AKTIVITAS ANTIPATOGEN BAKTERI ASAL LIMBAH AIR

TAMBANG BATUBARA TENGGARONG KALIMANTAN TIMUR

TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus ATCC 25923 DAN
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 DENGAN METODE DIFUSI AGAR
PLUG

Proposal Penelitian

Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Sarjana S-1

Diajukan oleh :

Dinny Fitriani
20144076A

HALAMAN JUDUL

Kepada
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SETIA BUDI
SURAKARTA
Desember 2017

i
 HALAMAN PENGESAHAN
PROPOSAL PENELITIAN

Sesuai dengan hasil seminar Pra Proposal Penelitian, maka telah dilakukan
perbaikan pada aspek substansial, metodologik, dan tata cara penulisan proposal
penelitian.
Atas dasar hal tersebut, maka Pra Proposal

Dengan judul :

AKTIVITAS ANTIPATOGEN BAKTERI ASAL LIMBAH AIR

TAMBANG BATUBARA TENGGARONG KALIMANTAN TIMUR
TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 DENGAN METODE DIFUSI AGAR PLUG

yang disusun oleh peserta program :

Nama : Dinny Fitriani
NIM : 20144076A

Disyahkan sebagai Proposal Penelitian

Yang digunakan sebagai dasar penelitian lapangan,
Sebagai bahan penyusunan skripsi

Surakarta, 2017

Pembimbing Utama Pembimbing Pendamping

Dr. Ana Indrayati., M.Si D. Andang Arif Wibawa, S.P.,M.Si

ii
 DAFTAR ISI
Halaman

HALAMAN JUDUL.................................................................................................i

HALAMAN PENGESAHAN.................................................................................ii

DAFTAR ISI...........................................................................................................iii

DAFTAR GAMBAR..............................................................................................vi

DAFTAR TABEL..................................................................................................vii

BAB I PENDAHULUAN...................................................................................1
A. Latar Belakang.................................................................................1
B. Rumusan Masalah............................................................................3
C. Tujuan Penelitian..............................................................................3
D. Kegunaan Penelitian.........................................................................3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA..........................................................................4

A. Pertambangan Batu Bara..................................................................4
B. Air Limbah Batu Bara......................................................................4
C. Dampak Positif dan Negatif Penambangan Batubara......................6
1. Dampak positif..........................................................................6
2. Dampak negatif.........................................................................6
D. Klasifikasi Bakteri............................................................................6
E. Karakteristik Mikroba......................................................................8
1. Sistematika Pseudomonas aeruginosa......................................8
2. Morfologi dan Sifat...................................................................8
3. Patogenesis................................................................................9
4. Sistematika Staphylococcus aureus..........................................9
5. Morfologi dan Sifat...................................................................9
6. Patogenesis..............................................................................11
F. Antagonis Mikroba.........................................................................11
G. Uji Aktivitas Anti Mikroba............................................................12
1. Metode Difusi..........................................................................12
1.1 Metode disc diffusion (tes Kirby & Bauer).......................12
1.2 E-test Metode....................................................................12
1.3 Ditch-plate technique........................................................12
1.4 Cup-plate technique..........................................................12
2. Metode Dilusi..........................................................................12
2.1 Metode dilusi cair/ broth dilution test (serial dilution).....13
2.2 Metode dilusi padat/ solid dilution test.............................13
H. Metode Isolasi................................................................................13
1. Metode cawan gores................................................................13
2. Metode cawan tuang................................................................14

iii
 I. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM).........................................14
J. Media..............................................................................................15
1. Definisi....................................................................................15
2. Bentuk.....................................................................................15
2.1 Media padat.......................................................................15
2.2 Media cair..........................................................................15
2.3 Media semi padat atau semi cair.......................................15
3. Komposisi................................................................................16
3.1 Media Alami......................................................................16
3.2 Media sintesis atau sintetik...............................................16
3.3 Media semi sintetis............................................................16
4. Sifat.........................................................................................17
4.1 Media umum.....................................................................17
4.2 Media pengaya..................................................................17
4.3 Media.................................................................................17
4.4 Media penguji....................................................................17
4.5 Media selektif....................................................................17
4.6 Media perhitungan.............................................................17
5. Medium yang Digunakan dalam Penelitian............................17
5.1 Brain Heart Infusion (BHI)...............................................17
5.2 Mueller Hinton Agar (MHA)............................................18
5.3 Sulfide Indol Motility (SIM)..............................................18
5.4 Lysine Iron Agar (LIA).....................................................19
5.5 Kligler Iron Agar (KIA)....................................................20
5.6 Sitrat..................................................................................20
K. Metode Uji Aktivitas......................................................................21
L. Sterilisasi........................................................................................21
M. Landasan Teori...............................................................................22
N. Hipotesis.........................................................................................24

BAB III METODE PENELITIAN......................................................................25

A. Populasi dan Sampel......................................................................25
B. Variabel Penelitian.........................................................................25
1. Identifikasi variabel utama......................................................25
2. Klasifikasi variabel utama.......................................................25
3. Definisi operasional variabel utama........................................26
C. Bahan dan Alat...............................................................................26
1. Bahan.......................................................................................26
1.1. Bahan sampel.................................................................26
1.3. Media.............................................................................27
2. Alat..........................................................................................27
D. Jalannya Penelitian.........................................................................27
1. Sterilisasi.................................................................................27
2. Isolasi Bakteri Dari Air Limbah Tambang..............................27
3. Identifikasi Bakteri dari air limbah tambang batubara............28
3.1 Pengamatan Morfologi Koloni.......................................28

iv
 3.2 Pewarnaan Gram.............................................................28
3.3 Uji Biokimia....................................................................28
4. Identifikasi Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.................................29
4.1 Identifikasi makroskopis...................................................29
4.2 Identifikasi mikroskopis secara morfologi........................29
4.3 Identifikasi Fisiologis Biokimia........................................30
5. Pembuatan suspensi bakteri uji...............................................31
6. Uji Antipatogen Air Limbah Batubara Terhadap bakteri
Staphylococcus aureus ATCC dan Pseudomonas 25923
aeruginosa ATCC 27853........................................................31
7. Analisis hasil...........................................................................32
E. Skema Jalannya Penelitian.............................................................33
F. Jadwal Penelitian............................................................................34

DAFTAR PUSTAKA............................................................................................35

v
 DAFTAR GAMBAR
Halaman

Gambar 1. Skema jalannya penelitian secara sistematis........................................33

vi
 DAFTAR TABEL
Halaman

Tabel 1. Jadwal kegiatan penelitian.......................................................................34

vii
 BAB I
PENDAHULUAN

1. Latar Belakang
Penyakit infeksi merupakan salah satu penyakit yang menyerang manusia
yang disebabkan oleh berbagai macam mikroba patogen, salah satunya bakteri.
Penyakit infeksi ini ditanggulangi menggunakan antibiotika. Penggunaan
antibiotika yang berlebihan dewasa ini, dapat menyebabkan berbagai macam
masalah, salah satunya yaitu timbulnya resistensi terhadap sebagian besar bakteri
patogen yang ada (WHO 2014).
Penyakit infeksi merupakan penyebab tingginya angka kesakitan dan
kematian di dunia. Salah satu jenis penyakit infeksi adalah infeksi nosokomial.
Infeksi ini menyebabkan 1,4 juta kematian setiap hari di seluruh dunia (WHO
2005).
Sebuah penelitian dilakukan pada bulan Oktober – Desember 2011 di
ruang Rawat Inap bagian Bidan dan Kebidanan RSUD Abdul Muluk Bandar
Lampung, didapatkan bakteri penyebab infeksi sesuai urutan sebagai berikut
Pseudomonas sp. 25%, Staphylococcus auerus 8,32%. (Samuel 2013).
Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri penyebab infeksi,
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat
berdiameter 0,7-1,2 μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur
seperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak
bergerak. (Jawetz et al. 2008).
Ciri khas infeksi yang disebabkan oleh S. aureus adalah radang supuratif
(bernanah) pada jaringan lokal dan cenderung menjadi abses. Manifestasi klinis
yang paling sering ditemukan adalah furunkel pada kulit dan impetigo pada anak-
anak. Infeksi superfisial ini dapat menyebar (metastatik) ke jaringan yang lebih
dalam menimbulkan osteomielitis, artritis, endokarditis dan abses pada otak, paru
paru, ginjal serta kelenjar mammae. Pneumonia yang disebabkan S. aureus sering
merupakan suatu infeksi sekunder setelah infeksi virus influenza. S. aureus
dikenal sebagai bakteri yang paling sering mengkontaminasi luka pasca bedah

