alidation of Analytical Method

Validasi merupakan syarat utama untuk memastikan kualitas dan reliabilitas dari hasil
analisis (ICH, 2005). Metode analisis yang reliabel merupakan persyaratan yang harus
dipenuhi untuk memenuhi standar nasional dan internasional pada semua bidang
pengukuran. Laboratorium pengukuran yang diakui secara internasional, dalam
pengukurannya harus menggunakan metode tervalidasi, memiliki prosedur  kontrol
kualitas internal, mengikuti program proficiency testing, dan  terakreditasi ISO/ IEC
17025 (Thompson, et al. 2002.

Pengertian

Validasi metode adalah suatu proses atau tindakan untuk memastikan apakah

prosedur analisis yang dipakai untuk pengujian sesuai dengan spesifikasinya. Hasil
dari validasi metode dapat digunakan untuk menilai kualitas, reliabilitas dan konsistensi
hasil, dimana ini merupakan bagian integral dari praktek analisis yang baik.

Parameter

Paramete-parameter validasi metode analisis, menurut ICH dan organisasi yang lain
diringkas di Tabel 1.

1. Spesifitas/ selektivitas

Spesifitas adalah kemampuan untuk membedakan dengan tegas antara analit dengan
komponen lain yang tidak diharapkan yang mungkin ada dalam sampel. Komponen
yang tidak diharapkan termasuk didalamnya adalah ketidakmurnian, produk degradasi,
dan matrik sampel (ICH, 2005). FDA, (2001) mendefinisikan untuk parameter ini
dengan selektivitas. Selektivitas merupakan kemampuan metode analisis untuk
membedakan dan mengkuantifikasi analit yang juga terkandung senyawa lain/ pengotor
dalam sampel. Dalam prosedur kromatografi, kromatogram yang mencukupi harus
dipakai untuk menunjukkan spesifitas dan masing-masing komponen harus dapat
terpisah dengan sempurna. Spesifitas dapat ditunjukkan dengan resolusi dari dua analit
yang berdekatan (ICH, 2005).

Tabel 1. Parameter Validasi dengan sesuai dengan tujuan analisis (Ermer and
Miller, 2005)
Ya berarti parameter tersebut ditetapkan dan tidak berarti tidak perlu dilakukan

1. Pengukuran, termasuk tes disolusi/ pelarutan, kadar zat aktif

2. Spesifitas metode yang kurang memenuhi, maka harus diganti oleh prosedur
analisis yang lain
3. Reprodusibilitas tidak diperlukan untuk pendaftaran registrasi obat
4. tidak diberikan jumlah minimal
5. diperlukan pada beberapa kasus
6. 6 kali pengukuran pada konsentrasi 100%, atau 9 kali pengukuran dengan 3 kalli
pengukuran dari 3 level konsentrasi

Presisi

Presisi menggambarkan kedekatan hasil antara beberapa seri pengukuran yang

didapatkan dari beberapa sampel yang homogen didalam kondisi analisis yang tertentu.
Presisi digambarkan dengan 3 level presisi, yaitu keberulangan/ repeatability, presisi
antara, dan reproducibility. Presisi harus diamati dengan menggunakan sampel yang
homogen. Jika sampel homogen sulit untuk didapatkan maka dapat dipakai sampel
tiruan atau larutan sampel yang dibuat. Presisi dari prosedur analisis digambarkan
sebagai variansi, deviasi standar, atau koefisien variasi dari beberapa pengukuran
(FDA, 2001; ICH,2005). Presisi didapatkan dari minimal lima kali pengukuran pada
konsentrasi 100% (FDA, 2001), atau minimal 6 kali pengukuran pada level konsentrasi
100%, atau minimal 9 kali pengukuran yang mengkover jarak spesifik, 3 level
konsentrasi sampel dengan masing-masing replikasi 3 kali (ICH, 2005).

