12.2.

2 Kimia, Kinetika dan Mekanisme

Komposisi enzim, struktur, dan karakteristik katalitik. Enzim dibentuk dalam sistem
kehidupan melalui kondensasi dan/atau dehidrasi asam amino untuk membentuk ikatan
peptida. Ada 20 asam amino alami dengan rantai samping (gugus R) yang memiliki fungsi
molekuler yang berbeda, seperti pemberian proton, pelepasan proton, dan pembentukan
jembatan. Rantai samping ini juga dapat menjadi gugus fungsi situs aktif atau ligan untuk
pengikatan ion logam, yang kemudian menjadi situs aktif fungsional. Ion logam yang
terdapat secara alami dalam enzim antara lain Mg2+, Zn2+, Ca2+, Ni2+, Fe2+, Fe3+, Co3+,
dan Mo2+. Struktur enzim dapat diklasifikasikan pada empat tingkatan (Gates, 1992; Nelson
dan Cox, 2005): (1) struktur primer dibentuk oleh urutan spesifik unit asam amino (residu)
dalam makromolekul; (2) struktur sekunder dibentuk oleh segmen rantai polipeptida yang
disusun menjadi struktur seperti heliks-a atau lembaran berlipat-B; (3) struktur tersier adalah
struktur tiga dimensi yang terdiri dari heliks dan lembaran, yang meliputi lipatan dan celah;
dan (4) struktur kuartener dibentuk dengan menghubungkan unit tiga dimensi tersier yang
mungkin ada beberapa di setiap enzim. Gugus samping asam amino memainkan peran kunci
dalam interaksi molekul (misalnya ikatan hidrogen) yang diperlukan untuk menstabilkan
struktur tingkat sekunder, tersier, dan kuaterner, yaitu diperlukan enzim untuk
mempertahankan bentuknya (konformasi).
Lisozim, yang mengkatalisis pemecahan rantai polisakarida, adalah salah satu enzim yang rincian
lengkap struktur molekulnya telah ditentukan. Terdiri dari 129 residu asam amino yang bergabung
melalui ikatan peptida. Residu asam glutamat pada posisi 35 dan residu asam aspartat pada posisi
52 adalah gugus fungsi penting pada sisi aktif. Kimotripsin adalah enzim lain yang dicirikan dengan
baik yang memiliki berat molekul sekitar 25.000 dan urutan yang diketahui dari 246 residu asam
amino. Ester yang mengalami hidrolisis juga ditampilkan diposisikan di situs aktif. Chymotrypsin
mengkatalisis hidrolisis asetil-L-fenilalanin metil ester tetapi tidak berinteraksi dengan isomer D yang
sesuai. Karakteristik katalitik yang khas dari enzim (Gates, 1992) meliputi: (1) strukturnya yang
fleksibel, yang memfasilitasi ‘kecocokan yang diinduksi’ dari substrat, pembuatan dan pemutusan
ikatan, dan pelepasan produk dan (2) kepekaannya terhadap reaksi. Efektor (inhibitor atau
aktivator), yang fungsinya mirip dengan promotor yang ditambahkan ke katalis heterogen. Beberapa
enzim memerlukan kofaktor, yang bergabung dengan enzim untuk membentuk situs katalitik; ion
logam adalah contoh kofaktor.