1
 2

sehingga menimbulkan komplikasi. Sumber pencemaran pada infeksi pascabedah

ini diantaranya berasal dari penderita carrier yaitu dokter, perawat atau petugas
kesehatan yang terlibat dalam perawatan dan pembedahan pasien dan peralatan
medis yang terkontaminasi. Bila terjadi bakteriemia, infeksi dapat bermetastasis
ke berbagai organ (De Leo et.al 2009).
Bakteri penyebab infeksi lainnya adalah Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas aeruginosa termasuk bakteri Gram negatif, bersifat aerob dan
memiliki bentuk batang (Todar 2012). Pseudomonas aeruginosa merupakan
bakteri patogen penyebab cystic fibrosis dan pneumonia. Bakteri ini juga dapat
menyebabkan infeksi pada luka dan luka bakar, infeksi pada mata, serta infeksi
saluran kemih. Jumlah infeksi yang disebabkan oleh P. aeruginosa jauh melebihi
total jumlah infeksi yang disebabkan oleh spesies lain dalam genus Pseudomonas
(Todar 2012).
Produk alami mikroba masih muncul sebagai sumber antibiotik masa
depan yang paling menjanjikan yang diharapkan masyarakat . Obat antibiotik
diproduksi oleh bakteri, jamur, actinomycetes, alga, lumut dan tanaman hijau.
Karena isolasi aktinomisin dan streptomisin, aktinomisetes telah mendapat
perhatian yang luar biasa. Anggota streptomyces adalah sumber senyawa bioaktif
yang kaya, terutama antibiotik, enzim, penghambat enzim dan agen yang aktif
secara farmakologi dan sekitar 75% antibiotik komersial dan medis yang
diketahui diproduksi oleh streptomyces. Actinomycetes terjadi dalam jumlah
besar di tanah dan memiliki kemampuan untuk mengendalikan mikroorganisme
dengan memproduksi zat antibiotik (Gopinath et.al 2013).
Berdasarkan besarnya kemampuan aktivitas actinomycetes dalam
mengendalikan mikroorganisme maka dalam aktivitas pertambangan batubara
umumnya terkait dengan Air Asam Tambang (AAT) atau Acid Mine Drainage
(AMD) adalah air yang bersifat asam (tingkat keasaman tinggi). Air ini terjadi
akibat pengaruh oksidasi alamiah mineral sulfida (mineral belerang) yang
terkandung dalam batuan yang terpapar selama penambangan. Bakteri
Thiobacillus ferooksidans dan Ferrobacillus ferrooxidan secara alami akan
berkembang di dalam air asam tambang yang berperan sebagai katalis
 3

pembentukan air asam tambang tersebut. Air tersebut terbentuk sebagai hasil
oksidasi mineral sulfida tertentu yang terkandung dalam batuan oleh oksigen di
udara pada lingkungan berair. Maka dari bakteri yang ada didalam limbah air
batubara diharapkan mengandung bakteri yang memiliki senyawa aktif yang dapat
berpotensi sebagai anti biotika ataupun antipatogen (Sayoga 2007).

2. Rumusan Masalah
Pertama, apakah terdapat bakteri yang berasal dari air limbah tambang
batubara dengan metode isolasi dan identifikasi bakteri?
Kedua, apakah bakteri yang terdapat dari air limbah tambang batubara
memiliki daya aktivitas sebagai antipatogen terhadap bakteri Staphylocccus
aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dengan metode
agar plug difusi?

3. Tujuan Penelitian
Pertama, untuk mengetahui apakah dalam air limbah tambang batubara
terdapat bakteri dengan metode isolasi dan identifikasi bakteri
Kedua, untuk mengetahui apakah bakteri yang terdapat dalam limbah air
batubara memiliki daya aktivitas sebagai antipatogen terhdap bakteri yang
memiliki menghasilkan senyawa antipatogen terhadap Staphylocccus aureus
ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dengan metode agar
plug difusi

4. Kegunaan Penelitian
Dari penelitian ini diharapkan dapat memperoleh bakteri yang
menhasilkan senyawa antipatogen terhadap bakteri Staphylocccus aureus ATCC
25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Pertambangan Batu Bara

Pertambangan batubara adalah pertambangan endapan karbon yang
terdapat di dalam bumi. Tujuan pengelolaan batubara adalah menjamin efektivitas
pelaksanaan dan pengendalian kegiatan usaha pertambangan secara berdaya
guna , menjamin manfaat pertambangan batubara secara berkelanjutan dan
berwawasan lingkungan hidup serta menjamin tersedianya batubara sebagai bahan
baku atau sumber energi untuk kebutuhan dalam negeri dalam rangka mendukung
pembangunan nasional yang yang berkesinambungan (UU No.4 Tahun 2009).
Penguasaan bahan galian terdapat dalam wilayah Hukum Pertambangan
Indonesia yang merupakan endapan-endapan alam sebagai karunia Tuhan Yang
Maha Esa, adalah kekayaan Nasional bangsa Indonesia dan oleh karenanya
dikuasai dan dipergunakan oleh Negara untuk sebesar-besar kemakmuran rakyat.
Bahan galian dari penambangan berupa unsur-unsur kimia, mineral-mineral, dan
segala macam batuan termasuk batu-batu mulia, yang merupakan endapan-
endapan alam. Wilayah Hukum Pertambangan Indonesia mencakup seluruh
kepulauan Indonesia, tanah dibawah perairan Indonesia dan paparan benua
kepulauan Indonesia. Wewenang atas kuasa pertambangan diberikan kepada
Badan/Perseorangan untuk melaksanakan usaha pertambangan (UU Pokok
Pertambangan Tahun 1967).

2. Air Limbah Batu Bara

Air limbah usaha dan atau kegiatan pertambangan batu bara adalah air
yang berasal dari kegiatan penambangan batu bara yang meliputi penggalian,
pengangkutan dan penimbunan baik pada tambang terbuka maupun tambang
bawah tanah. Baku mutu air limbah batu bara adalah ukuran batas atau kadar
unsur pencemar dan atau jumlah unsur pencemaran yang ditenggang
keberadaannya dalam air limbah batu bara yang akan dibuang atau dilepas ke air

4
 5

permukaan. Parameter yang dimonitoring pada air limbah kegiatan penambangan

batubara adalah TSS, total Fe dan total Mn (KepMenLH no.113/2003).
Titik penaatan (point of compliance) adalah satu atau lebih lokasi yang
dijadikan acuan untuk pemantauan dalam rangka penaatan baku mutu air limbah.
Apabila baku mutu air limbah batubara terlampaui karena keadaan tertentu dan
atau kondisi cuaca tertentu maka penanggung jawab usaha dan atau kegiatan
wajib melaporkan dan menyampaikan kegiatan penanggulangan pencemaran
kepada Bupati/Walikota dengan tembusan kepada Gubernur dan Menteri
(KepMenLH no.113/2003).
Baku mutu air limbah bagi usaha dan atau kegiatan pertambangan
batubara ditetapkan dengan Peraturan Daerah Provinsi. Apabila baku mutu air
limbah belum ditetapkan, maka berlaku baku mutu air limbah batubara
sebagaimana tersebut dalam keputusan undang-undang. Apabila hasil kajian
Analisis Mengenai Dampak Lingkungan hidup (AMDAL) atau hasil kajian Upaya
Pengelolaan Lingkungan (UKL) dan Upaya Pemantauan Lingkungan (UPL) dari
usaha dan atau kegiatan pertambangan batubara mensyaratkan baku mutu air
limbah lebih ketat dari baku mutu air limbah maka diberlakukan baku mutu air
limbah sebagaimana yang dipersyaratkan oleh AMDAL atau UKL dan UPL
(KepMenLH no.113/2003).
Setiap penanggung jawab usaha dan atau kegiatan pertambangan wajib
melakukan pengolahan air limbah yang berasal dari kegiatan penambangan dan
air limbah yang berasal dari kegiatan pengolahan/pencucian, sehingga mutu air
limbah yang dibuang ke lingkungan tidak melampaui baku mutu air limbah.
Setiap penanggung jawab usaha dan atau kegiatan pertambangan batubara wajib
mengelola air yang terkena dampak dari kegiatan penambangan melalui kolam
pengendapan (pond). Penanggung jawab usaha dan atau kegiatan pertambangan
batubara wajib melakukan kajian lokasi titik penaatan (point of compliance) air
limbah dari kegiatan pertambangan (KepMenLH no.113/2003).
Lokasi titik penaatan (point of compliance) harus berada pada saluran air
limbah yang ke luar dari kolam pengendapan (pond) air limbah sebelum dibuang
ke air permukaan dan tidak terkena pengaruh dari kegiatan lain dan atau sumber
 6

air lain selain dari kegiatan penambangan tersebut atau keluar dari unit pengelola
air limbah dari proses pengolahan/pencucian batubara sebelum dibuang ke air
permukaan dan tidak terkena pengaruh dari kegiatan lain dan atau sumber air lain
selain dari kegiatan pengolahan tersebut (KepMenLH no.113/2003).

3. Dampak Positif dan Negatif Penambangan Batubara

4. Dampak positif
Adapun dampak positif dari pertambangan batubara adalah pembukaan
lapangan kerja, meningkatkan taraf hidup masyarakat sekitar, penyokong devisa
negara, memanfaatkan potensi wilayah yang dimiliki oleh daerah, meningkatkan
pendapatan daerah (Djajadiningrat, 2007).
5. Dampak negatif
Adapun dampak negati dari pertambangan batubara adalah pencemaran air
yang diakibatkan kontaminasi dengan limbah hasil sisa dari kegiatan
pertambangan, pencemaran udara karena tercemar oleh gas hasil buangan dari
kegiatan pertambangan, maupun polusi suara karena kegiatan pertambangan
seperti (blasting) ataupun truk pengangkut barang tambang. Kerusakan jalan yang
disebabkan oleh kegiatan pertambangan baik pengangkutan keperluan
pertambangan seperti alat berat maupun kebutuhan bahan bakar juga turut
memberikan dampak negatif terhadap kondisi fisik di daerah pertambangan.
Dampak kondisi fisik merupakan dampak yang ditimbulkan oleh adanya aktivitas
pertambangan pada kondisi pencemaran pada air, udara, polusi suara, kerusakan
jalan dan pembukaan hutan di sekitar wilayah pertambangan (Pertiwi, 2011).