Keberulangan/ repeatabilitas menggambarkan presisi di bawah kondisi operasional

yang sama pada interval pengukuran yang pendek. Keberulangan juga disebut sebagai
presisi dalam hari (intra-assay precision). Level lain dari presisi adalah presisi antara,
yaitu parameter presisi yang menggambarkan adanya variasi dalam kondisi
operasional. Variasi yang bisa dilakukan adalah perbedaan hari, analis, peralatan, daln
lain-lain. Level presisi lainnya menurut ICH, (2005) adalah reproducibility. Parameter ini
untuk beberapa regulator sedikit berbeda. Reproducibility menggambarkan presisi yang
didapatkan dari laboratorium yang berbeda. Reproducibility biasanya dilakukan untuk
membakukan suatu metode (ICH, 2005).

Akurasi

Akurasi dari prosedur analisis menggambarkan kedekatan hasil pengukuran dengan

nilai sebenarnya (True value) atau nilai refensi standar (FDA, 2001; ICH, 2005). Dalam
Thompson, et al. (2002) menamakannya dengan Trueness. Parameter akurasi
memberikan gambaran terjadi bias dalam penelitian. Bias ini dapat terjadi pada
beberapa level, yaitu bias pengukuran, bias laboratorium, dan bias metode (Thompson,
2002).

Thompson, et al. (2002) dan ICH, (2005) memberikan beberapa metode untuk

mendapatkan parameter akurasi, yaitu :

1. Aplikasi prosedur analisis pada CRMs (Certified Reference Materials),

atau reference material.
2. Membandingkan prosedur analisis baku dengan prosedur analisis yang diajukan
3. Metode adisi standar, menambahkan standar yang diketahui kadarnya pada
sampel dengan 3 level konsentrasi penambahan.
4. Metode spiking, menambahkan standar yang diketahui kadarnya pada matrik
tiruan dengan 3 level konsentrasi penambahan.

         Akurasi harus dinilai dengan menggunakan minimal 9 pengukuran dengan

meliputi 3 level konsentrasi berbeda yang diulang masing-masing 3 kali. Akurasi
dilaporkan sebagai perolehan kembali dari standar yang ditambahkan pada sampel,
atau matrik tiruan, atau CRMs. Keberterimaan (tabel 3) dari parameter akurasi adalah
prosentase perolehan kembali dan koefisien variasi.

ICH merekomendasikan penetapan akurasi dengan menggunakan minimal sembilan

titik pengukuran dari minimal tiga tingkat konsentrasi yang meliputi kisaran tertentu
(misalnya, tiga konsentrasi / tiga bereplikasi masing-masing).

Linieritas
              Linieritas dari prosedur analisis adalah kemampuan metode (dalam rentang
yang diberikan) untuk mendapatkan proporsi yang linier antara konsentrasi analit dalam
sampel dengan respon metode. Linieritas juga dapat dilakukan langsung pada senyawa
standar dengan cara membuat seri kadar dari senyawa standar. Data proporsi kadar
analit dengan respon metode diolah secara statistic untuk medapatkan koefisien
korelasi, intersep, dan kemiringan (ICH, 2005).

Beberapa prosedur analisis seperti immunoassays, tidak menunjukkan linieritas setelah

mengalami beberapa transformasi. Dalam kasus tersebut, maka respon metode harus
digambarkan dengan fungsi yang tepat dari konsentrasi dari analit dalam sampel.
Linieritas didapatkan dengan melakukan pengukuran pada 5 level konsentrasi (ICH,
2005). Kriteria keberterimaan dari parameter linieritas adalah koefisien korelasi > 0,98
untuk pengukuran sampel dan > 0,99 untuk pengukuran standar (Ermer and Miller,
2005).
 Preparasi Sampel

Alasan mendasar kenapa melakukan ekstraksi sebelum dilakukan analisis adalah untuk
menghilangkan bahan yang mungkin menganggu analisis. Hal ini sangat penting jika
analisis tidak dilakukan dengan metode kromatografi atau metodenya kurang spesifik.
Bahkan ketika teknik kromatografi dipakai dalam analisis, ekstraksi tetap diperlukan
untuk memisahkan bahan-bahan yang tidak larut dalam pelarut yang dipakai. Pada
media biologis, seperti plasma, darah, urin, dan sel. Preparasi sampel sangat penting
karena beberapa jurnal mengatakan bahwa tahap ini berkontribusi sekitar 75% dari
kesalahan.

