DASAR-DASAR PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

INDRIE RAMADHANI S. S.Si M.Biomed

WAHYUNI, S.ST, M.Biomed

CV. PENA PESRSADA

i
 DASAR DASAR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Penulis :
Indrie Ramadhani S. S.Si M.Biomed
Wahyuni, S.ST, M.Biomed

Editor :
Dr. dr. Netti Suharti, M.Kes

ISBN : 978-623-6688-48-9

Design Cover :
Retnani Nur Briliant

Layout :
Hasnah Aulia

Penerbit CV. Pena Persada

Redaksi :
Jl. Gerilya No. 292 Purwokerto Selatan, Kab. Banyumas Jawa
Tengah
Email : penerbit.penapersada@gmail.com
Website : penapersada.com
Phone : (0281) 7771388
Anggota IKAPI
All right reserved
Cetakan pertama : 2020

Hak cipta dilindungi oleh undang-undang.

Dilarang memperbanyak karya tulis ini dalam bentuk dan cara
apapun tanpa ijin penerbit

ii
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah atas rahmat Allah SWT sehingga penyu-

sunan Buku Praktikum Mikrobiologi dan Parasitologi ini dapat
diselesaikan dengan baik. Buku ini dibuat sebagai acuan dalam
proses pembelajaran yang membahas materi mengenai peng-
enalan, penggunaan dan perawatan mikroskop, pengendalian
mikroorganisme, pemeriksaan mikroskopis bakteri, pemeriksaan
morfologi koloni bakteri dan jamur, pemeriksaan feses dan
pemeriksaan darah.
Saran dan kritikan positif sangat kami harapkan demi
kesempurnaan buku praktikum ini. Terimakasih yang tidak terhi-
ngga kepada semua pihak yang telah membantu dalam pembu-
atan buku ini dan semoga dapat bermanfaat bagi semua.

Bukit tinggi,Agustus 2020

Penyusun

iii
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ...................................................................... iii

DAFTAR ISI ..................................................................................... iv
BAB I PENGENALAN ALAT LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI
A. Tujuan Praktikum ............................................................... 1
B. Prosedur Kerja .................................................................... 1
C. Alat dan Fungsinya ............................................................ 1
D. Perbesaran Total ................................................................. 5
E. Penggunaan Minyak Imersi ............................................... 5
BAB II TEKNIK LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
A. Tujuan .................................................................................. 7
B. Dasar Teori dan Prosedur Kerja ........................................ 7
C. Macam macam cara isolasi mikrobia ................................ 8
D. Teknik penanaman ............................................................. 11
E. Teknik penanaman dengan goresan ................................ 13
BAB III TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI
A. Pendahuluan ...................................................................... 26
B. Berbagai macam metode perwarnaan .............................. 26
BAB IV PEMERIKSAAN MORFOLOGI BAKTERI DAN
JAMUR
A. Pendahuluan ....................................................................... 37
BAB V PEMERIKSAAN FESES DAN DARAH
A. Pemeriksaan darah ............................................................ 44
BAB VI UJI KUALITAS MIKROBIOLOGI PANGAN
A. Dasar teori .......................................................................... 47
B. Alat dan bahan .................................................................... 49
C. Prosedur kerja ..................................................................... 49
D. Analisis data ........................................................................ 50
E. Diskusi ................................................................................ 51
BAB VII UJI KUALITAS MIKROBIOLOGI AIR
A. Tujuan ................................................................................. 53
B. Landasan teori .................................................................... 53
C. Prosedur kerja .................................................................... 63
D. Uji penetapan ( confirmed test ) ........................................ 64

iv
 E. Uji kelengkapan ( completed test ) .................................... 64
BAB VIII PEMBIAKAN JAMUR
A. Tujuan .................................................................................. 66
B. Dasar teori ........................................................................... 66
C. Prosedur kerja ..................................................................... 66
BAB IX IDENTIFIKASI JAMUR
A. Tujuan praktikum .............................................................. 68
B. Teori dasar .......................................................................... 68
C. Alat dan bahan ................................................................... 74
D. Cara kerja ............................................................................. 74
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................... 75

v
 DASAR-DASAR PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI

vi
 BAB I
PENGENALAN ALAT
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

A. Tujuan Praktikum
Mengenal bermacam-macam alat dalam laboratorium
Mikrobiologi beserta cara penggunaan yang benar.

B. Prosedur Kerja
Penjelasan mengenai cara kerja dan fungsi alat dalam
laboraotirum Mikrobiologi serta Simulasi/demo seluruh alat
tersebut.