6. Klasifikasi Bakteri
Bakteri rata-rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10
mikron (1 mikron = 10-3 mm). Bakteri termasuk mikroorganisme yang sangat
kecil. Sehingga, untuk melihat bakteri perlu diwarnai, pewarnaan ini disebut
pengecatan bakteri (Irianto, 2006). Pengecatan bakteri sudah dilakukan sejak
permulaan berkembangnya mikrobiologi di pertengahan abad ke–19 oleh Louis
Pasteur dan Robert Koch. Pada umumnya, ada dua macam zat warna (bahan cat)
 7

yang sering dipakai, yaitu zat warna yang bersifat asam komponen warnanya
adalah anion, biasanya dalam bentuk garam natrium. Zat warna yang bersifat
alkalis dengan komponen warna kation, biasanya dalam bentuk klorida. Setelah
dilakukan pengecatan, dalam tubuh bakteri akan terjadi proses pertukaran ion-
ion zat warna dengan ion-ion protoplasma (misalnya asam nukleat) bakteri. Pada
umumnya, larutan-larutan zat warna yang digunakan adalah larutan encer, jarang
lebih dari 1 persen. Larutan encer yang dibiarkan berkontak agak lama dengan
bakteri bekerja lebih baik dari larutan pekat dengan waktu yang singkat (Irianto,
2006). Untuk mendapatkan hasil pengecatan yang lebih baik, tidak jarang
dibutuhkan bahan penolong, yang biasanya disebut pemantek (mordant).
Pemantek ini dapat diartikan sebagai suatu zat yang sanggup bergabung dengan
komponen zat warna tertentu, sehingga terbentuk senyawa yang tidak dapat larut
dan melekat pada tubuh bakteri. Pemantek dapat diberikan dalam berbagai
keadaan yaitu sebelum penambahan bahan cat, dimasukkan ke dalam larutan
bahan cat, dan diberikan antara pemakaian dua larutan bahan cat (Irianto, 2006).
Untuk memahami beberapa kelompok organisme, diperlukan klasifikasi.
Uji biokimia, pewarnaan Gram, merupakan kriteria yang efektif untuk klasifikasi.
Hasil perwanaan mencerminkan perbedaan dasar dan kompleks pada permukaan
sel bakteri, sehingga dapat terbagi menjadi 2 kelompok, yakni Gram positif dan
Gram negatif (Jawetz, 2004). Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan
pemberian warna basa, crystal violet. Semua bakteri akan terwarnai menjadi biru
pada fase ini kemudian dicuci dengan air. Larutan iodin kemudian ditambahkan,
dicuci kembali dengan air dan dilanjutkan dengan pemberian alkohol. Sel Gram
positif akan tetap mengikat senyawa crystal violet-iodine, tetap berwarna biru. Sel
Gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir,
counterstain (misalnya safranin bewarna merah) ditambahkan, sehingga Gram
negatif yang tidak berwarna akan mengambil warna merah, sedangkan sel Gram
positif terlihat sebagai warna biru (Jawetz, 2004).
 8

7. Karakteristik Mikroba
1. Sistematika Pseudomonas aeruginosa
Kingdom : Bacteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Ordo : Pseudomonadales
Famili : Pseudomanaceae
Genus : Pseudomonas
Spesies: : Pseudomonas aeruginosa (Garrity dkk, 2004)
2. Morfologi dan Sifat
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri berbentuk batang dan motil,
berukuran sekitar 0,6-2 μm. Bakteri ini bersifat Gram negatif dan tampak dalam
bentuk tunggal, berpasangan, dan kadang-kadang rantai pendek. Pseudomonas
aeruginosa merupakan bakteri obligat aerob yang mudah tumbuh pada berbagai
medium kultur, kadang-kadang menghasilkan aroma yang manis atau berbau,
seperti anggur atau jagung taco. Beberapa galur menghemolisis darah (Jawetz,
2014).
Pseudomonas aeruginosa membentuk koloni yang bundar dan licin
dengan warna kehijauan yang berflourosensi. Bakteri ini sering menghasilkan
pigmen kebiruan tak berflourosensi, piosianin yang berdifusi ke dalam agar.
Banyak galur Pseudomonas aeruginosa juga menghasilkan pigmen
berflourosensi, pioverdin yang memberikan warna kehijauan pada agar. Beberapa
galur menghasilkan pigmen merah gelap, piorubin, atau pigmen hitam,
piomelanin (Jawetz, 2014).
Pseudomonas aeruginosa dalam kultur dapat membentuk berbagai tipe
koloni. Pseudomonas aeruginosa dari tipe koloni yang beda kemungkinan
memiliki aktivitas biokimia dan enzim yang berbeda, serta pola sensitivitas yang
berbeda terhadap antimikroba (Jawetz, 2014)
Pseudomonas aeruginosa tumbuh dengan baik pada suhu 37-42◦C,
kemampuannya untuk tumbuh pada suhu 42◦C membantu membedakannya dari
spesies Pseudomonas lain dari grup flourosens. Bakteri tersebut bersifat oksidase
 9

positif. Pseudomonas aeruginosa tidak memfermentasi karbohidrat, tetapi banyak

galur yang mengoksidasi glukosa. Pseudomonas aeruginosa biasanya didasarkan
pada morfologi koloni, kepositifan oksidase, adanya pigmen khas, dan
pertumbuhan pada suhu 42◦C (Jawetz, 2014).
3. Patogenesis
Pseudomonas aeruginosa menjadi patogenik hanya jika mencapai daerah
yang tidak memiliki pertahanan normal, misalnya membran mukosa dan kulit
yang terluka oleh cedera jaringan langsung, saat menggunkan kateter urin, atau
jika terdapat neutropenia, seperti pada kemoterapi kanker. Bakteri melekat dan
membentuk koloni pada membran mukosa atau kulit, menginvasi secara lokal,
dan menyebabkan penyakit sistemik. Proses tadi dibantu oleh pili, enzim, dan
toksin. Pseudomonas aeruginosa resisten terhadap banyak obat antimikroba
sehingga bakteri ini menjadi dominan dan penting ketika flora normal yang lebih
sensitif tertekan (Jawetz, 2014)
4. Sistematika Staphylococcus aureus
Kingdom : Bacteria
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacili
Ordo : Bacillales
Famili : Staphylococcaceae
Genus : Staphylococcus
Spesies: : Staphylococcus aureus (Garrity dkk, 2004)
5. Morfologi dan Sifat
Staphylococcus aureus adalah bakteri kokus sel Gram positif yang tidak
membentuk spora, tidak motil, berbentuk bulat, biasanya tersusun rangkaian tak
beraturan seperti anggur, ukuran dari bakteri ini adalah berdiameter 0,8-1 mikron.
Staphylococcus mudah tumbuh pada berbagai pembenihan dan mempunyai
metabolisme aktif serta menghasilkan pigmen yang bervariasi dari putih sampai
kuning tua (Brooks et al 2007).
Staphylococcus aureus lebih patogen dan invasif dibandingkan spesies
Staphylococcus lainnya karena Staphylococcus aureus mampu memproduksi
 10

enzim koagulase, sehingga dengan enzim ini Staphylococcus aureus dapat

merubah fibrinogen menjadi fibrin yang kemudian akan menggumpalkan darah
(Shodikin et al 2006).
Staphylococcus aureus normal terdapat pada kulit, mulut, tenggorokan,
dan hidung manusia. Staphylococcus aureus dapat masuk kedalam tubuh melalui
kerusakan kulit atau melalui rusaknya folikel rambut dan saluran pada jaringan
penghasil keringat. Selain dapat menyebabkan intoksikasi, Staphylococcus aureus
juga dapat menyebabkan bermacam-macam infeksi seperti jerawat, bisul,
meningitis, oesteomielitis, pneumonia dan mastitis pada manusia dan hewan
(Jawetz et al. 2001). Staphylococcus aureus mengandung antigenik, protein A,
dan substensi lainnya didalam struktur selnya. Polisakarida A ini merupakan
komponen dinding sel bakteri yang tersusun oleh kompleks peptidoglikan asam
teikolat dan dapat menghambat fagositosis (Kumar et al 2005).
Staphylococcus aureus mempunyai warna khas kuning keemasan hanya
intensitas warnaya dapat bervariasi, koloni yang masih sangat muda tidak
berwarna, tetapi dalam pertumbuhannya terbentuk pigmen yang larut dalam
alkohol, eter, klorofrom, dan benzol. Pigmen ini termasuk dalam golongan
lipolirum dengan alam tetap dalam koloni tidak meresap dalam pembenihan,
tetapi larut dalam eksudat jaringan-jaringan sehingga nanah berwarna sedikit
kuning keemasan yang merupakan petunjuk tentang adanya infeksi oleh kuman
ini. Setiap jaringan atau alat tubuh dapat diinfeksi oleh bakteri Staphylococcus
aureus dan menyebabkan timbulnya penyakit dengan tanda-tanda khas yaitu
peradangan dan pembentukan abses (Jawetz et al, 2001).
Staphylococcus mampu mengkode enzim β-lactam dari antibiotik yang
dapat memediasi terjadinya resistensi terhadap beberapa antibiotik yaitu golongan
penisilin, metisilin, kuinolon, dan vankomisisn. Pembentukannya diatur oleh
plasmid yang dapat dipindahkan oleh bakteriofage (transduksi). Plasmid juga
membawa kontrol genetik resistensi terhadap antibiotik lainya, misalnya
tetrasiklin dan eritromisin. Staphylococcus aureus tumbuh dengan mudah pada
sebagia besar media bakteriologis dengan kondisi aerob atau mikroaerofilik,
tumbuh paling cepat pada 37oC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada
 11

temperatur ruang (20-25oC). Koloni pada media solid berbentuk bulat, halus,
timbul, dan mengkilat (Jawetz et al. 2012).
6. Patogenesis
Staphylococcus aureus merupakan penyebab infeksi yang bersifat
pyogenes (pembentuk pus/nanah). Bakteri ini masuk kedalam tubuh melalui
folikel rambut, sebaceous gland (kelenjar keringat) atau luka-luka kecil.
Staphylococcus aureus patogen mempunya sifat dapat menghemolisa darah,
menghasilkan koagulasi, membentuk pigmen berwarna kuning emas, dan dapat
memecah manitol menjadi asam. Infeksi yang ditimbulkan oleh Staphylococcus
aureus dapat meluas kejaringan sekitarnya melalui darah dan limfe. Pernanahan
yang bersifat menahun atau timbul radang yang disebut osteomyelitis. Perluasan
lain juga dapat sampai ke paru-paru, selaput otak dan sebagainya (Suryono 2009).
Staphylococcus aureus terdapat di hidung pada 20-50% manusia.
Kapasitas patogenik suatu galur Staphylococcus aureus adalah efek kombinasi
faktor ekstraseluler dan toksin bersama dengan sifat invasif galur itu.
Staphylococcus aureus yang invasif dan patogenik menghasilkan koagulase dan
cenderung menghasilkan pigmen kuning serta bersifat hemolitik. Sekitar 50%
galur Staphylococcus aureus dapat menghasilkan satu atau lebih jenis
enterotoksin, seperti TSST-1, enterotoksin merupakan antigen super. Enterotoksin
bersifat stabil panas dan resisten terhadap kerja enzim usus (Jawetz et al. 2012).

