Screening and Determination of Opiates in Human Urine Samples by Immunoassay and TLC - Spectrophotodensitometry

Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences 2019; 9 (2) : 82 - 88 e-ISSN 2657-0815, p-ISSN 1979-1763
http://ojs.unud.ac.id/index.php/ijlfs Asosiasi Ilmu Forensik Indonesia
SCREENING AND DETERMINATION OF OPIATES IN HUMAN URINE

SAMPLES BY IMMUNOASSAY AND TLC -
SPECTROPHOTODENSITOMETRY
Ni Putu Diah Kusuma Dewi1, Ni Wayan Intan Indayanti1, I Komang Niko Sanjaya1,
Anak Agung Intan Kharisma Dewi1, Ni Putu Linda Laksmiani1
1
Program Studi Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana, Bali, 80361
E-mail : kusumadewidiah1@gmail.com
ABSTRAK
Opiat merupakan golongan zat, baik alamiah maupun semisintetik yang memiliki khasiat
menghilangkan rasa nyeri (analgesik), menidurkan (hipnotik), dan menimbulkan perasaan gembira
(euforik). Penggunaan berulang akan menimbulkan toleransi (kekebalan tubuh terhadap zat) dan
ketergantungan. Oleh karena itu senyawa golongan opiate selain dapat digunakan dalam pengobatan,
juga sangat rentan untuk disalahgunakan. Sehingga diperlukan suatu metode untuk mendeteksi
keberadaan senyawa golongan opiat dalam spesimen biologis, salah satunya adalah di dalam urin. Pada
penelitian ini dilakukan pengujian terhadap sampel simulasi yang telah ditambahkan dengan senyawa
narkotika tertentu. Proses skrining golongan senyawa dalam urin dapat dilakukan dengan menggunakan
teknik immunoassay dengen strip test. Hasil pengujian menunjukkan positif terhadap golongan senyawa
opiat. Uji konfirmasi dengan menggunakan KLT Spektrofotodensitometri pada sistem fase gerak TE
(etil asetat : metanol : ammonia 85 : 10 : 5% v/v/v) dan fase gerak TAE (metanol 100% v/v)
menunjukkan terkonfirmasinya kandungan senyawa opiat dalam sampel urin simulasi adalah morfin.
Tahap selanjutnya adalah dengan uji determinasi dengan KLT Spektrofotodensitometri pada sistem
gerak TE (etil asetat : metanol : ammonia 85 : 10 : 5% v/v/v) menggunakan enam larutan seri dengan
konsentrasi berbeda (100, 300, 500, 700, 900, dan 1100 ng/µL). Koefisien korelasi yang dihasilkan yaitu
0,9762, LOD sebesar 493,24 ng, dan LOQ sebesar 1494,66 ng. Pada sampel urin simulasi diperoleh
kadar morfin sebesar 25,55 µg/mL, 17,56 25,55 µg/mL, dan 14,96 25,55 µg/mL pada tiga kali replikasi.
Kata kunci: Opiat, Morfin, KLT-Spektrofotodensitometri
ABSTRACT
Opiates are a class of substances, both natural and semisynthetic that have the ability to relieve
pain (analgesics), put to sleep (hypnotics), and cause feelings of joy (euphoric). Repeated use will lead
to tolerance (immunity to substances) and dependence. Therefore opiate class compounds besides can
be used in medicine, are also very vulnerable to abuse. So that we need a method to detect the presence
of opiates in biological specimens, one of which is in the urine. In this study, testing of simulated samples
that have been added with certain narcotic compounds. The process of screening of compounds in the
urine can be done using the immunoassay technique with a strip test. The test results showed positive
for opiates. Confirmation test using TLC Spectrophotodensitometry in the TE mobile phase system
(ethyl acetate: methanol: ammonia 85: 10: 5% v/v/v) and the mobile phase TAE (methanol 100% v / v)
shows the confirmation of the content of opiate compounds in urine samples simulation is morphine.
