Protein HIF1a dan ekspresi mRNA sebagai penanda baru untuk estimasi interval post mortem

pada jaringan gingiva manusia

Abstrak
Memperkirakan interval post mortem (PMI) masih merupakan langkah penting dalam
Patologi Forensik. Meskipun beberapa metode tersedia untuk menilai PMI, perkiraan
yang tepat masih cukup tidak dapat diandalkan dan bisa jadi tidak akurat. Penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui distribusi imunohistokimia dan ekspresi mRNA dari faktor
yang diinduksi hipoksia (HIF-1a) pada jaringan gingiva post mortem untuk menetapkan
korelasi antara keberadaan HIF1a dan waktu sejak kematian, dengan tujuan akhir untuk
mencapai yang lebih akurat. Estimasi PMI. Sampel jaringan gingiva diperoleh dari 10
mayat pada PMI yang berbeda (1-3 hari, 4-5 hari dan 8-9 hari), dan diproses untuk
imunohistokimia dan reaksi berantai transkripsi-polimerase balik kuantitatif. Hasil
penelitian menunjukkan adanya korelasi ketergantungan waktu antara protein HIF-1a
dan mRNA dengan waktu yang berbeda sejak kematian, yang menunjukkan bahwa HIF-
1a merupakan penanda potensial untuk estimasi PMI. Hasil penelitian menunjukkan
sinyal protein HIF-1a tinggi yang terutama terlokalisasi di stratum basale mukosa mulut
dalam sampel yang dikumpulkan pada PMI singkat (1-3 hari). Ini secara bertahap
menurun dalam sampel yang dikumpulkan pada PMI sedang (4–5 hari), tetapi tidak
terdeteksi dalam sampel yang dikumpulkan pada PMI yang lama (8–9 hari). Hasil ini
sesuai dengan data mRNA. Data ini menunjukkan kegunaan potensial yang menarik
dari teknik berbasis Anatomi Forensik, seperti imunohistokimia, sebagai alat pelengkap
yang penting untuk digunakan dalam penyelidikan forensik. Kata kunci: anatomi
forensik; histopatologi forensik; HIF-1a; hipoksia; interval post mortem.