7. Antagonis Mikroba
Salah satu hubungan interaksi dalam suatu lingkungan yang kompleks
yang berisi berbagai macam organisme. Aktivitas metabolisme suatu organisme
akan berpengaruh terhadap lingkungannya. Mikroorganisme seperti halnya
organisme lain yang berada dalam lingkungan yang kompleks senantiasa
berhubungan dengan pengaruh faktor biotik dan faktor biotik, salah satunya
adalah sifat antagonisme. Antagonisme dapat terjadi antara mikroba yang bersifat
menguntungkan dan mikroba yang bersifat patogen ( Kusnadi, 2003). Mikroba
antagonis merupakan suatu jasad renik yang dapat menekan, menghambat, dan
 12

memusnahkan mikroba lainnya. Mikroba antagonis dapat berupa bakteri, jamur

atau cendawan, actinomycetes, bahkan virus ( Kusnadi, 2003)

8. Uji Aktivitas Anti Mikroba

1. Metode Difusi
1.1 Metode disc diffusion (tes Kirby & Bauer). Metode ini untuk
menentukan aktivitas agen antimikroba. Kertas cakram yang berisi agen
antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme
yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan
adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada
permukaan media agar (Pratiwi, 2008).
1.2 E-test Metode. E-test digunakan untuk menentukan Minimum
Inhibitory Concentration (MIC) atau Konsentrai Hambat Minimum (KHM), yaitu
konsentrasi miminal suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat
pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip plastik yang
mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga kadar tertinggi dan
digerakkan pada permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme.
Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan
kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada
media agar (Pratiwi, 2008).
1.3 Ditch-plate technique. Pada metode ini sampel uji berupa agen
antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media
agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji
(maksimum 6 macam) digoreskan ea rah parit yang berisi agen antimikroba
(Pratiwi, 2008).
1.4 Cup-plate technique. Metode ini serupa dengan metode disc diffusion,
yaitu dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme
dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji (Pratiwi, 2008).
2. Metode Dilusi
Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan
dilusi padat (solid dilution).
 13

2.1 Metode dilusi cair/ broth dilution test (serial dilution). Metode ini
mengukur Minimum Inhibitory Concentration (MIC) atau Konsentrasi Hambat
Minimum (KHM) dan Minimum Bactericidal Concentration (MBC) atau Kadar
Bunuh Minimum (KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri
pengenceran agen antimikroba pada media cair yang ditambahkan dengan
mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih
tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang
ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair
tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama
18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan
sebagai KBM (Pratiwi, 2008).
2.2 Metode dilusi padat/ solid dilution test. Metode ini serupa dengan

metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Metode dilusi cair
adalah metode untuk menentukan konsentrasi minimal dari suatu antibakteri yang
dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme (Pratiwi, 2008). Pada
prinsipnya antibakteri diencerkan sampai diperoleh beberapa konsentrasi. Pada
dilusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi kuman dalam
media. Sedangkan pada dilusi padat tiap konsentrasi obat dicampur dengan media
agar, kemudian ditanami bakteri (Anonim, 1994).

3. Metode Isolasi
Menurut Hadioetomo (1985), isolasi yang sering digunakan untuk
memperoleh bakteri ataupun biakan murni menggunakan metode sebagai berikut:
1. Metode cawan gores
Metode ini memiliki keuntungan menghemat bahan dan waktu tetapi
untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan ketrampilan dan pengalaman.
Teknik menggores yang baik bisa dilakukan pada suatu area tertentu dalam
permukaan medium yang telah digores, maka sel-sel bakteri akan terpisah satu
dengan yang lainnya (Hadioetomo, 1985).
 14

2. Metode cawan tuang

Metode ini dilakukan dengan cara memperoleh koloni murni dari populasi
dengan pengenceran spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan
didinginkan kemudian diletakkan di cawan petri. Metode ini memboroskan bahan
dan waktu tetapi tidak memerlukan ketrampilan yang lama (Hadioetomo, 1985).

3. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

Konsentrasi hambatan minimum adalah konsentrasi antibiotika terendah
yang masih dapat menghambat pertumbuhan organisme tertentu. KHM dapat
ditentukan dengan prosedur tabung dilusi, prosedur ini digunakan untuk
menentukan konsentrasi antibiotik yang masih efektif untuk mencegah
pertumbuhan patogen dan mengindikasikan dosis antibiotik yang efektif dalam
mengontrol infeksi pada pasien. Inokulum mikroorganisme yang telah
distandarisasi ditambahkan di dalam tabung yang mengandung seri dilusi dari
suatu antibiotika dan pertumbuhan mikroorganisme akan termonitor dengan
perubahan kekeruhan, sehingga KHM antibiotik yang dapat mencegah
pertumbuhan mikroorganisme in vitro dapat ditentukan (Harmita & Radji 2005).
Daya antibakteri dapat ditentukan berdasarkan nilai KHM dan KBM terhadap
pertumbuhan suatu bakteri. Konsentrasi minimal yang diperlukan untuk
menghambat pertumbuhan bakteri dikenal sebagai konsentrasi/ kadar hambat
minimal (KHM). Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari
bakteriostatik menjadi bakteriosida bila kadar antibakterinya ditingkatkan
melebihi KHM. Konsentrasi minimal yang diperlukan untuk membunuh 99,9%
pertumbuhan bakteri dikenal sebagai konsentrasi bunuh minimal (KBM) (Forbes,
2007).
Nazri dkk dalam Hapsari (2015) mengungkapkan bahwa kriteria kekuatan
antibakteri adalah sebagai berikut.
a. Diameter zona hambat > 20 mm : daya hambat sangat kuat
b. Diameter zona hambat > 10-20 mm : daya hambat kuat
 15

c. Diamater zona hambat > 5-10 mm : daya hambat sedang

d. Diameter zona hambat 0-5 mm : daya hambat lemah

4. Media
1. Definisi
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari zat-zat kimia organik dan
anorganik yang telah melalui proses pengolahan tertentu dapat digunakan untuk
menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba (Suriawiria 1986). Media ada
beberapa macam menurut bentuk, sifat dan susunannya yang ditentukan oleh
senyawa penyusun media, presentase campuran dan tujuan penggunaan
(Suriawiria 1986).
2. Bentuk
Berdasarkan penambahan atau tidaknya zat pemadat seperti agar-agar,
gelantin dan sebagainya maka bentuk media dikenal tiga jenis:
2.1 Media padat. Media ini umumnya dipergunakan untuk bakteri, jamur
dan mikroalgae. Medium padat bisa digunakan untuk mengamati morfologi koloni
dan mengisolasi biakan murni. Media padat ini diperoleh dengan cara
menambahkan agar yang berfungsi sebagai bahan pemadat, dapat membeku
disuhu ruang dan suhu 45oC. Medium padat dapat berupa bahan organik alamiah,
misalnya medium yang dibuat dari bahan kentang, wortel maupun bahan organik
lainnya. Contoh medium padat antara lain agar butylon, agar endo, dan lain-lain
(Suriawiria, 1986).
2.2 Media cair. Media cair tidak ditambahkan zat pemadat, biasanya
media cair dipergunakan untuk pembiakan mikroalgae tetapi juga mikroba lain,
terutama bakteri dan ragi. Medium cair dapat digunakan untuk berbagai tujuan
seperti pembiakan mikroba dalam jumlah besar, penelaah fermentasi dan uji-uji
lain. Medium cair yaitu media kaldu, BGLBB (Brilian Green Lactose Bile
Brooth) (Suriawiria, 1986).
2.3 Media semi padat atau semi cair. Penambahan zat pemadat dalam
media ini hanya 50% atau kurang dari seharusnya. Media ini umumnya
dipergunakan untuk pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan kandungan
 16

air dan hidup anaerob dan fakultatif. Media setengah padat ini dibuat dengan
bahan yang sama dengan media padat, akan tetapi berbeda dalam komposisi
agarnya. Medium setengah padat berbentuk cair dalam keadaan panas dan
berbentuk padat pada saat dingin. Berdasarkan keperluannya medium ini dibuat
tegak atau miring. Media setengah padat ini contohnya media NA (nutrien agar)
(Suriawiria 1986).
3. Komposisi
Berdasarkan fungsi fisiologis dari masing-masing komponen (unsur dan
hara) yang terdapat di dalam media, maka susunan media pada semua jenis
mempunyai kesamaan isi yaitu kandungan air, kandungan nitrogen, baik yang
berasal dari protein asam amino dan senyawa lain yang mengandung nitrogen,
kandungan sumber energi atau unsur C dan faktor pertumbuhan. Berdasarkan
perbedaan fungsi fisiologi tersebut, susunan media dapat berbentuk sebagai
berikut:
3.1 Media Alami. Media alami merupakan media yang disusun oleh
bahan-bahan alami, seperti kentang, tepung, daging, telur, ikan, umbi-umbian, dan
sebagainya. Contoh media alami yang paling banyak dipergunakan untuk
pengujian adalah telur untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan virus
(Suriawiria, 1986).
3.2 Media sintesis atau sintetik. Media sintesis atau sintetik merupakan
media yang disusun oleh senyawa kimia, seperti media yang biasanya digunakan
untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri Clostridium sp. media sintesis
misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar (Suriawiria, 1986).
3.3 Media semi sintetis. Media semi sintetis merupakan media yang
disusun oleh campuran bahan-bahan alami dan sintesis, misalnya kaldu nutrisi
yang biasanya digunakan untuk pertumbuhan bakteri: pepton ekstrak daging,
NaCl dan aquadest. Media semi sintesis misalnya PDA (Potato Dextrose Agar)
yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang (Suriawiria 1986).
 17