The next step is the determination test with TLC Spectrophotodensitometry in the TE motion system
(ethyl acetate: methanol: ammonia 85: 10: 5% v/v/v) using six series solutions with different
concentrations (100, 300, 500, 700, 900, and 1100 ng / µL). The resulting correlation coefficient is
0.9762, LOD is 493.24 ng, and LOQ is 1494.66 ng. In the simulation urine sample morphine levels were
25.55 μg / mL, 17.56 25.55 μg / mL, and 14.96 25.55 μg / mL at three replications.
Keywords: Opiate, Morphine, TLC-Spectrophotodensitometry
82
Ni Putu Diah Kusuma Dewi, Ni Wayan Intan Indayant, I Komang Niko Sanjaya, Anak Agung Intan
Kharisma Dewi, Ni Putu Linda Laksmiani
PENDAHULUAN
Ilmu toksikologi forensik adalah sebab itu penting dilakukan analisis
bagian dari ilmu forensik yang toksikologi terhadap golongan opiat.
mempelajari tentang racun dan Dalam melakukan analisis
senyawa berbahaya bagi tubuh yang toksikologi, dilakukan penyiapan
ada kaitannya dengan peradilan [1]. sampel, uji skrining, uji konfirmasi, uji
Ilmu toksikologi forensic mencakup identifikasi dan interpretasi data [2].
beberapa bidang kerja salah satunya Pada penelitian ini, dilakukan uji
adalah analisis obat terlarang dalam skrining dengan metode immunoassay
darah dan urin pada kasus menggunakan strip test yang spesifik
penyalahgunaan narkotika, terhadap senyawa golongan opiat.
psikotropika dan obat terlarang Sampel urin yang positif mengandung
lainnya [2]. Berdasarkan data dari golongan opiate dikonfirmasi dan
Badan Narkotika Nasional, pengguna identifikasi dengan metode KLT-
narkotika diperkirakan mengalami Spektrofotodensitometri. Kelebihan
peningkatan mencapai 2,21% dari metode ini yaitu dengan instrument
jumlah penduduk Indonesia dan sederhana, dan harga yang relatif
sebagian besar penyalahgunaan murah, tetap dapat menjadi metode
narkotika didominasi oleh kalangan analisis kualitatif yang akurat. Uji
remaja sebesar 24-28% [3]. Salah satu konfirmasi dengan KLT-
jenis golongan narkotika yang sering Spektrofotodensitometri dilakukan
disalahgunakan adalah opiat. Opiat berdasarkan parameter hRf dan
merupakan segolongan zat, alamiah, korelasi spektrum analit dengan
semi sintetik, maupun sintetik yang spektrum pustaka. Pada penelitian ini
memiliki khasiat analgesik, hipnotik, digunakan nilai hRf terkoreksi (hRfc)
dan menimbulkan rasa gembira dalam untuk menghilangkan pengaruh tipe
waktu yang lama. Pemakaian opiat bajana pengembang, arah elusi, fase
yang dilakukan secara berulang akan gerak, kondisi chamber, dan metode
menimbulkan kekebalan tubuh dan preparasi sampel. Nilai hRf terkoreksi
dapat mengakibatkan ketergantungan (hRfc) yang diperoleh dari penotolan
[4]. Efek yang diberikan dari senyawa standar bersama analit dalam
penggunaan golongan opiate satu plat, kemudian dielusi dengan dua
didasarkan pada dosis yang sistem fase gerak yang telah
digunakan. Pada anak-anak, dosis letal ditetapkan [6].
golongan opiat sebesar 10 mg, dan Berdasarkan hal tersebut, tujuan
pada orang dewasa sebesar 30-50 mg dari penelitian ini adalah untuk
Dosis minimal yang mampu melaksanakan uji skrining dan
menyebabkan toksik pada anak-anak determinasi senyawa golongan opiat
sebesar 10 mg telah memberikan efek dalam sampel urin dengan
yang sangat fatal, dosis letal untuk menggunakan teknik immunoassay
dewasa sebesar 30-50 mg [5]. Oleh dan KLT-spektrofotodensitometri
83
METODE PENELITIAN penambahan amonia atau dengan