Reaksi enzimatik mungkin juga memerlukan koenzim, yang memproses reaktan menjadi substrat
yang kompatibel dengan enzim. Organisme hidup mengendalikan dan mengoptimalkan proses
biologis dengan menggunakan berbagai alat, seperti: (1) efektor enzim, (2) pengaturan laju sintesis
atau aktivasi enzim, (3) kompartementalisasi enzim di dalam organ atau organel, dan (4)
penghancuran ( editing) dari intermediet atau produk yang tidak diinginkan (Gates, 1992). Enzim
umumnya berfungsi hanya di bawah kondisi suhu dan pH ringan yang diamati pada organisme hidup.
Jika terkena kondisi suhu dan pH yang parah, mereka mengalami denaturasi, yaitu kehilangan atau
modifikasi gugus fungsi atau residu asam amino dan/atau perubahan konformasi, yang dapat
mengubah dan menonaktifkan situs aktif. Aktivitas enzim khas meningkat secara eksponensial
dengan suhu sesuai dengan hukum Arrhenius hingga sekitar 50-60 ° C, di mana ia melewati
maksimum, dan menurun drastis antara sekitar 60-70 ° C. Jadi umur katalis mungkin dalam urutan
hari sampai minggu pada sekitar 50 °C; namun, tingkat penonaktifan sangat tinggi hanya pada suhu
yang sedikit lebih tinggi (misalnya, hilangnya aktivitas 50% dalam 5 menit pada 65-70 °C adalah
tipikal).

Mekanisme dan siklus katalitik telah didalilkan untuk sejumlah sistem reaksi enzim (Gates, 1992),
seperti hidrolisis asam ribonukleat yang dikatalisis ribonuklease, hidrasi CO yang dikatalisis anhidrase
karbonat, menjadi bikarbonat, dan dehidrasi diol yang dikatalisis oleh vitamin B12. Urutan reaksi
sederhana yang diusulkan untuk hidrolisis ester yang dikatalisis chymotrypsin (Latham dan Burgess,
1977) adalah sebagai berikut: E + R,0-CR, ES -2» R,COE + R,OH R,COH + E (12,37).
Beberapa gugus fungsi pada enzim, mis. Gugus karboksilat (COO), berperilaku sebagai basa
Brønsted, berasosiasi dengan ion hidronium dalam larutan untuk memberikan bentuk asam dari
gugus fungsi, seperti gugus asam karboksilat (COOH); beberapa gugus fungsi asam juga merupakan
donor proton. Penambahan (atau penghilangan) muatan positif (misalnya proton) ke gugus fungsi
kritis mendistribusikan kembali muatan pada sisi aktif dan mempengaruhi pengikatannya dengan
substrat. Bentuk enzim yang paling aktif sering kali adalah bentuk di mana proton terikat pada salah
satu gugus fungsi; dengan demikian baik pemindahan proton itu atau penambahan proton kedua ke
gugus fungsi lain akan menurunkan aktivitas. Dengan demikian, laju sebagian besar reaksi enzimatik
merupakan fungsi kuat dari pH. Sebagai contoh, Gambar 12.15 mengilustrasikan pengaruh pH pada
laju hidrolisis glukosamin yang dikatalisis lisozim, menunjukkan bahwa laju maksimum terjadi pada
pH sekitar 5,5.
Gambar 12.16menunjukkan jaringan keseimbangan pertukaran proton untuk enzim yang memiliki
aktivitas optimal dalam bentuk monoprotonik, EH. Jadi hanya kompleks EHS yang berisi gugus fungsi
utama yang memungkinkan konversi substrat menjadi produk. Gambar 12.16 menunjukkan bahwa
konsentrasi maksimum kompleks terjadi pada nilai pH antara yang konsisten dengan data pada
Gambar 12.15. Menggunakan pendekatan yang serupa dengan yang digunakan untuk menurunkan
Persamaan 12.36 dan dengan asumsi bahwa (1) Langkah penentuan laju adalah konversi EHS ke
produk, dan EH, (2) konsentrasi substrat besar; (3) akibatnya enzim sebagian besar hadir sebagai
spesies yang mengandung substrat (yaitu EH2, EH2S* atau EHS), dan (4) bahwa reaksi pertukaran
proton K, dan K2 berada dalam kesetimbangan, laju pembentukan produk adalah