4. Sifat
Berdasarkan sifatnya, media dibedakan menjadi:
4.1 Media umum: Media ini dapat dipergunakan untuk pertumbuhan dan
perkembangbiakan satu atau lebih kelompok mikroba secara umum, seperti agar
kaldu nutrisi untuk bakteri, agar kentang dekstrosa untuk jamur (Suriawiria,
1986).
4.2 Media pengaya: Media ini dipergunakan dengan maksud untuk
tumbuh dan berkembangbiak lebih cepat dari jenis atau kelompok lainnya yang
sama-sama berada di dalam satu bahan, misalnya untuk memisahkan bakteri
penyebab penyakit tifus (Salmonella typhi) dari bahan tinja dengan media selenit
brain atau kaldu selenit atau kaldu tetrationat (Suriawiria, 1986).
4.3 Media diferensial. Media yang dipergunakan untuk pertumbuhan
mikroba tertentu serta penentuan sifat-sifatnya, misalnya media agar darah yang
dipergunakan penumbuhan bakteri hemolitik sehingga bakteri non hemolitik tidak
dapat tumbuh (Suriawiria, 1986).
4.4 Media penguji. Media yang dipergunakan untuk pengujian senyawa
atau benda tertentu dengan bantuan mikroba, misalnya media penguji vitamin,
asam amino, antibiotik, residu pestisida.
4.5 Media selektif. Media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau
lebih jenis mikroba tertentu akan menghambat atau mematikan untuk jenis
lainnya.
4.6 Media perhitungan. Media yang dipergunakan untuk menghitung
jumlah mikroba pada suatu bahan. Media ini dapat berbentuk media umum, media
selektif maupun media diferensial, dan media penguji (Suriawiria 1986).
5. Medium yang Digunakan dalam Penelitian
5.1 Brain Heart Infusion (BHI). BHI merupakan media cair yang secara
umum digunakan untuk kultur mikroorganisme termasuk bakteri aerob dan
anaerob. BHI juga digunakan untuk persiapan inokulasi yang digunakan dalam uji
sensitivitas antibiotik. BHI adalah nutrisi, media kultur buffer yang berisi cairan
jaringan otak dan jantung dan pepton untuk suplai protein dan nutrisi lain yang
 18

diperlukanuntuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme (Power & Mc Cuen

1988).
5.2 Mueller Hinton Agar (MHA). Media ini dianjurkan untuk uji
sensitivitas cakram antimikroba secara difusi menurut bakteri yang umum dan
dapat berkembang pesat oleh metode Kirby-Bauer. Awal 1960-an, laboratorium
mikrobiologi klinik menggunakan berbagai macam prosedur untuk menentukan
kerentanan bakteri pada antibiotik dan agen kemoterapi. Penelitian gabungan
internasional menegaskan MHA memiliki reproduktivitas yang relatif baik,
kesederhanaan dari formula dan kelengkapan data eksperimen dapat terakumulasi
dengan media ini.
Prosedur ini digunakan untuk pengujian bakteri patogen aerobik yang
tumbuh pesat atau bakteri anaerob fakultatif seperti Staphylococcus, kelompok
Enterobacteriaceae, batang Gram negatif aerob (misalnya Pseudomonas sp dan
Acinetobacter sp) dan beberapa Streptococcus. Prosedur Kirby-Bauer didasarkan
pada difusi zat antibiotik berbentuk lempeng kertas yang ditempel pada agar gel.
Suspensi bakteri diinokulasikan pada seluruh permukaan media. Cakram kertas
yang dimasukkan agen antibiotik kemudian diletakkan pada permukaan agar,
diinkubasi, dan zona hambat diukur. Organisme dikatakan peka, agak peka,
intermediet atau resisten pada agen antibiotik ditentukan dengan membandingkan
ukuran zona hambat yang diperoleh dengan standar zona hambat Kirby-Bauer. Uji
difusi sensitivitas dipengaruhi oleh banyak faktor, antara lain medium, ketebalan
agar, potensi cakram, konsentrasi inokulan, pH, dan pembentukan β-laktamase
oleh bakteri uji (Power & Mc Cuen 1988).
5.3 Sulfide Indol Motility (SIM). Medium SIM digunakan untuk
membedakan basil enterik berdasarkan pembentukan sulfida, pembentukan indol,
dan motilitas bakteri. Pembentukan hidrogen sulfida, pembentukan indol dan
motilitas dapat membedakan karakteristik yang membantu dalam
mengidentifikasi Enterobacteriaceae, oleh karena itu medium SIM berguna dalam
proses identifikasi patogen enterik. Penggunaan medium SIM memungkinkan
penentuan tiga aktivitas yang dapat digunakan untuk membedakan bakteri enterik.
Sodium tiosulfat dan Ferro amonium sulfat adalah indikator dari pembentukan
 19

hidrogen sulfida. Ferro amonium sulfat bereaksi dengan gas H2S untuk
menghasilkan ferro sulfida yang berbentuk endapan hitam. Kasein pepton yang
kaya triptofan bereaksi dengan bakteri tertentu menghasilkan produksi indol.
Indol terdeteksi dengan penambahan reagen Erlich pada masa inkubasi. Deteksi
motilitas ini dimungkinkan karena sifat medium yang semi padat. Pertumbuhan
yang menyebar keluar dari garis tusukan sentral menunjukkan bahwa organisme
uji dapat melakukan pergerakan yang meluas (Power & Mc Cuen 1988).
5.4 Lysine Iron Agar (LIA). Lysine Iron Agar digunakan untuk
membedakan organisme enterik berdasarkan kemampuan untuk
mendekarboksilasi atau mendeaminasi lisin untuk membentuk hidrogen sulfida.
Pancreatic digest dari gelatin memproduksi asam amino dan senyawa nitrogen
yang lain yang mendukung pertumbuhan dari bakteri yang tidak berkembang
cepat. Dekstrosa merupakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi.
Bromcresol ungu sebagai indikator pH berubah menjadi kuning pada pH lebih
dari sama dengan 5,2 dan ungu pada pH di atas 6,8. Ferri ammonium citrate dan
sodium thiosulfate adalah indikator untuk pembentukan hidrogen sulfida. Lysin
merupakan substrat yang digunakan untuk mendeteksi enzim lysine
dekarboksilase dan lysine deaminase. Kultur dari basil enterik yang menghasilkan
hidrogen sulfida menyebabkan menghitamnya medium yang disebabkan oleh
produksi dari ferro sulfida. Mikroorganisme yang memproduksi lysine
dekarboksilase akan menghasilkan reaksi basa (warna ungu) atau reaksi netral
pada dasar medium. Mikroorganisme yang mendeaminasi lysine menyebabkan
perkembangan warna merah pada daerah miring di atas dasar yang asam. Gas
yang ada kemungkinan jarang terjadi atau ditelan keberadaannya.
Dekarboksilasi lysin dapat dideteksi dengan reaksi basa (ungu) pada dasar
medium. Deaminasi lysin dapat dilihat dengan pembentukan warna merah pada
daerah miring. Hidrogen sulfida dideteksi dengan adanya endapan hitam. Reaksi
negatif (warna daerah miring ungu atau kuning pada dasar medium) hanya
mengindikasikan fermentasi dekstrosa saja. Hidrogen sulfida mungkin tidak dapat
dideteksi dalam medium ini oleh mikroorganisme yang tidak memiliki aktivitas
lysin dekarboksilase (Power & Mc Cuen 1988).
 20

5.5 Kligers Iron Agar (KIA). Medium KIA digunakan untuk

membedakan anggota Enterobacteriaceae yang didasarkan pada kemampuan
mereka untuk memfermentasi dekstrosa dan laktosa dan untuk membebaskan
sulfida. KIA mengandung laktosa dan dekstrosa yang memungkinkan diferensiasi
spesies basil enterik yang dicirikan dengan perubahan warna indikator pH fenol
merah karena terjadinya produksi asam selama fermentasi gula. Kombinasi ferro
amonium sitrat dan sodium tiosulfat memungkinkan deteksi produksi hidrogen
sulfida. Organisme yang tidak memfermentasi laktosa seperti Salmonella dan
Shigella awalnya membentuk warna kuning pada daerah yang miring akibat asam
yang dihasilkan oleh fermentasi dari jumlah kecil dekstrosa. Reaksi tersebut
kembali bersifat alkali karena oksidasi asam (daerah miring berwarna merah)
ketika pasokan dekstrosa habis di lingkungan aerobik yang miring. Reversi ini
tidak terjadi dalam lingkungan anaerobik di dasar yang masih bersifat asam.
Organisme yang memfermentasi laktosa menghasilkan warna kuning di
daerah miring dan dasar yang karena produksi asam yang cukup pada daerah yang
miring untuk mempertahankan pH asam pada kondisi aerobik. Organisme yang
tidak mampu memfermentasi laktosa dan dekstrosa akan membentuk warna merah
pada daerah miring dan dasar tabung. Produksi hidrogen sulfida ini dibuktikan
dengan warna hitam baik seluruh dasar, atau dalam formasi cincin di dekat bagian
atas dasar. Produksi gas (reaksi aerogenik) terdeteksi sebagai gelembung tunggal
atau dengan pemisahan atau pemecahan agar. Hasil yang diharapkan dari
identifikasi dengan medium KIA adalah reaksi di daerah miring dan dasar, adanya
pembentukan gas dan produksi hidrogen sulfida (Power & Mc Cuen 1988).
5.6 Sitrat. Prinsip dari uji ini ialah apakah suatu organisme dapat
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon untuk metabolisme
dengan menghasilkan suasana basa. Uji sitrat digunakan untuk melihat
kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber
karbon dan energi. Uji ini dapat menggunakan medium Sitrat-Koser berupa
medium cair atau medium Sitrat-Simmon berupa medium padat. Simmon’s
Citrate agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya
sumber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan brom thymol blue sebagai indikator
 21

pH. Mikroorganisme yang mampu menggunakan sitrat akan menghilangkan

medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna
indikator dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru
menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-
satunya sumber karbon (Power & Mc Cuen 1988).