Bahan dan Peralatan penambahan dapar asam borat pH 10
Sampel urin; plat KLT silika gel sebanyak 1 mL. Sampel kemudian
GF254; akuades, methanol, Etil asetat : ditambahkan dengan 0,75 mL
metanol : amonia (85:10:5 v/v); kloroform:isopropanol (4:1). Sampel
metanol (100 %v); baku standar kemudian di vortex (2500 rpm) ± 5
morfin; baku standar reference sistem menit. Disentrifugasi (3000 rpm)
TE (teofilin, phenobarbital, selama 5 menit. Fase organik
chlordiazepam, diazepam) dan sistem ditampung di vial.
TAE (trimetoprim, papaverin,
phenobarbital); HCl; buffer borat pH Uji Konfirmasi
10; Kloroform:isopropanol (4:1 v/v); Disiapkan fase gerak sistem TE
Densitometer CAMAG TLC Scanner (Etil asetat - metanol - amonia pekat
4; Chamber; timbangan analitik, strip (85:10:5) v/v) dan TAE (metanol) v/v)
pH, dan strip test. masing-masing 10 mL. Plat KLT (10
cm x 6 cm) dicuci dengan metanol,
Metode diaktivasi pada suhu 110˚C selama 10
Uji Skrining menit. Sampel hasil ekstraksi cair-cair
Uji Organoleptis Sampel dan senyawa standar reference (1
Warna, bau, dan pH dari sampel mg/mL dalam metanol) ditotolkan
urin diamati. pada kedua plat KLT sebanyak 6µL.
Dielusi pada chamber TE dan TAE
Uji Skrining dengan Teknik yang telah dijenuhkan. Plat KLT
Immunoassay (Strip test) diangin-anginkan, lalu dideteksi
Strip test dicelupkan ke dalam dengan TLC-visualizer pada sinar UV
sampel urin pada botol vial dengan 210 nm. Dilakukan pencocokan
arah panah menunjuk tegak lurus pada spektrum sampel pada library.
sampel. Proses deteksi ditunggu Dihitung harga hRf dan hRfc dari
selama ± 4-6 menit. Strip lalu masing-masing
diletakkan dipermukaan datar yang
bersih dan tidak menyerap. Hasil dapat Uji Determinasi
dibaca antara 10-30 menit setelah Disiapkan fase gerak sistem
pencelupan dalam sampel. TE (Etil asetat - metanol - amonia
pekat (85:10:5) v/v) 10 mL. Plat KLT
Ekstraksi Cair-cair (10cm x 10 cm) dicuci dengan
1 mL sampel urin ditambahkan metanol, kemudian diaktivasi pada
0,05 mL HCl. Sampel dipanaskan suhu 110˚C selama 10 menit. Dibuat
pada suhu 100oC (15 menit) untuk larutan seri standar morfin 100 µg/µL,
mempercepat hidrolisis. Didinginkan 300 µg/µL, 500 µg/µL, 700 µg/µL,
pada suhu ruangan dan pH sampel 900 µg/µL, dan 1100 µg/µL. Sampel
dipertahankan pada pH 10 dengan hasil ekstraksi cair-cair dan larutan
84
seri ditotolkan pada plat KLT menunjukkan bahwa urin yang