Metode-Metode Ekstraksi

Ekstraksi cair-cair.

Prinsip teknik ekstraksi cair-cair adalah adanya perbedaan kelarutan analit dalam dua
pelarut yang tidak saling campur. Ekstaksi cair-cair tidak hanya dipakai untuk ekstraksi
suatu senyawa organic tapi juga untuk senyawa-senyawa logam. Campuran dua
pelarut bisa menghasilkan campuran azeotrop. Dalam ekstraksi cair-cair campuran ini
perlu dihindari karena campuran ini tidak memisah. Teknik ini memiliki beberapa
kelemahan, diantaranya adalah perlu waktu yang lebih lama, sulitnya untuk
diatomatisasi dan memerlukan volume pelarut yang murni dalam jumlah besar.

Faktor yang mempengaruhi ekstraksi:

(a) efek suhu dan solute yang inert,

 (b) efek pH terhadap ekstraksi,

(c) efek dari pembentukan pasangan ion, dan

(d) efek sinergi dari ekstraksi.

Tablet dan Kapsul

Tablet dan kapsul terdiri dari zat aktif dan bahan pengisi. Mayoritas bahan dalam
sediaan ini adalah bahan pengisi, bahan pelican, bahan penghancur dan lain-lain,
terlebih jika dosis zat aktif kecil. Bahan-bahan tersebut ada yang menyerap energi sinar
UV, ada juga juga yang tidak menyerap. Jika zat aktif tidak larut secara sempurna
dalam air, maka alternatif untuk melakukan ekstraksi adalah dengan metanol atau
etanol.

Dalam tablet salut gula, bahan pelapisnya yang berupa gula modifikasi seperti
hidroksipropilmetilselulosa. Kandungan pelapisnya dalam tablet tersebut adalah sekitar
3% dan bahan tersebut tidak mempengaruhi pembacaan pada daerah UV. Pewarna
dalam tablet mempunyai potensi mengganggu analisis, karena warna dapat
mengabsorpsi radiasi UV/visible. Pewarna biasanya merupakan golongan dye
organometilik atau metil oksida yang larut dalam beberapa pelarut tertentu. Oleh karena
itu warna harus bisa dihilangkan sebelum analisis dengan menambahkan clarifying
agent.
Suspensi dan Larutan

Pada suspensi dan larutan, dye (merupakan salah satu golongan pewarna) yang
digunakan adalah yang larut dalam air, seperti klorofil, karotenoid dan antosian. SPE
(Solid Phase Extraction) dengan resin penukar ion merupakan salah satu teknik yang
efektif untuk mengatasi masalah anionik dan kationik dyes. Sediaan itu juga
mengandung pengawet dan antioksidan, seperti senyawa fenol dan benzalkonium
klorida. Bahan tersebut sangat kuat mengabsropsi sinar UV. Suspensi mengandung
surfaktan seperti PEG, CMC Na, tidak terlalu mengganggu absorpsi sinar UV, hanya
saja menimbulkan masalah pada prosedur ekstraksi cair-cair (LLE).

Krim dan Salep

Garam asam lemak natrium atau kalium, surfaktan kationik dan non ionic biasanya
digunakan dalam sediaan krim dan salep. Seperti diuraikan di atas, bahan-bahan
tersebut tidak mengganggu absorpsi sinar UV karena sifat krommofornya yang sangat
lemah. Namun asam lemak akan mengganggu sistem kromatografi dengan
mengkontaminasi kolom RP HPLC, jika tidak dihilangkan. Kream dan salep
mengandung banyak minyak trigliserida yang harus dihilangkan sebelum analisis.
Ekstraksi kream dengan methanol dapat menghilangkan sedikit interferensi tersebut.