6. Metode Uji Aktivitas

Agar plug diffusion method yang dikembangkan pada tahun 1940 adalah
metode resmi yang digunakan banyak laboratorium mikrobiologi klinis untuk uji
kepekaan antimikroba. Saat ini banyak yang diterima dan standar yang sudah
disetujui oleh Clinical and Laboratory Standarts Institute (CLSI) untuk bakteri
dan ragi. Meski tidak semua bakteri dapat diuji secara akurat dengan metode ini,
standarisasi telah dilakukan untuk menguji bakteri patogen tertentu, menggunakan
media kultur tertentu dan krieria interpretasi untuk zona penghambatan. Agar plug
diffusion method sering digunakan untuk menyoroti antagonisme antar
mikroorganisme, dan prosedurnya mirip dengan yang digunakan dalam difusi
disk. Yang melibatkan pembuatan kultur agar-agar yang sesuai media kultur
dengan garis-garis tajam pada permukaan pelat. Selama pertumbuhan, sel mikroba
mensekresikan molekul yang berdifusi kedalam agar-agar medium. Setelah
dilakakukan inkubasi, agar plot atau silindir dipotong secara aseptis dengan
penggerek gabus steril dan diendapkan pada permukaan agar pelat lain yang
sebelumnya diinokulasi oleh mikroorganisme uji. Zatnya berdifusi dari steker ke
media agar. Kemudian, aktivitas antimikroba dari molekul yang disekresikan
mikroba adalah dideteksi oleh munculnya zona penghambatan di sekitar agar
steker (Mounyr B et al 2015).

7. Sterilisasi
Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang
terdapat di dalam suatu benda. Biakan bakteri yang dipindahkan secara aseptik,
menggunakan salah satu cara sterilisasi yaitu pembakaran. Tiga cara utama yang
 22

umum dipakai dalam sterilisasi, yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan

kimia, dan penyaringan (filtrasi) (Hadioetomo 1985).
Sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah adalah panas yang
digunakan bersama-sama dengan uap air. Sterilisasi basah biasanya digunakan di
dalam autoclave (pressure cooker) berukuran besar atau steririsator uap yang
mudah diangkat (portable) dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan 1 atm
pada suhu 121oC selama 15 menit. Naiknya titik didih air menjadi 1 tekanan
atmosfer pada permukaan air laut (Hadioetomo 1985).
Sterilisasi panas kering adalah panas yang digunakan tanpa kelembaban.
Sterilisasi panas kering kurang efisien dan membutuhkan suhu lebih tinggi serta
waktu yang lebih lama untuk sterilisasi, hal ini disebabkan karena tanpa
kelembaban tidak ada panas laten. Bahan-bahan yang biasa disterilkan dengan
cara ini antara lain bahan pecah belah (pipet, tabung reaksi, cawan petri dari kaca,
botol sampel, jarum suntik), dan bahan-bahan yang tidak tembus uap (gliserin,
minyak, vaselin, dan bahan-bahan berupa bubuk) (Hadioetomo 1985).

8. Landasan Teori
Air limbah usaha dan atau kegiatan pertambangan batubara adalah air
yang berasal dari kegiatan penambangan batubara yang meliputi penggalian,
pengangkutan dan penimbunan baik pada tambang terbuka maupun tambang
bawah tanah. Baku mutu air limbah batubara adalah ukuran batas atau kadar unsur
pencemar dan atau jumlah unsur pencemaran yang ditenggang keberadaannya
dalam air limbah batu bara yang akan dibuang atau dilepas ke air permukaan.
Parameter yang dimonitoring pada air limbah kegiatan penambangan batubara
adalah TSS, total Fe dan total Mn (KepMenLH no.113/2003).
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif yang dapat
menyebabkan penyakit pada manusia. Pseudomonas aeruginosa dapat tumbuh di
air suling dan akan tumbuh dengan baik dengan adanya unsur nitrogen dan
karbon, banyak dijumpai dalam air dan tanah (Todar K, 2004). Staphylococcus
aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat berdiameter 0,7-1,2
μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah
 23

anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora,dan tidak bergerak. Bakteri

ini tumbuh pada suhu optimum 37 ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik
pada suhu kamar (20-25 ºC). Koloni pada perbenihan padat berwarna abu-abu
sampai kuning keemasan, berbentuk bundar, halus, menonjol, dan berkilau.
Lebih dari 90% isolat klinik menghasilkan S.aureus yang mempunyai kapsul
polisakarida atau selaput tipis yang berperan dalam virulensi bakteri (Jawetz et
al.,2008).
Mikroba antagonis merupakan suatu jasad renik yang dapat menekan,
menghambat, dan memusnahkan mikroba lainnya. Mikroba antagonis dapat
berupa bakteri, jamur atau cendawan, actinomycetes, bahkan virus.
Antimikroba ialah obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba yang
merugikan manusia. Antimikroba adalah suatu zat antimikroba yang ideal
memiliki toksisitas selektif. Istilah ini secara tidak langsung menyatakan suatu
obat berbahaya terhadap parasit tetapi tidak berbahaya bagi inangnya (Jawetz et al
2001). Mekanisme kerja antimikroba dibagi menjadi beberapa cara yaitu,
hambatan sintesis dinding sel, perubahan permeabilitas membran sel atau
penghambatan pengangkutan aktif melalui membran sel, hambatan sintesis
protein, hambatan sistesis asam nukleat sel, serta hambatan terhadap metabolisme
mikroba. Antimikroba dapat bekerja secara bakterostatik maupun bakterisidal.
Bakteriostatik memiliki arti memiliki kemampuan menghambat multiplikasi
bakteri. Multiplikasi akan berlangsung lagi jika unsur tersebut tiada. Bakterisidal
memiliki sifat mematikan bakteri. Aksi bakterisidal berbeda dalam hal tidak dapat
dipulihkan lagi, yaitu bakteri yang dimatikan tidak dapat lagi bermultiplikasi
meskipun sudah tidak ada hubungan lagi dengan unsur itu (Jawetz et al, 2001).
Efektivitas senyawa antimikroba dipengaruhi oleh karakter dinding sel atau
membran sel dari bakteri tersebut. Penetrasi obat melalui membran yang lebih
cepat dan jumlah yang lebih besar segera menginisiasi efek menghambat reaksi
sintesis protein dalam inti sel mikroorganisme (Sudjaswadi, 2006).
 24

9. Hipotesis
Berdasarkan permasalahan yang ada dapat disusun hipotesis sebagai
berikut:
Pertama, bakteri yang terdapat dalam air limbah tambang batubara
memiliki aktivitas antipatogen terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC
25923.
Kedua, bakteri yang terdapat dalam air limbah tambang memiliki aktivitas
antipatogen terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
 BAB III
METODE PENELITIAN

A. Populasi dan Sampel

Populasi adalah semua obyek yang menjadi sasaran penelitian. Populasi
yang digunakan dalam penelitian ini adalah air limbah tambang batubara di
Tenggarong, Kalimantan Timur.
Sampel adalah sebagian kecil dari populasi yang digunakan dalam
melakukan penelitian. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel
air tambang batubara yang diambil secara acak.

2. Variabel Penelitian
1. Identifikasi variabel utama
Variabel utama pada penelitian ini adalah uji aktivitas anti bakteri (
Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus ) dari air limbah tambang
batubara yang diuji secara metode difusi pada media Mueller Hinton Agar
(MHA).
2. Klasifikasi variabel utama
Variabel utama yang telah diidentifikasi dapat diklasifikasikan ke dalam
berbagai macam variabel yaitu variabel bebas, variabel kendali, dan variabel
tergantung.
Variabel bebas adalah variabel yang sengaja diubah-ubah untuk dipelajari
pengaruhnya terhadap variabel tergantung. Variabel bebas untuk penelitian ini
adalah air limbah tambang batubara.
Variabel kendali adalah variabel yang mempengaruhi variabel tergantung,
sehingga perlu ditetapkan kualifikasinya agar hasil yang diperoleh tidak tersebar
dan dapat diulang oleh peneliti lain secara tepat. Variabel kendali dalam penelitian
ini adalah laboratorium, peneliti, sterilitas, media, peralatan, kemurnian bakteri,
serta pekerjaan aseptis sehingga tidak terjadi kontaminan pada saat penelitian.
Variabel tergantung adalah titik pusat permasalahan pilihan dalam
penelitian ini. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah diameter daya

25
 26

hambat dari air limbah tambang batubara yang telah di isolasi dan dilakukan
terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853.
3. Definisi operasional variabel utama
Pertama, air limbah adalah air yang berasal dari kegiatan penambangan
batubara yang meliputi penggalian, pengangkutan dan penimbunan baik pada
tambang terbuka maupun tambang bawah tanah.
Kedua, isolasi adalah proses untuk memisahkan mikroorganisme dari
organisme lain dengan cara goresan yang dilakukan pada media Nutrien Agar dan
Nutrien Broth.
Ketiga, identifikasi dilakukan untuk mengetahui secara spesifik bakteri
apa yang didapat dari hasil isolasi, dilakukan identifikasi bakteri dari hasil isolasi
air limbah tambang batubara.
Keempat, uji antipatogen adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui
adanya suatu patogen terhadap suatu bakteri Staphyllococcus aureus ATCC
25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Kelima, pola aktivitas antipatogen adalah daya efektivitas dari suatu zat
dalam membunuh bakteri.
Keenam, Kadar Hambat Minimum (KHM) adalah konsentrasi zat terendah
yang masih dapat menghambat pertumbuhan organisme tertentu.