sebanyak 20 µL dan 2 µL. Dielusi digunakan memiliki volume 5 mL
pada chamber sistem TE yang telah dengan warna kuning jernih dan pH 6.
dijenuhkan. Plat KLT diangin- Karakteristik urin dari hasil uji
anginkan, lalu dideteksi dengan TLC- organoleptis yang diperoleh sesuai
visualizer pada sinar UV 210 nm. dengan karakteristik urin orang
Dilakukan perhitungan kadar senyawa normal [12]. Kemudian, dilanjutkan
dalam sampel urin. uji konfirmasi dengan menggunakan
teknik immunossay dengan strip test
HASIL dan PEMBAHASAN tunggal yaitu opiat dan amfetamin.
Penyalahgunaan narkotika dan Hasil menunjukkan bahwa senyawa
psikotropika di masyarakat semakin yang terdapat pada sampel positif
mengalami peningkatan. Berdasarkan mengandung senyawa golongan opiat
data Survey BNN pada tahun 2014 karena memberikan satu garis pada
setidaknya 3,8 sampai 4,1 juta zona T pada strip test opiat [10].
masyarakat Indonesia merupakan Opiat merupakan zat yang
pengguna narkoba [7]. Pemeriksaan memiliki khasiat analgesik, hipnotik,
senyawa narkotika dapat dilakukan dan euforia (Dwi, 2001). Opiat
dilaboratorium untuk kepentingan memiliki karakteristik pKa cenderung
analisis toksikologi [8]. Analisis basa sehingga pelarut ekstraksi yang
toksikologi forensik dapat digunakan agar memperoleh nilai
dilaksanakan untuk mengetahui fraksi tak terionkan diatas 95% [14].
senyawa yang dikonsumsi seseorang Sampel yang sudah positif dengan
untuk suatu kasus penyalahgunaan [9]. uji skrining kemudian diektraksi
Tahapan analisis toksikologi dengan menggunakan metode
forensik diawali dengan pemeriksaan ekstraksi cair-cair dengan
pendahuluan (screening test), apabila menggunakan pelarut ekstraksi
memberikan hasil positif maka dapat kloroform:isopropanol (8:2 v/v) yang
dilaksanakan uji lanjutann yaitu uji sebelumnya dihidrolisis dengan HCl
konfrimasi dan uji determinasi [10]. dan dibasakan dengan dapar borat pH
Sampel yang digunakan dalam 10 . Sampel selanjutnya divorteks dan
penelitian ini adalah urin karena sentrifugasi masing-masing 5 menit
mudah untuk diperoleh dan stabil [15].
dalam pemeriksaan [11]. Penanganan Tahapan selanjutnya adalah uji
sampel dalam analisis dengan materi konfirmasi. Uji konfirmasi dengan
biologis perlu memperoleh perhatian menggunakan metode KLT minimal
khusus karena ada kemungkinan menggunakan dua fase gerak berbeda
terjadinya penguraian analit [2]. agar dapat memperkecil senyawa yang
Tahapan awal analisis toksikologi masuk dalam uji skrining. Fase gerak
forensik yaitu uji organoleptis dan uji yang dipilih diusahakan dapat
skrinig. Hasil uji organoleptis memberikan nilai hRfc yang terpaut
85
jauh untuk senyawa dalam satu Fase gerak kedua yang digunakan
golongan senyawa [9]. Sistem fase adalah sistem fase gerak TAE yang
gerak yang digunakan dalam terdiri atas metanol 100% dengan
penelitian ini adalah TE dan TAE standar trimetoprim, papaverin, dan
karena dapat memberikan sebaran phenobarbital. Senyawa golongan
nilai hRfc cukup jauh untuk senyawa opiat yang didata berada pada rentang
golongan opiat [16]. Harga hRf yang hasil perhitungan hRfc yaitu 12,6-
diperoleh pada uji konfirmasi harus 30,6, senyawa tersebut diantaranya
dihitung dengan menggunakan metode adalah morfin, kodein, heroin,
korelasi poligonal menggunakan methadone, oxymorphone,
empat senyawa standar pembanding hydromorphone, oxycodone, dan
[17] karena hasil analisis kualitatif hydrocode. Hasil spektrum
dengan KLT dipengaruhi oleh banyak selanjutnya dikorelasi dengan standar
faktor. morfin diperoleh nilai korelasi
Sistem fase gerak TE 0,99458. Hasil kedua sistem fase gerak
menggunakan fase gerak etil menunjukan positif senyawa morfin
asetat:metanol:amonia (85:10:5 v/v/v) sehingga hasil uji terkonfirmasi
dengan standar teofilin, phenobarbital, senyawa golongan opiat.
clordiazepam, dan diazepam.
Grafik hRf vs hRfc sistem
Berdasarkan hasil perhitungan TAE
diketahui nilai hRfc yang diperoleh
adalah 8,5-19,5, sehingga selanjutnya 100
C D
Axis Title
didata senyawa yang masuk dalam 50 B

