molecular
Diagnostics 17.3 (2015): 265- Malorny, Burkhard, et al.
272.
Heredia, Nicholas J., et al.
"Droplet Digital™ PCR
quantitation of HER2
expression in FFPE breast
cancer samples." Methods
59.1 (2013): S20-S23.
White, Richard A., et al. "Digital
PCR provides sensitive and
absolute calibration for high
throughput sequencing." BMC
genomics 10.1 (2009): 116.
Ludlow, Andrew T., et al.
"Quantitative telomerase
enzyme activity determination
using droplet digital PCR with
single cell resolution." Nucleic
acids research 42.13 (2014):
e104-e104.
Ramos-Vara, J. A. "Technical
aspects of
immunohistochemistry."
Veterinary Pathology Online
42.4 (2005): 405-426.
Reizenstein, E. "Diagnostic
polymerase chain reaction."
Developments in biological
standardization 89 (1996):
247-254.
Poppert, Sven, et al. "Rapid
diagnosis of bacterial
meningitis by real-time PCR
and fluorescence in situ
hybridization." Journal of
clinical microbiology 43.7
(2005): 3390-3397.
Watson, Natasha, et al.
"Heterogeneous staining for
mismatch repair proteins
during population-based
prescreening for hereditary
nonpolyposis colorectal
cancer." The Journal of
Molecular Diagnostics 9.4
(2007): 472-478.
Genotyping of Human
Rhinovirus by Using PCR and
Sanger Sequencing."
Rhinoviruses. Springer New
York, 2015. 39-47.
"Diagnostic real-time PCR for
detection of Salmonella in
food." Applied and
Environmental Microbiology
70.12 (2004): 7046-7052.
Cruz, Heidi Lacerda Alves da, et
al. "Evaluation of a nested-
PCR for Mycobacterium
tuberculosis detection in
blood and urine samples."
Brazilian Journal of
Microbiology 42.1 (2011):
321-329.
Rougemont, Mathieu, et al.
"Detection of four
Plasmodium species in blood
from humans by 18S rRNA
gene subunit-based and
species-specific real-time
PCR assays." Journal of
38
clinical microbiology 42.12
(2004): 5636-5643.
Sun, Lei, et al. "Rapid detection of
Down's syndrome using
quantitative real-time PCR
(qPCR) targeting segmental
duplications on chromosomes
21 and 11." Gene 552.2
(2014): 272-276.
1. Zhang, Qiu-Shi, and Dong-Zhi
Li. "A case of 48, XXYY
syndrome detected prenatally
by QF-PCR." Journal of
Maternal-Fetal and Neonatal
Medicine 22.12 (2009): 1214-
1216.
Ariani, Francesca, et al. "Real‐time
quantitative PCR as a routine
method for screening large
rearrangements in Rett
syndrome: Report of one
case of MECP2 deletion and
one case of MECP2
duplication." Human mutation
24.2 (2004): 172-177.
Pan, Wenying, et al. "Brain Tumor
Mutations Detected in
Cerebral Spinal Fluid."
Clinical chemistry (2015):
clinchem-2014.
Wong, Ivy HN, et al. "Detection of
aberrant p16 methylation in
the plasma and serum of liver
cancer patients." Cancer
research 59.1 (1999): 71-73.
Mendoza, Gretel, Amelia Portillo,
and Jorge Olmos-Soto.
"Accurate breast cancer
diagnosis through real-time
PCR her-2 gene
quantification using
immunohistochemically-
identified biopsies." Oncology
letters 5.1 (2013): 295-298.
Viljoen, Gerrit J., Louis H. Nel, and
John R. Crowther, eds.
Molecular diagnostic PCR
handbook. Springer Science
& Business Media, 2005.