Persamaan ini memprediksi bahwa laju reaksi yang dikatalisis enzim bergantung pada pH dan tidak
bergantung pada konsentrasi substrat; Selain itu, karena suku kedua dalam penyebut besar pada
Cy+ tinggi atau pH rendah, maka laju di daerah pH rendah meningkat dengan meningkatnya pH dan
penurunan pk1, sedangkan pada pH tinggi, laju meningkat dengan menurunnya pH dan
meningkatnya pK2. Memang, garis putus-putus pada Gambar 12.16 diprediksi oleh Persamaan
12.38. Nilai pH optimum untuk reaksi katalis enzim yang berbeda dapat bervariasi dari 6,0-11,8,
meskipun banyak enzim paling aktif pada nilai pH menengah (6-8) (Campbell, 1988). Perhatikan
bahwa jika Asumsi 2 dan 3 di atas dilonggarkan, ekspresi laju akan sangat kompleks dan bergantung
pada Cs.

12.2.3 Proses Enzimatik Industri dan Bioteknologi

Istilah biokatalisis dapat digunakan untuk menggambarkan reaksi yang dikatalisis oleh enzim,
terlepas dari apakah itu terjadi di dalam atau di luar sel; oleh karena itu, biokatalis dapat berupa
enzim bebas atau mikroorganisme yang menggunakan satu atau lebih enzim yang terkandung di
dalam sel untuk mengkatalisis reaksi tertentu. Secara historis, biokatalis telah digunakan selama
ratusan tahun dalam pembuatan produk susu, roti dan produk kue, dan minuman beralkohol,
meskipun dalam skala terbatas. Namun, dalam tiga dekade terakhir mereka telah mulai
diintegrasikan secara luas ke dalam praktik industri disertai dengan munculnya industri bioteknologi
yang substansial dan berkembang hanya dalam 15-20 tahun terakhir. Industri baru ini adalah hasil
dari beberapa perkembangan ilmiah dan rekayasa kunci: (1) penemuan dan karakterisasi sejumlah
besar enzim yang mengkatalisis reaksi yang berguna secara industri telah meningkatkan jumlah
reaksi yang dapat diakses; (2) pengembangan teknik untuk merekayasa enzim-enzim ini untuk
mengoptimalkan kinerja dan stabilitasnya telah secara signifikan meningkatkan jumlah aplikasi
industri yang layak secara ekonomi; (3) metode produksi, isolasi, dan imobilisasi enzim yang lebih
baik (lebih murah) telah menghasilkan peningkatan ekonomi proses; (4) pengembangan proses
enzimatik non-air telah memperluas jumlah produk, reaktan, dan reaksi yang dapat digunakan; dan
(5) peningkatan teknologi reaktor telah memfasilitasi kontrol proses enzimatik yang lebih tepat.
Meskipun perbaikan ini, keterbatasan dalam ketersediaan enzim, ruang lingkup substrat, dan
stabilitas operasional terus menahan integrasi proses enzimatik ke dalam aplikasi industri
(Schoemaker et al., 2003).