4. Bahan dan Alat

1. Bahan
1.1. Bahan sampel. Bahan sampel yang digunakan dalam penelitian ini
adalah air limbah tambang batubara yang diambil dari Tenggarong, Kalimantan
Timur.
1.2. Bahan kimia. bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini
adalah air suling, alkohol 70%, cat kristal violet, lugol iodine, safranin.
1.3. Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC
25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 yang diperoleh dari
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi Surakarta.
 27

1.4. Media. Media yang digunakan adalah Nutrient agar (Na), Brain Heart
infusion (BHI), Kligers Iron Agar (KIA), Lysin Iron Agar (LIA), Simmon Citrate
Agar, Mueller Hinton Agar (MHA), Vogel Johnson Agar (VJA), Pseudomonas
Selective Agar (PSA).
2. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan Petri steril, jarum
ose, ose platina, tabung reaksi, rak tabung reaksi, inkas, lampu spiritus, kapas lidi
steril, jarum ent, botol penampung steril, objek glass, vortex, mikroskop
binokuler,pipet volume, penggaris, spidol, mikropipet, gelas ukur, labu takar,
beker glass, kertas perkamen.

5. Jalannya Penelitian
1. Sterilisasi
Sterilisasi dilakukan untuk membebaskan alat atau media dari jasad renik
dilakukan tindakan sterilisasi. Alat-alat yang disterilkan dicuci terlebih dahulu
kemudian dikeringkan. Kemudian cawan Petri dibungkus dengan kertas
perkamen. Sedangkan, alat-alat gelas seperti tabung reaksi ditutup dengan
menggunakan kapas lalu dibalut dengan kassa dan dibungkus dengan kertas
perkamen. Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121◦C
dengan tekanan 1 atm selama 30 menit. Jarum ose disterilisasi dengan cara
dibakar pada nyala api lampu bunsen hingga terlihat merah berpijar, dimulai dari
pangkal kawat ke ujung ose (Putranto dkk 2014).
2. Isolasi Bakteri Dari Air Limbah Tambang
Menurut Hadioetomo (1985), isolasi bakteri sering dilakukan untuk
memperoleh bakteri ataupun biakan bakteri murni. Isolasi ini dilakukan dengan
menggoreskan sampel yaitu air limbah tambang batubara menggunakan jarum
Ose pada cawan Petri yang berisi nutrien agar, kemudian bungkus cawan petri
menggunakan kertas perkamen dan di inkubasi pada suhu 37◦C selama 18-24 jam.
Lalu amati koloni yang terbentuk.
 28

3. Identifikasi Bakteri dari air limbah tambang batubara

3.1 Pengamatan Morfologi Koloni. Suspensi bakteri diinokulasi pada
medium nutrient agar dan di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Pengamatan
morfologi koloni meliputi bentuk dan warna koloni pada media nutrient agar.
3.2 Pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram dilakukan untuk membedakan
bakteri Gram positif dan Gram negatif. Bakteri uji dioleskan diatas kaca objek dan
difiksasi diatas api. Olesan bakteri tersebut di genangi dengan karbol gentian
violet selama 1 menit dan di genangi kembali dengan lugol selama 1 menit.
Olesan tersebut di cuci dengan pemucat alkohol 95% selama 30 detik dan dibilas
dengan air mengalir. Olesan bakteri di genangi dengan pewarna safranin selama
30 detik sehingga zat warna tersebut larut, kemudian dibilas dengan menggunakan
air mengalir. Olesan bakteri dikeringkan menggunakan kertas saring, kemudian
ditetesi dengan minyak emersi dan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran
lensa obyektif 5 kali dan lensa okuler 100 kali.
3.3 Uji Biokimia.
3.3.1 Uji Sulfit Indol Motilitas. Uji motilitas diambil dengan aseptik
menggunakan jarum inokulum, kemudian diinokulasikan secara vertikal pada
media Sulfide Indol Motility (SIM) dan diinkubasi selama 24 jam. Motilitas
bakteri ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan pada permukaan medium dan
tidak ada bekas pada tusukan.
3.3.2 Uji Kligers Iron Agar (KIA). Biakan bakteri diambil dengan
menggunakan ose kemudian diinokulasi ke dalam media Kligers Iron Agar (KIA)
dengan cara garis lurus ditarik pada media dan ditusuk ke dalam dasar media dan
dibuat goresan berbentuk zig-zag di atas permukaan media. Selanjutnya
diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37ºC.
3.3.3 Uji Lysine Iron Agar (LIA). Biakan bakteri diinokulasikan
menggunakan jarum Ose steril pada media dengan cara tusukkan dan goresan
kemudian inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Terjadinya warna ungu pada
seluruh bagian perbenihan berarti tes positif. Jika tidak ada perubahan warna atau
dasarnya berwarna kuning maka tes dinyatakan negatif.
 29

3.3.4 Uji Simmon Citrate Agar (SCA). Koloni bakteri diambil dengan
ose dan diinokulasi pada media Simmon Citrate Agar (SCA), selanjutnya
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Terjadi warna biru pada medium
berarti tes positif dari warna dasar media yaitu hijau.
4. Identifikasi Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853
4.1 Identifikasi makroskopis. Suspensi bakteri Staphylococcus aureus
ATCC 25923 diinokulasi pada medium Vogel Johnson Agar (VJA) yang
sebelumnya telah ditetesi 3 tetes kalium telurit 1% dalam cawan petri steril dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Hasil pengujian ditunjukkan dengan
warna koloni hitam dan warna medium di sekitar koloni berwarna kuning karena
Staphylococcus aureus ATCC 25923 dapat memfermentasi manitol menjadi
suasana asam dan mereduksi tellurit menjadi metalik telluritdi sekitar koloni yang
berwarna hitam. Adanya fenol red maka medium di sekitar koloni berwarna
kuning. Untuk Gram negatif dengan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 koloni warna kehijauan pada media Pseudomonas Selective Agar (PSA)
(Jawetz et al. 2007).
4.2 Identifikasi mikroskopis secara morfologi. Bakteri Staphylococcus
aureus ATCC 25923 dinyatakan positif apabila berwarna ungu, berbentuk bulat
dan bergerombol seperti buah anggu ketika diamati di bawah mikroskop.
Pewarnaan Gram dilakukan secara preparat ulas (smear) yang telah difiksasi
kemudian ditetesi menggunakan Gram A (Kristal violet) sebagai pewarna utama
pada preparat sampai semua ulasan terwarnai dan diamkan selama 1 menit
kemudian dicuci denga akua destilata mengalir kemmudian ditetesi dengan Gram
B (lugol iodine) diamkan kurang lebih 1 menit kemudian cuci denganakua
destilata mengalir dan dikeringkan, preparat kemudian dilunturkan dengan Gram
C (etanol aseton = 1 : 1), diamkan selama 45 detik dan dicuci kembali dengan
akua destilata mengalir, preparat dikeringkan dengan kertas tisu, kemudian
preparat ditutup dengan Gram D (cat safranin). Bakteri Staphylococcus aureus
ATCC 25923 dinyatakan positif apabila berwarna ungu, berbentuk bulat dan
bergerombol seperti buah anggur ketika diamati dibawah mikroskop. Bakteri
 30

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dinyatakan positif apabila berwarna

merah berbentuk basil dan terdapat flagel.
4.3 Identifikasi Fisiologis Biokimia.
Uji katalase menggunakan suspensi bakteri uji yang ditanam pada media
nutrien agar cair dengan penambahan 2 tetes hidrogen peroksida 3%. Pengujian
ini menggunakan hidrogen peroksida 3% karena hidrogen peroksida merupakan
salah satu hasil respirasi aerobik bakteri , dimana hasil respirasi tersebut justru
dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat toksik bagi bakteri itu
sendiri, sehingga komponen ini dipecah agar tidak bersifat toksik lagi. Pada sat
melakukan respirasi salah satu komponen yang dihasilkan bakteri adalah hidrogen
peroksida hasil yang dinyatakan positif bila terlihat pembentukkan gelembung
udara disekitar koloni (Jawetz et.al 2001).
Uji koagulase dilakukan dengan menggunakan plasma darah 0,5 ml dan
diberi asam sitrat yang telah diencerkan (1:5) ditambah 1 ose biakkan bakteri
Stapylococcus aureus ATCC 25923 lalu diinkubasi pada suhu 37◦C selama 24
jam, diamati adanya penggumpalan selama 4 jam atau lebih. Hasil positif kuat jika
tabung uji dibalik gumpalan plasma tidak terlepas dan tetap melekat pada dinding
tabung (Jawetz et.al 2001).
Uji pada media SIM (Sulfida Indol Motility), biakan murni bakteri
diinokulasi pada permukaan media dengan cara tusukan kemudia diinkubasi pada
suhu 37oC selama 24 jam. Identifikasi ini bertujuan untuk mengetahui
terbentuknya sulfida, indol dan motilitas bakteri. Uji positif (+) pada
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ditandai dengan uji sulfida negatif, uji
indol tidak terbentuk cincin indol warna merah setelah ditambah reagen Ehrlich
dan uji motolitas terjadi pertumbuhan bakteri yang menyebar pada seluruh media
(Volk & Wheller 1990).
Uji pada media KIA (Kliger Iron Agar), biakan bakteri diinokulasi secara
tusukan dan goresan kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
Identifikasi ini bertujuan untuk uji fermentasi karbohidrat (glukosa, laktosa), ada
tidaknya gas dan sulfida. Uji positif pada Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
ditandai dengan bagian lereng akan bewarna merah maka ditulis K, bagian dasar
 31