rentang hRfc. Senyawa yang termasuk 0 X
A
dalam rentang tersebut adalah morfin 0 50 100
dan hydromorphone. Selanjutnya, Axis Title
dilaksanakan korelasi spektrum Gambar 2. Grafik Poligonal Sistem
dengan standar, diperoleh nilai TAE
korelasi dengan morfin sebesar Uji determinasi dilaksanakan
0,99518. Sehingga, dalam sistem TE dengan menggunakan sistem TE.
diduga senyawa dalam sampel adalah Hasil pemisahan TE lebih baik dengan
morfin. nilai resolusi 1,6 yang lebih tinggi
Grafik hRf vs hRfc sistem TE dibanding 1,5 [18]. Adapun data
100
determinasi yang diperoleh dapat
dilihat pada tabel 1.
C D
Axis Title
50 Tabel 1. Hasil Uji Determinasi

B Larutan Kons. AUC
X (ng/µL)
0 A
0 50 100 Seri 1 100 3218.9
Axis Title Seri 2 300 6643.7
Gambar 1. Grafik Poligonal Sistem TE Seri 3 500 11798.3
86
Seri 4 700 10927.6 Forensic Sciences 2008; 1: 47 –

Seri 5 900 11697.8 55.
Seri 6 1100 14172.2 [3] Bnn.go.id [homepage on the
Sampel 1 - 5542.7 internet]. Indonesia: BNN [cited
Sampel 2 - 4712.3 2020 Jan 10. Available from:
Sampel 3 - 4441.8 https://bnn.go.id/penggunaan-
Hasil korelasi dengan narkotika-kalangan-remaja-
menggunakan data seri 1,2,4,5, dan 6 meningkat/.
dengan r2 yang diperoleh adalah [4] Brunton, L.L., Chabner, B.A.,
0,9762, dengan nilai LOD dan LOQ Knollmann, B.C. Goodman &
dengan masing-masing 493,238 ng Gilman’s: The Pharmacological
dan 1494,66 ng. Konsentrasi senyawa Basis of Therapeutics. 12th ed.
morfin dengan replikasi 3 kali USA: The McGraw-Hill
diperoleh data kadar rata-rata adalah Companies; 2011.
19,36 µg/mL. Kadar tersebut masih [5] Wolff K. Characterization of
dibawah dosis letal morfin pada urin methadone overdose: clinical
yaitu 50-200 µg/mL [9]. considerations and the scientific
evidence. Ther Drug Monit 2002;
24:457-470.
KESIMPULAN [6] Wirasuta, I. M. A. G, I. A. S.
Senyawa yang terdapat dalam Primaningrum, and K.W. Astuti.
urin berdasarkan uji skrining Uji Konfirmasi dan Penetapan
dengan immunoassay, uji Kadar Morfin dengan KLT-
konfirmasi dan determinasi dengan Spektrofotodensitometri.
KLT-Spektrofotodensitometri Indonesian Journal of Legal and
diperoleh bahwa senyawa yang Forensic Sciences 2014; 4: 5-7
terdapat pada sampel urin adalah [7] Henridrasti, V.L.S. Drug-free
morfin dengan kandungan 19,36 ASEAN 2025: Tantangan
µg/mL yang masih dibawah dosis Indonesia dalam Penanggulangan
letal pada urin. Penyalahgunaan Narkoba. Jurnal
Hubungan Internasional 2018; 7:
DAFTAR PUSTAKA 19-33.
[8] Butar, D.. Kondisi Narkoba di
[1] Karmakar, R.N. Forensic Medicine Indonesia Pada Akhir Tahun
and Toxicology. 3rd ed. India: 2011. Jakarta : Badan Narkotika
Academic Publishers Kolkata; Nasional Republik Indonesia;