Enzim yang tersedia yang dapat menghasilkan produk ini harus diidentifikasi atau direkayasa dan
dikarakterisasi (misalnya aktivitas enzim, suhu maksimum, dll.). Karakterisasi ini memungkinkan
desain reaktor dan perangkat keras lain yang diperlukan untuk proses biokatalitik. Selanjutnya,
suatu proses harus diatur, dioperasikan, dan dianalisis untuk mendapatkan data yang berkaitan
dengan faktor desain penting seperti stabilitas proses, konversi, biaya, dan umur enzim. Akhirnya,
analisis ekonomi harus dilakukan untuk menentukan kelayakan teknis dan profitabilitas. Membatasi
aspek proses kemudian ditingkatkan secara iteratif. Misalnya, upaya dalam rekayasa enzim mungkin
dapat meningkatkan umur enzim, yang dapat menurunkan biaya, terutama jika enzim itu mahal.
Spesialis dari berbagai bidang diperlukan untuk keberhasilan pengembangan proses enzimatik,
termasuk ahli kimia, insinyur kimia, ahli biokimia, dan ahli mikrobiologi; misalnya diperlukan
keahlian untuk rekayasa enzim, karakterisasi dan pengujian enzim, desain reaktor dan proses, serta
pengendalian proses. Penting untuk prosedur ini adalah pemahaman tentang jenis perbaikan apa
untuk setiap langkah proses yang mungkin. Ini membutuhkan pengetahuan terkini tentang enzim,
peralatan, dan teknik proses yang tersedia secara komersial, yang semuanya terus ditingkatkan.
Sumber dan ketersediaan enzim. Enzim dapat diisolasi dari bakteri, kapang, khamir, tumbuhan dan
hewan (Zaborsky, 1977, Aehle 2004). Pankreas, hati, dan darah hewan merupakan sumber yang
sangat kaya dan secara historis merupakan sumber utama enzim. Namun, kemajuan signifikan
terbaru dalam rekayasa genetika telah merevolusi produksi enzim dan isolasi untuk keperluan
industri. Penggunaan “serangga perancang” (Schoemaker et al., 2003), atau mikroorganisme yang
direkayasa secara genetik (dimodifikasi) untuk menghasilkan sejumlah besar enzim yang diinginkan
dipraktikkan secara luas (Lorenz dan Eck, 2004; Cherry dan Fidantsef, 2003) . Metodologi ini
melibatkan penyambungan gen, atau serangkaian gen, ke dalam DNA mikroorganisme, seperti
Escherichia coli atau Saccharomyces cerevisiae, untuk meningkatkan produksi enzim yang diinginkan
dan meminimalkan produksi produk yang tidak diinginkan. Enzim dapat diambil dari sel dan
dimurnikan, atau mikroorganisme itu sendiri dapat digunakan dalam proses industri. Dalam kedua
kasus, keuntungan utama dari metode ini adalah kemampuan untuk menghasilkan enzim yang
diinginkan dalam jumlah besar dan konsentrasi tinggi.
Enzim yang direkayasa saat ini menyumbang sekitar 90% dari enzim yang digunakan secara
komersial (Cherry dan Fidantsef, 2003). Paling umum, perubahan dibuat pada asam amino di situs
aktif, yang mengarah ke peningkatan aktivitas dan / atau selektivitas. Penyesuaian enzim ini dapat
dilakukan dengan banyak cara, termasuk mutasi gen acak, rekayasa protein rasional, dan evolusi

enzim terarah.

Teknologi proses enzimatik. Selain biokatalis yang ditingkatkan, reaktor yang lebih baik, kontrol
proses, dan desain proses adalah kunci untuk pengembangan proses industri yang ramah lingkungan
dan ekonomis (Panke dan Wubbolts, 2002). Topik-topik seperti metode imobilisasi, proses non-air,
dan diskusi manfaat teknologi reaktor.

Metode imobilisasi. Enzim dan sel yang tidak bergerak dapat hidup lebih lama secara signifikan;
yang paling penting, imobilisasi sangat menyederhanakan dan mengurangi biaya pemisahan produk
dari biokatalis. Metode imobilisasi biokatalis serupa dalam banyak hal dengan yang digunakan
dengan katalis homogen yang dibahas dalam Bagian 12.1.2. Metode imobilisasi enzim meliputi (1)
ikatan kovalen pada pendukung, (2) ikatan silang enzim menggunakan agen bifungsional, (3)
adsorpsi pada permukaan padat, (4) jebakan dalam gel, atau (5) penahanan dalam membran
(Zaborsky, 1977; Hartmeier, 1988). Dua metode pertama adalah kimia; tiga yang terakhir bersifat
fisik. Pilihan metode imobilisasi sangat tergantung pada karakteristik enzim dan aplikasi yang
diinginkan (Zaborsky, 1977).
 Evolusi enzim terarah dan rekayasa protein rasional juga akan memfasilitasi kemajuan di bidang
ini. Rekayasa enzim juga akan mendapat manfaat dari perkembangan pemahaman tentang struktur
dan fungsi enzim. Kurangnya pengalaman dalam industri biokatalisis dalam penerapan teknologi
reaktor dan kontrol proses mungkin menjadi faktor pembatas yang paling kritis dalam
pengembangan proses enzimatik yang ekonomis. Sementara perbaikan dalam rekayasa enzim,
teknik imobilisasi biokatalis, dan kimia enzim sedang meningkat, perbaikan dalam reaktor dan
teknologi pemisahan untuk aplikasi biokatalitik telah tertinggal (Yazbeck et al., 2004). Perbaikan
substansial lebih lanjut diperlukan dalam pemodelan proses dan rekayasa sistem biokatalis, reaktor,
dan proses untuk memfasilitasi stabilitas dan masa pakai yang lebih besar di bawah kondisi yang
relevan secara industri (Schoemaker et al., 2003). Industri mungkin mendapat manfaat dari
perekrutan insinyur kimia yang lebih besar dan memanfaatkan keahlian mereka dengan lebih baik
yang biasanya berpusat pada desain reaktor dan proses.