C. Alat Dan Fungsinya

Beberapa alat yang perlu diketahui fungsinya adalah
sebagai berikut :
1. Kawat ose, digunakan untuk menanam mikroba dengan
cara goresan/streak, sebelum digunakan kawat ose harus
dipastikan steril dengan cara dipijar terlebih dahulu hingga
kawat memerah agar terhindar dari kontaminasi
mikroorganisme.
2. Microbiological Safety Cabinet (MSC) / Lemari Aseptis,
ruang/lemari steril yang digunakan sebagai ruang ketika
akan menanam mikroba. Ruang ini dilengkapi lampu UV
untuk meminimalisir kontaminasi bakteri agar dapat bekerja
secara aseptis.
3. Autoklaf, digunakan untuk sterilisasi alat/bahan/media
tertentu dengan menggunakan uap panas bertekanan (moist
heat). Alat yang dapat disterilkan dengan autoklaf adalah
alat yang terbuat dari kaca. Alat ini menggunakan suhu 121 o
C dengan tekanan 1 ATM.
4. Colony counter, untuk menghitung jumlah koloni mikroba
dalam suatu wadah yang berisi media pertumbuhan
mikroba tersebut. alat ini dilengkap dengan kaca pembesar
guna memudahkan saat perhitungan.

1
 5. Inkubator dan Waterbath incubator, digunakan untuk
inkubasi media yang telah ditanami mikroba yang
dilengkapi pengatur suhu guna menyesuaikan suhu
tumbuh untuk mikroba.
6. Lemari pendingin/refrigerator, digunakan untuk
menyimpan media steril yang siap pakai agar isi dan mutu
media tersebut tidak berubah, menyimpan untuk sementara
waktu bahan/spesimen yang belum sempat diperiksa agar
tidak mengalami perubahan dan menyimpan cakram
antibiotik/antibiotic diskyang belum dipakai agar tidak
mengalami perubahan. Alat ini juga digunakan untuk
menyimpan mikroba agar tidak terjadi pertumbuhan sel
atau bahkan tidak ada sel yang mati karena didalamnya sel
mikroba akan bersifat inaktif.
7. Mikroskop, digunakan untuk pemeriksaan suatu sediaan
secara mikroskopis.

Mikroskop Cahaya Salah satu alat untuk melihat sel

mikroba adalah mikroskop cahaya. Dengan mikroskop dapat
diamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata
telanjang. Pada umumnya, mata tidak mampu membedakan
benda dengan diameter lebih kecil 0,1 mm.
Berikut merupakan uraian tentang cara penggunaan,
bagian-bagian, dan spesifikasi mikroskop cahaya merek
Olympus CH20, sebagai contoh model mikroskop pada
praktikum ini (Gambar 1.1).

Bagian-Bagian Mikroskop
1. Eyepiece/oculars (lensa okuler), untuk memper-besar
bayangan yang dibentuk lensa objektif.
2. Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif), untuk memutar
objektif sehingga mengubah perbesaran.
3. Observation tube (tabung pengamatan/tabung okuler).
4. Stage (meja benda), untuk menempatkan spesimen.
5. Condenser (condenser), untuk mengumpulkan cahaya supa-
ya tertuju ke lensa objektif.

2
6. Objective lense (lensa objektif), untuk memperbesar
spesimen.
7. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu), untuk
memperbesar dan memperkecil cahaya lampu.
8. Main switch (tombol on-off).
9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter), untuk
menyamakan fokus antara mata kanan dan kiri.
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak
interpupillar).
11. Spesimen holder (penjepit spesimen), untuk menjepit
spesimen agar tidak bergerak/berubah tempat.
12. Illuminator (sumber cahaya).
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal), untuk menaik-
kan atau menurunkan object glass.
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal), untuk
menggeser ke kanan/kiri objek glass.
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar), untuk menaikturun-
kan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan
cepat.
16. Fine focus knob (sekrup fokus halus), untuk menaikturunkan
meja benda secara halus dan lambat.
17. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung
okuler).
18. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser),
untuk menaikturunkan kondenser. (Gambar 1.1)