ditandai dengan berwarna merah maka ditulis K, tidak terbentuk warna hitam
pada media maka ditulis S(-) (Volk & Wheller 1990).
Uji pada media LIA (Lysine Iron Agar), inokulasi bakteri secara tusukan
dan goresan, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Identifikasi ini
bertujuan untuk menguji diaminasi lisin dan silfida. Uji positif pada
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ditandai dengan bagian lereng akan
bewarna ungu maka ditulis K dan media tidak berwarna hitam ditulis S(-) (Volk
& Wheller 1990).
Uji pada media Sitrat, inokulasi bakteri secara tusukan dan goresan,
kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Identifikasi ini bertujuan
untuk mengetahui kemampuan bakteri menggunakan citrate sebagai sumber
karbon tunggal. Uji positif pada Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ditandai
dengan media berwarna biru (Volk & Wheller 1990).
5. Pembuatan suspensi bakteri uji
Bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC 25923, P.aeruginosa ATCC
27853 diambil dari biakan murni kurang lebih 2 ose, kemudian dimasukkan ke
dalam tabung yang berisi 10 ml media BHI, kekeruhannya disesuaikan dengan
kekeruhan standard Mc Farland 0,5 serta dengan jumlah 1,5x10 8 cfu/mL,
kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Tujuan disesuaikan suspensi
bakteri Staphylococcus aureus 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
dengan standard Mc Farland 0,5 yaitu agar jumlah bakteri yang digunakan sama
selama penelitian dan mengurangi kepadatan bakteri saat pengujian.
6. Uji Antipatogen Air Limbah Batubara Terhadap bakteri Staphylococcus
aureus ATCC dan Pseudomonas 25923 aeruginosa ATCC 27853
Uji antipatogen yang digunakan adalah Agar Plug Diffusion Method.
Prinsip dari metode ini adalah penghambatan pertumbuhan terhadap
mikroorganisme, yaitu zona hambatan akan terlihat jernih disekitar zona yang
mengandung zat antibakteri (Harmita & Radji 2005). Lima bakteri yang sudah
diidentifikasi dengan melakukan pewarnaan gram masing-masing dioleskan pada
5 cawan petri yang masing-masing berisi media Nutrient Agar (NA) diinkubasi
 32

selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi dipotong horizontal secara
aseptis.
Dituang media Mueller Hinton Agar (MHA) pada cawan petri steril
berdiameter 150 mm sebanyak 60 mL, biarkan mengeras pada suhu ruang. Setelah
mengeras secara aseptis dibuat sumuran lalu difusikan bakteri Staphylococcus
aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, lalu tanamkan
hasil isolasi bakteri dari media NA dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37◦C.
Keesokan harinya dapat diamati zona hambat yang terbentuk dan adanya daerah
jernih, lalu diukur kemampuan zona hambat.
7. Analisis hasil
Hasil uji aktivitas antipatogen air limbah batubara terhadap
Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
dari hasil isolasi secara Agar Plug Diffusion Method menggunakan media Mueller
Hinton Agar (MHA) dibandingkan dengan membandingkan diameter zona
hambat terhadap biakan bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 kemudian diukur diameter hambatan
pertumbuhan bakterinya dari masing-masing lingkaran yang terbentuk dan
mengukur jumlah koloni bakteri dihitung menggunakan Colony Counter.
Dari data yang diperoleh dilakukan analisa dengan menggunakan
Kolmogrof-Sminov, jika terdistribusi secara normal kemudian dilanjutkan dengan
Analysis Of Varian (ANOVA) untuk melihat perbedaan secara keseluruhan
kemudian dilanjutkan dengan LSD (Least Significant Difference) untuk melihat
perbedaan antar formula.
 33

8. Skema Jalannya Penelitian

Limbah tambang dan bakteri
uji

Isolasi dan Identifikasi Identifikasi

Bakteri dari Limbah Bakteri Uji

1. Pewarnaan Gram 1. Identifikasi Makroskopis

2. Uji Katalase 2. Pewarnaan Gram
3. Uji Koagulasi 3. Uji Biokimia

Bakteri Uji dan Bakteri Limbah

Pembuatan Suspensi Bakteri Uji dan Tabung Reaksi Berisi

bakteri limbah pada Media BHI, Suspensi Bakteri
Sesuaikan Dengan Mc Farland 0,5

Staphylococcus Pseudomonas aeruginosa

aureus ATCC 25923 ATCC 27853

Media MHA Media PSA

Cawan petri berisi
sumuran bakteri limbah

Buat sumuran dengan boor prop,

letakkan hasil isolasi bakteri
limbah ke dalam sumuran

Daerah zona hambat diukur

Hasil Uji aktivitas

antipatogen bakteri limbah

Gambar 1. Skema jalannya penelitian secara sistematis

 34

9. Jadwal Penelitian
Tabel 1. Jadwal kegiatan penelitian

Tahun 2018
No jenis Kegiatan
Feb Mar Apr Mei Jun Jul Ag
1 Studi Pustaka
2 Persiapan Penelitian

3 Penelitian Labolatorium
4 Pengumpulan dan Analisis Data
5 Penyusunan Laporan
 DAFTAR PUSTAKA

Agustrina, G.2011. Potensi Propolis Lebah Madu Apis Mellifera spp Sebagai
Bahan Antibakteri. Departemen Bikoimia. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor

Brooks, G.F., Butel, J. S., and Morse, S. A., 2005, “Jawetz, Melnick &
Adelbergh’s:

Bryan, F.L., Fanelli, M.J. and Riemann, H. 1979. Salmonella Infections. In

Riemann, H. and Bryan, F.L. Foodborne Infections and Intoxications. 2nd
Ed. Academic Press Inc., San Diego. Cal., USA.

Djajadiningrat, ST., 2007. Pertambangan Lingkungan dan Kesejahteraan

Masyarakat. Makalah Seminar Ilmiah Nasional: Mining, Environment and
People Welfare. International Center for Coastal and Small Island
Environment Studies, Universitas Sam Ratulangi

Djide, M. N, Sartini. 2008. Dasar-Dasar Mikrobioogi Farmasi. Lembaga

Penerbitan Universitas Hasanuddin : Makassar

Forbes, B.A, Shama D.F, Wissfeld A.S. 2007. Bailey & Scott’s Diagnostic
Microbiologi 12th Edition

Garrity. G. M., Bell. J. A. and Lilburn, T.G. 2004. Taconomic Outlineof The
Prokaryotex bergey”s Manual of Systematic Bacteriolog. 2th Edition.
United States of America, Springer, New York Berlin Hendelberg.

Gupte, S., 1990, “Mikrobiologi Dasar”, Alih bahasa: Suryawidjaja, J.E., Penerbit
Bina Rupa Aksara, Jakarta

Gopinath et.al.2013. Antimicrobial Activity of Actinomycetes Isolated From Coal

Mine Soils of Godavari Belt Region, A.P, India

Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium, Jakarta: PT. Gramedia

Hapsari, Endah. 2015. Uji Antibakteri Ekstrak Herba Meniran (Phyllantus niruri)
Terhadap Pertumbuhan Bakteri Bacillus cereus dan Escherichia coli.
Skripsi. Pendidikan Biologi. Universitas Sanata Darma. Yogyakarta.

Harmita, Radji M. 2005. Buku Ajar Analisis Hayati. Jakarta: Departemen Farmasi
FMIPA Universitas Indonesia.

35
 36

Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Yrama

Widya. Bandung

Jawetz, E., J.L. Melnick, and E.A. Adelberg. 2001. Mikrobiologi untuk Profesi
Kesehatan (Review of Medical Mikrobiology) Diterjemahkam oleh H.
Tomang. Jakarta: Penerbit EGC

Jawetz, E., Joseph Melnick dan Edward A. 2004. Mikrobiologi Kedokteran, Edisi
ke-23. Jakarta

Jawetz E, Melnick , J L, EA, 2012. Medical Mirobiology. 26th. Ed. Elferia Nr.
Penerjemah; Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Keputusan Menteri Negara Lingkungan Hidup No113 Tahun 2003, Tentang Baku
Mutu Air Limbah Bagi Usaha dan atau Kegiatan Pertambangan Batubara
Kusnadi, dkk.2003. Mikrobiologi, Common Textbook.JICA. Bandung: FMIPA
Universitas Pendidikan Indonesia

Pelczar, M.J. & E.C.S. Chan, 1986, Penterjemah , Ratna Siri Hadioetomo dkk.
Dasar-Dasar Mikrobiologi 1, Universitas Indonesia Press. Jakarta.

Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi 2. Jakarta: UI

Press.

Pertiwi, Hardiyanti Dharma., 2011. Dampak Keberadaan Perusahaan

Pertambangan Batubara Terhadap Aspek Ekologi, Sosial dan Ekonomi
Masyarakat di Era Otonomi Daerah (Kasus: Kelurahan Sempaja Utara,
Kecamatan Samarinda Utara, Kota Samarinda). Skripsi. Bogor: IPB.

Samuel, A. 2013. Pola Resistensi Antibiotik Terhadap Isolat Bakteri Aerob

Penyebab Infeksi Luka Operasi Di Ruang Rawat Inap Bagian Bedah Dan
Kebidanan RSUD Dr. H. Abdul Moeloek Bandar Lampung. (Skripsi).
Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Sayoga, R. G. 2007. Pengelolaan Air Tambang: Aspek Penting dalam

Pertambangan yang Berwawasan Lingkungan. Pidato Ilmiah, Majelis Guru
Besar ITB. Jurusan Teknik Pertambngan ITB.

Subardja, A et al. 2007. Pemulihan Kualitas Lingkungan Penambangan Batubara:

Karakterisaasi dan Pengendalian air asam Tambang di Berau. Laporan
Teknis, Proyek DIPA Puslit Geoteknologi – LIPI TA 2007.

Sukandarrumidi. (2014). Batu Bara dan Gambut. Yogyakarta: Gadjah Mada

University Press.
 37

Suriawiria U. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung: Angkasa.

Suriawiria U. 1986. Mikrobiologi Air Dasar-Dasar Pengolahan Buangan Secara

Biologis. Cetakan 1. Bandung: Penerbit Alumni.

Suryono B. 2009. Bakteriologi Umum dan Bakteriologi Klinik. Kediri: Akademi

Analis Kesehatan Bhakti Jaya.

Todar L. Pseudomonas aeruginosa, University of Wisconsin-Madison

Department of Bacteriology, 2004.

Undang-Undang Pokok Pertambangan Tahun 1987

Undang-Undang Republik Indonesia Nomor 4 Tahun 2009 Tentang

Pertambangan Mineral dan Batubara.

Warsa, U.C. 1994. Staphylococcus dalam Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran.

Binarupa Aksara. Jakarta

WHO.2014.Infection prevention and control of epidemic- and pandemic-prone

acute respiratory infections in health care