12.2.4 Contoh Proses Penting Isomerisasi glukosa.

Konversi pati menjadi pemanis dan sirup merupakan kegiatan penting dalam produksi produk
makanan. Mengikuti perkembangan glukoamilase pada tahun 1940-an dan 1950-an, menjadi
mungkin untuk secara ekonomis memproduksi sirup glukosa berkualitas tinggi dari pati jagung.
Namun, D-glukosa hanya memiliki 65-75% dari rasa manis sukrosa berdasarkan berat dan relatif
tidak larut pada suhu kamar; fruktosa, di sisi lain, adalah 20-80% (rata-rata 74%) lebih manis dari

sukrosa, dan dua kali lebih larut seperti glukosa (Chaplin dan Bucke, 1990; Cheetham, 1995). Jadi
konversi glukosa 50-55% menjadi fruktosa menghasilkan sirup pekat semanis sukrosa pada
konsentrasi yang setara (Persamaan 12.39). Pengembangan isomerase glukosa sekitar tahun 1960
memungkinkan isomerisasi ekonomi D-glukosa menjadi D-fruktosa pada konversi dan selektivitas
tinggi, di mana katalisis asam-basa konvensional tidak efektif. Sirup jagung fruktosa tinggi (HFCS)
telah diproduksi dalam skala besar menggunakan glukosa isomerase sejak akhir 1960-an (Hartmeier,
1988). Faktanya, ini adalah aplikasi komersial terbesar dari enzim amobil di seluruh dunia. Produksi
HFCS pada tahun 1988 diperkirakan sekitar 6-7 juta ton per tahun (Hartmeier, 1988). 1995 konsumsi
glukosa isomerase adalah sekitar 2000 ton (Cheetham, 1995). Dengan asumsi produk produktivitas
sederhana per ton katalis (Cheetham, 1995), 1995 produksi HFCS adalah sekitar 10 juta ton. 5000
ton
 Isomerisasi komersial glukosa menjadi fruktosa umumnya dilakukan dalam reaktor unggun tetap
aliran kontinu yang mengandung isomerase glukosa amobil granular. Larutan glukosa kasar dari
sakarifikasi disaring terlebih dahulu untuk menghilangkan bahan terlarut yang akan menyumbat
pori-pori katalis, sedangkan pengotor terlarut yang akan menghambat atau meracuni katalis
dihilangkan dengan adsorpsi pada karbon dan pertukaran ion dengan zeolit. Konsentrasi sirup
umpan diatur dengan penguapan hingga 35-45 % berat, karena konsentrasi yang lebih tinggi akan
menurunkan laju reaksi dengan meningkatkan ketahanan difusi pori dalam katalis. PH pakan
disesuaikan dalam kisaran 7,5-8,0 oleh860 DASAR PROSES KATALITIK INDUSTRI Penambahan
magnesium sulfat dan natrium karbonat. Mg2+ juga merupakan aktivator katalis; maka
konsentrasinya dikendalikan pada kisaran 0,15-0,75 g/liter. Karena Ca bersaing dengan Mg untuk
situs katalitik dan menghambat reaksi, konsentrasinya harus dijaga di bawah sekitar 1 ppm. Suhu
diatur dengan pertukaran panas menjadi 55-60 °C.