3
 Prosedur Operasi
1. Menyalakan lampu
a. Tekan tombol on (8)
b. Atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7)
2. Menempatkan spesimen pada meja benda
a. Letakkan object glass di atas meja benda (4) kemudian
dijepit (11). Jika meja benda belum turun, diturunkan
dengan sekrup kasar (15)
b. Cari bagian dari object glass yang terdapat preparat ulas
(dicari dan diperkirakan memiliki gambar yang jelas)
dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal (13) dan
(14)
3. Memfokuskan
a. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif
4x lalu putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda
bergerak ke atas untuk mencari focus
b. Setelah fokus perbesaran 410 didapatkan maka putar (2)
pada perbesaran selanjutnya, yaitu perbesaran objektif
10x, kemudian putar sekrup halus (16) untuk
mendapatkan fokusnya
c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran
yang lebih tinggi (Gambar 1.2).

Berikut adalah tabel yang menunjukkan jarak antara

spesimen dengan lensa objektif jika fokus telah didapatkan:

4
 Catatan:
Setelah mendapatkan fokus pada perbesaran tertentu, misal 40x
dan ingin memutar objektif ke perbesaran 100x maka meja
benda tidak perlu diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa
lensa objektif akan  BIOL4445/MODUL 1 1.5 menggesek cover
glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil antara cover
glass dengan lensa objektif (lihat tabel di atas).

4. Tambahan
a. Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10)
dapat digeser, hal ini akan mengubah dua bayangan
yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar yang
tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi
kelelahan mata
b. Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur
untuk memperoleh bayangan fokus yang seimbang
antara mata kanan dan kiri
c. Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan
yang tampak dengan mensetting pada posisi tertinggi
(cahaya penuh)

D. Perbesaran Total
Ukuran spesimen yang diamati dapat diperoleh dengan
mengalikan perbesaran lensa okuler dengan lensa objektif.
Misal = Okuler (10x)  Objektif (40x) = 400x.

E. Penggunaan Minyak Imersi

Semakin kecil nilai daya pisah, akan semakin kuat
kemampuan lensa untuk memisahkan dua titik yang ber-
dekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat lebih
jelas. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan
indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang
gelombang (λ) pendek. Biasanya dapat digunakan minyak
imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran
10100 (Gambar 1.3).
1. Jika fokus pada perbesaran 1040 telah didapatkan maka
putar ke perbesaran objektif 100x

5
 2. Tetesi minyak imersi 1-2 tetes dari sisi lensa
3. Jika telah selesai menggunakan mikroskop, lensa objektif
100x dibersihkan dengan kertas lensa yang dibasahi xylol
(lihat Gambar berikut)

8. Alat-alat umum lain yang perlu diketahui di laboratorium

mikrobiologi : mikropipet, cawan petri, lampu spritus, kaca
obyek, kaca penutup, pinset, tabung Durham, tabung reaksi,
erlenmeyer, gelas ukur, becker glass, batang pengaduk,
corong.

6
 BAB II
TEKNIK LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI

A. Tujuan
1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang
dibutuhkan oleh suatu media untuk pertumbuhan mikroba.
2. Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi.
3. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis.
4. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.
5. Mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk
pengecatan/pewarnaan bakteri.
6. Mempelajari teknik-teknik lain dalam pengendalian
mikroorganisme

B. Dasar Teori Dan Prosedur Kerja

1. Media dan Cara Pembuatan Media
Media adalah suatu bahan yang digunakan untuk
menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi
atau zat-zat makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba,
media dapat juga digunakan untuk isolasi, memperbanyak,
pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah
mikroba.
Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba
adalah lingkungan kehidupannya harus sesuai dengan
lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan
makanannya (media 25harus mengandung air untuk
menjaga kelembaban dan untuk pertukaran
zat/metabolisme, juga mengandung sumber karbon,
mineral, vitamin dan gas), tekanan osmose yaitu harus
isotonik, derajat keasaman/pH umumnya netral tapi ada
juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan steril. Media
harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan
mikroba, yaitu: sumber energi (contoh: gula), sumber
nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang
khusus, seperti vitamin (Jawetz dkk, 1996).