2010. 2011.
[2] Wirasuta, I M. A. G. Analisis [9] Moffat, A. C., M. D. Osselton and
Toksikologi Forensik dan B. Widdo. Clarke’s Analysis of
Interpretasi Temuan Analisis. Drugs and Poisons. 4th ed. USA:
Indonesian Journal of Legal and Pharmaceutical Press; 2011.
87
[10] Badan Narkotika Nasional. [16] Sherma, J. and Fried, B.. Thin
Pedoman Pemeriksaan Layer Chromatography. 3rd ed.
Laboratorium Narkotika, New York: Marcel Dekker; 1994.
Psikotropika dan Obat Berbahaya. [17] Zeeuw, R.A., J.P. Franke, F.
Jakarta : Badan Narkotika Degel, G. Machbert, H. Schutz,
Nasional; 2008. dan J. Wijsbeek. Thin Layer
[11] Manela, C. Pemilihan, Chromatographic Rf Values of
Penyimpanan dan Stabilitas Toxicologically Relevant
Sampel Toksikologi pada Korban Substances on Standardized
Penyalahgunaan Narkotika, Systems. Jerman: VHC
Jurnal Kesehatan Andalas 2015; Verlagsgesellschaft; 1992.
4:338-345 cit. Kerrigan, S. [18] Skoog, D.A., Holler, F.J., Crouch,
Sampling, Storage and Stability in S.R. Principles of Instrumental
: Clarke’s Analytical Forensic Analysis. Seventh Edition. USA:
Toxicology. 2nd ed. Cornwall: Cengage Learning; 2018.
Pharmaceutical Press; 2008.
[12] Widyastuti, N., Sulchan, M.,
Johan, A. Asupan Makan,
Sindrom Metabolik, dan Status
Keseimbangan Asam-Basa pada
Lansia. Jurnal Gizi Klinik
Indonesia 2013; 9:179-187.
[13] Dwi, L.Y. Narkoba Pencegahan
dan Penanganannya. Jakarta: PT.
Elex Media Komputindo; 2001.
[14] Gandjar, I. G. dan A. Rohman.
Analisis Obat secara
Spektrofotometri dan
Kromatografi. Yogyakarta:
Pustaka Pelajar; 2012.
[15] Ahadi, A., Partoazar, A., Abedi-
Khorasgani, M. H., Shetab-
Boushehri, S. V. Comparison of
Liquid-Liquid Extraction-Thin
Layer Chromatography with
Solid-Phase Extraction-High
Performance Thin Layer
Chromatography in Detection of
Urinary Morphine, Journal of
Biomedical Research 2011;
25(5):362-367.
88

Screening and Determination of Opiates in Human Urine Samples by Immunoassay and TLC - Spectrophotodensitometry

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Screening and Determination of Opiates in Human Urine Samples by Immunoassay and TLC - Spectrophotodensitometry

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences 2019; 9 (2) : 82 - 88 e-ISSN 2657-0815, p-ISSN 1979-1763

http://ojs.unud.ac.id/index.php/ijlfs Asosiasi Ilmu Forensik Indonesia

SCREENING AND DETERMINATION OF OPIATES IN HUMAN URINE

METODE PENELITIAN penambahan amonia atau dengan

seri ditotolkan pada plat KLT menunjukkan bahwa urin yang

didata senyawa yang masuk dalam 50 B

50 Tabel 1. Hasil Uji Determinasi

Seri 4 700 10927.6 Forensic Sciences 2008; 1: 47 –

Anda mungkin juga menyukai