Reaktor umumnya beroperasi pada konversi glukosa 42-45%, yang cukup di bawah konversi
kesetimbangan 50%, untuk memungkinkan tercapainya laju reaksi yang wajar. Kecepatan ruang cair
biasanya 0,2-4/jam dan diturunkan untuk mempertahankan konversi konstan saat aktivitas enzim
menurun. Lebih dari satu reaktor diperlukan untuk mempertahankan kualitas produk yang konstan,
karena laju aliran dalam masing-masing reaktor berubah dengan aktivitas enzim; pada
kenyataannya, sebuah pabrik yang memproduksi 1000 t/hari HFCS (berdasarkan berat kering) dapat
menggunakan 20 reaktor (Gerhartz, 1990).

Asam L-aspartat banyak digunakan dalam industri makanan dan farmasi, misalnya dalam produksi
aspartam pemanis berkalori rendah dan dalam pengobatanleukemia. Ini diproduksi oleh reaksi
asam fumarat dengan amonia di atas L-aspartase (L-aspartat amonia-liase):
 Hidrolisis enzimatik: Produksi asam 6-aminopenicillanic (6-APA). Lebih dari 150 antibiotik yang
berbeda diproduksi secara komersial dengan fermentasi konvensional dengan modifikasi enzimatik
berikutnya (Cheetham, 1995). Misalnya, Actinomycetes saja menghasilkan 2.500 jenis antibiotik
yang berbeda. Penisilin G, ditemukan oleh Fleming pada tahun 1932, dan penisilin V, keduanya
diproduksi dengan hasil tinggi melalui fermentasi, merupakan antibiotik yang relatif tidak efektif
karena banyak mikroorganisme memiliki resistensi alami atau telah mengembangkan toleransi
melalui mutasi. Namun demikian, asam 6-aminopenicillanic (6-APA), yang diproduksi oleh hidrolisis
asetal penisilin-asilase-katalis penisilin G dan V, dapat digunakan untuk menghasilkan keluarga besar
(lebih dari 20) antibiotik yang sangat efektif seperti ampisilin dan amoksisilin (Hartmeier , 1988;
Chaplin dan Bucke, 1990; Cheetham, 1995). Pada tahun 2005, penjualan penisilin dan sefalosporin
di seluruh dunia kira-kira $12-13 miliar. Hidrolisis penisilin G yang dikatalisis asilase melibatkan
penghilangan rantai samping fenilasetat untuk menghasilkan asam fenilasetat dan 6-APA:

Penisilin asilase dapat diperoleh dari berbagai organisme bakteri dan jamur (Hartmeier, 1988;
Chaplin dan Bucke, 1990; Tim Biotol, 1993; Cheetham, 1995), meskipun asilase bakteri lebih
menyukai penisilin G dan asilase jamur paling aktif untuk penisilin V. Sumber khas untuk penisilin G
asilase termasuk E. Coli, Bacillus megaterium dan Achromobacter. Meskipun enzim telah digunakan
dalam keadaan bebas, di dalam sel mikroba, atau sebagai bentuk imobilisasi, yang terakhir adalah
bentuk yang lebih disukai karena keunggulan kapasitas produksi yang lebih tinggi, ukuran reaktor
yang lebih kecil, biaya produksi yang lebih rendah, dan kemampuan untuk menghasilkan enzim.
Produk berkualitas hipoalergenik tanpa pemisahan yang mahal, karena kebocoran protein dari
katalis amobil tidak terjadi. Lebih disukai enzim amobil daripada sel, karena persiapan katalis harus
bebas dari penisilinase (Alaktamase), yang ada di dalam sel dan mendegradasi penisilin. Pendukung
yang disukai meliputi Sephadex, serat selulosa triasetat, bentonit dengan bantuan filter, dan DEAE-
selulosa.