Contoh bagan pemisahan metode LLE dengan perubahan asam basa

Derivatisasi untuk ekstraksi

Derivatisasi dilakukan agar mendapatkan senyawa dengan sifat yang berbeda dari
senyawa asal sehingga mudah dilakukan ekstraksi terhadapnya. Contoh, derivatisasi
adrenalin dalam sediaan injeksi dengan reagen asetat anhidrat. Reaksi berjalan dalam
media natrium bikarbonat. Hasil reaksinya merupakan adrenalin yang mengendap
sehingga akhirnya dapat ditetapkan dengan metode gravimetrik (gambar 3).
Supercritical Fluid Extraction

Ekstraksi dengan metode supercritical fluid  telah banyak dikembangkan baik untuk

kepentingan analisis maupun ekstraksi. Luasnya penggunaan metode ini disebabkan
keuntungan yang dimiliki, yaitu:

1. Pelarut yang digunakan berada dalam titik kritis dimana pelarut tersebut memiliki
dua keuntungan yaitu dalam kemampuan pelarutan menyerupai larutan dan
kecepatan transfer massanya yang menyerupai sifat gas. Hasilnya adalah
kecepatan ekstraksi yang optimal.
2. Kekuatan pelarut dalam supercritical fluid dapat dimanipulasi dengan cara
mengatur tekanan pada drum tempat ekstraksinya.
3. Karbon dioksida yang merupakan pelarut umum digunakan dalam metode ini
mempunyai keunggulan tidak beracun, tidak mudah terbakar dan suhu kritiknya
pada 31,10C sehingga aman untuk ekstraksi senyawa-senyawa termolabil.

Solid Phase Extraction (SPE)/ Ekstraksi Fase Padat

Prinsip ekstraksi fase padat adalah analit yang disimpan dalam cartridge kemudian
diberikan pelarut dengan kekuatan elusi yang lemah sebanyak beberapa kali elusi dan
kemudian terakhir dielusi dengan pelarut dengan kekuatan elusi yang kuat. Pelarut
dengan kekuatan elusi yang kuat didasarkan kepada interkasinya dengan analit yang
akan diekstraksi. Secara umum tahap aplikasi SPE dalam analisis ada 4 atau 5 tahap,
dimana tujuan dan perlakuan setiap tahap berbeda (gambar 6). Teknik ekstraksi fase
padat ini sangat berguna untuk memisahkan analit dari matriksnya dengan selektifitas
yang besar. Modifikasi mekanisme pemisahan dalam ekstraksi fase padat dapat
dilakukan dengan mengganti komposisi dan jenis pelarut yang dipakai untuk elusi.
Teknik ini sangat luas dipakai dalam analisis sampel biologis dan sampel lingkungan.

Keuntungan teknik ekstraksi fase padat dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair adalah

1. Fase padat dari teknik ini tidak campur/ larut dengan pelarut dan setelah sampel
diaplikasikan ke dalam cartridge, analit dapat dicuci dari interferensinya dengan
cara melewatkan/ mencuci cartridge dengan pelarut tertentu yang kekuatan
elusinya dapat dimodifikasi.
2. Senyawa kimia dari fase padat dapat divariasikan sehingga akan didapatkan
karakter pemisahan yang berbeda dan ini dapat dioptimasi.
3. Tidak akan terjadi emulsi seperti halnya pencampuran dua pelarut dalam
ekstraksi cair-cair
4. Sampel dengan volume besar dapat ditampung dalam cartridge dan kemudian
dapat dilakukan prekonsentrasi
5. Hanya memerlukan sedikit pelarut untuk melakukan elusi
6. Ekstraksi dapat dilakukan dengan sistem batch atau dengan cara simultan
memakai banyak cartridge
 Gambar Tahap proses ekstraksi fase padat