7
 2. Alat dan bahan :
a. Macam-macam media sintetik, contoh : Media Nutrien
Agar (NA), Media Nutrien Broth (NB)
b. Aquades
c. Cawan petri
d. Tabung reaksi
e. Batang pengaduk, pipet volume, erlenmeyer
f. penangas/elemen pemanas
3. Cara kerja
a. Media ditimbang sesuai kebutuhan dan sesuai komposisi
dari masing-masing media yang digunakan
b. ditambahkan aquadest ke media yang telah ditimbang
dan dipanaskan hingga homogeny (menggunakan
batang pengaduk)
c. media disterilkan agar terbebas dari mikroba yang
mengkontaminasi pada saat penimbangan, penambahan
aquadest ataupun pemanasan, dengan menggunakan
autoklaf
d. Media cair dipindahkan ke wadah seperti tabung reaksi
dan biarkan dingin hingga siap untuk ditanami mikroba.
e. Media padat dipindahkan ke wadah tabung reaksi
ataupun cawan petri dan biarkan memadat hingga siap
untuk ditanami mikroba.
f. Pemindahakan mikroba dilakukan secara aseptic
didalam MSC.

C. Macam-Macam Cara Isolasi Mikrobia

1. Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
a. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian
disuspensikan dalam aquades steril. Tujuan dari teknik
ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan
mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih
mudah penanganannya. Macam-macam preparasi
bergantung kepada bentuk sampel :

8
1) Teknik Pengulasan (Swab),
Dilakukan menggunakan cotton bud steril pada
sampel yang memiliki permukaan luas dan pada
umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda
tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu
dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud
memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari
cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Ulas
akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih
dahulu ke dalam larutan attraktan (contoh pepton
water).
2) Pencucian
Ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba
yang menempel pada permukaan substrat yang luas
tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll.
Pencucian merupakan prosedur kerja dengan
mencelupkan sampel ke dalam aquadest dengan
perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun
diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan
aquades 45 ml. Selanjutnya air cucian diinokulasikan
pada media yang telah disiapkan. Amati pertumbu-
han mikrobia yang terjadi pada media setelah diino-
kulasikan selama 3 sampai 7 hari di ruang dengan
suhu kamar.
3) Penghancuran (Maserasi),
Sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk
dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada
dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian
dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar lain
biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel
dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v).
Untuk sampel dari tanah tidak perlu dimaserasi.
Hasil maserasi selanjutnya di inokulasikan pada
media yang telah dsiapkan. Selanjutnya inkubasikan
cawan petri yang telah diinokulasikan tersebut pada

9
 suhu ruang. Setelah 3 sampai 7 hari masa inkubasi,
amati mikrobia yang tumbuh pada media tersebut.
4) Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu
memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang
tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau
banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada
perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan
perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran
pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran
berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma
dari pengenceran sebelumnya.

2. Cara Kerja :
a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam
tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara
aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat
sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan
aquades yang digunakan jika memakai teknik pencucian
dan pengolesan sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah
sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya
sampai homogen.
b. Ambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian
dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian
dikocok dengan membenturkan tabung ketelapak tangan
sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga
tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal
yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan
harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran
digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru.
Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika
memindahkan cairan dari sumber yang sama.

10
 Gambar 6. Teknik pengenceran bertingkat

D. Teknik Penanaman
1. Penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari
pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat
diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk
tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil
beberapa tabung pengenceran terakhir.

Gambar 7. Pengenceran bertingkat dan penanaman

11
 2. Agar Tuang (Pour plate)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat
(>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam
cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan
memadat. Cara ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak
hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam
agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh
dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di
dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung
oksigen.Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah
sebagai berikut : Siapkan cawan steril, tabung pengenceran
yang akan ditanam dan media padat yang masih cair ,
teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan
kosong, tuangkan media yang masih cair ke cawan
kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi
bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
3. Agar tabur ( Spread Plate)
Spread plate adalah teknik menanam dengan
menyebarkan suspense bakteri di permukaan agar diperoleh
kultur murni.Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan
adalah sebagai berikut : ambil suspensi cairan sebanyak 0,1
ml dengan pipet kemudian teteskan diatas permukaan agar
yang telah memadat. Kemudian disebarkan dengan meng-
gunakan batang L yang telah disterilkan terlebih dahulu
pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata.

Gambar 8. Agar Tuang dan Agar Tabur

12
E. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari
campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium
baru.
1. Goresan Sinambung
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan
untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk
peremajaan ke cawan atau medium baru
Cara kerja :
Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores
secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Putar
cawan 180 0 lanjutkan goresan sampai habis.

Gambar 8. Inokulasi secara goresan sinambung

2. Goresan T
Cara kerja :
Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol
marker, inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag. Panaskan
jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan
streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan
diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna.
Lakukan hal yang sama pada daerah 3.

13