1. Pendahuluan
Post mortem interval (PMI) adalah jumlah waktu yang telah berlalu sejak saat
kematian, dan penentuannya selalu menjadi masalah mendasar dalam bidang forensik.
Dalam praktek forensik standar, PMI biasanya diperkirakan dengan menilai bukti yang
diberikan oleh tubuh itu sendiri, termasuk suhu, reaktivitas otot dan neuro-muskular,
lividitas post mortem, autolisis, pembusukan dan biokimia cairan, serta penanda
lingkungan. Namun, estimasi PMI tetap kontroversial, dan seringkali tidak mungkin untuk
menarik kesimpulan pasti tentang waktu kematian berdasarkan munculnya perubahan
post mortem tunggal (Di Maio & Dana, 2007; Madea, 2016).
Banyak pendekatan berbeda telah dieksplorasi dalam beberapa tahun terakhir,
dan literatur terus dikembangkan dengan strategi baru yang dianggap sebagai
dukungan tambahan sehingga nilai yang lebih akurat dapat diberikan dengan
menggunakan kombinasi metode yang berbeda (Henssege et al. 2000a, b ). Selama
beberapa dekade, analisis histologis dan imunohistokimia dari berbagai jaringan post
mortem menjadi semakin penting, karena dapat memberikan petunjuk tambahan yang
mungkin berguna dalam menentukan interval waktu setelah kematian (Thaik-Oo et al.
2002; Dettmeyer, 2011). Untuk jaringan gingiva, PMI telah dikaitkan dengan perubahan
histologis yang berbeda (Pradeep dkk. 2009; Yadav dkk. 2015; Mahalakshmi dkk. 2016),
tetapi perubahan imunohistokimia post mortem yang terkait tampaknya diabaikan.
Pengatur utama adaptasi seluler terhadap lingkungan hipoksia adalah faktor transkripsi,
faktor yang diinduksi hipoksia-1 (HIF-1; Eskandani et al.2017). Memang, HIF-1 adalah
faktor transkripsi heterodimerik yang terdiri dari dua subunit: HIF-1a (atau analognya
HIF-2a dan HIF-3a) dan subunit HIF-1b. HIF-1b diekspresikan secara konstitutif,
sedangkan HIF-1a adalah subunit yang sensitif terhadap oksigen, dan ekspresinya
diinduksi dalam kondisi hipoksia (Masoud & Lin, 2015; Eskandani et al. 2017). HIF-1a
secara konstitutif ditranskripsikan dan disintesis melalui serangkaian peristiwa
pensinyalan yang melibatkan beberapa faktor pertumbuhan dan molekul pensinyalan
lainnya (Masoud & Lin, 2015). Di bawah tekanan oksigen normal, ekspresi protein HIF-
1a diatur secara negatif oleh degradasi proteasomal dan ubiquitination di jalur yang
melibatkan protein von Hippel-Lindau (pVHL), protein penekan tumor dan salah satu
komponen yang dikenali dari ligase protein ubiquitin E3 (Masoud & Lin, 2015).
Hidroksilasi oleh prolyl-4-hydroxylases (PHDs) atau HIF-1 prolyl hydroxylases dari salah
satu dari dua residu prolin kritis dalam domain degradasi yang bergantung pada oksigen
memediasi interaksi mereka dengan kompleks ubiquitin ligase von Hippel-Lindau (VHL)
E3 yang menargetkan mereka untuk degradasi proteasomal cepat (Bruick & McKnight,
2001; Hirsila et al. 2005; € Ng et al. 2011; Masoud & Lin, 2015). Karena aksi hidroksilasi
dari PHD membutuhkan oksigen, lingkungan hipoksia akan menghambat aktivitas HIF-
P4Hs sehingga HIF-1a lolos dari degradasi, berpindah ke nukleus dan mengikat HIF-b;
dimer ini kemudian mengenali elemen responsif HIF dalam sejumlah gen target yang
diinduksi hipoksia (Bruick & McKnight, 2001; Hirsila et al. 2005; Masoud & Lin, 2015;
Vasconcelos € et al. 2016; Takedachi et al. 2017) .
Setelah kematian, tidak adanya aliran darah menyebabkan kekurangan oksigen
seluler yang cepat, sehingga penanda imunohistokimia yang berguna untuk
memperkirakan waktu kematian haruslah yang tidak ada dalam kondisi fisiologis dan
muncul dengan hipoksia (Cecchi et al. 2014). Berdasarkan observasi ini, tujuan dari
penelitian ini adalah untuk menilai ekspresi mRNA HIF-1a dan HIF-1a pada jaringan
gingiva manusia pada PMI yang berbeda.
2. Bahan dan Metode
Kasus
Sepuluh sampel jaringan gingiva (0,5-1 cm2) dikumpulkan dari gingiva rahang
atas yang berdekatan dengan gigi seri pertama selama otopsi mediko-legal dari mayat
dari kedua jenis kelamin, dengan usia berkisar antara 18 sampai 60 tahun. PMI berkisar
antara 1 dan 10 hari. Sampel jaringan gingiva hanya dalam kasus kematian terkait
trauma, ketika gingiva pada pemeriksaan tidak menunjukkan perubahan transformatif,
traumatis atau phlogistik. Dalam semua kasus yang diinvestigasi, waktu kematian sudah
diketahui. Sampel kontrol adalah biopsi gingiva yang dilakukan pada individu yang
secara klinis sehat selama prosedur pencabutan gigi bungsu dan hanya jika inflamasi
gingiva dikeluarkan. Berdasarkan PMI, sampel dikelompokkan ke dalam kategori yang
berbeda, seperti yang dijelaskan pada Tabel 1. Kelompok pertama terdiri dari sampel
dengan PMI yang diketahui mulai dari 1 hingga 3 hari (PMI pendek - SPMI), kelompok
kedua sampel dengan diketahui PMI 4 sampai 5 hari (PMI sedang - MPMI) dan
kelompok ketiga sampel dengan diketahui PMI 8 sampai 9 hari (lama PMI - LPMI).
 sampel
Pengumpulan dan pemrosesanUntuk analisis imunohistokimia, jaringan gingiva
segera difiksasi setelah pengumpulan dalam formaldehida 4% (Sigma Aldrich, St Louis,
MO, USA) dalam larutan saline buffer fosfat (PBS) selama 24 jam pada suhu 4 ° C;
mereka kemudian didehidrasi dalam serangkaian etanol bertingkat dan tertanam dalam
lilin parafin (Fluka, Sigma-Aldrich). Bagian parafin 6 lm diperoleh dengan mikrotom putar
otomatis (Leica Microsystems Srl, Cambridge, UK) dan dikumpulkan pada slide kaca
Superfrost (Carl Roth, Karlshure, Jerman). Untuk analisis ekspresi mRNA, jaringan
gingiva dikumpulkan, dan segera dibekukan dan disimpan pada suhu 80 ° C sampai
RNA diisolasi.
imunohistokimia di
Bagian parafindewax dan dicuci tiga kali selama 5 menit dengan PBS pada pH
7,4. Aktivitas peroksidase endogen diblok dengan 3% H2O2 (diencerkan dalam air
suling) pada suhu kamar (RT) selama 15 menit. Pengikatan antibodi non-spesifik diblokir
dengan susu blok protein (Invitrogen, Thermo Fischer Scientific, Monza, Italia) selama
30 menit di RT. Bagian diinkubasi dengan antibodi primer terhadap HIF-1a (Invitrogen,
Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), diencerkan 1: 500 dalam larutan pemblokiran,
pada suhu 4 ° C semalam. Untuk mendeteksi reaksi antigen-antibodi, digunakan
antibodi anti-kelinci sekunder, diikuti dengan diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)
sebagai larutan substrat (kit pewarnaan Histofine Immunohistochemical, Nichirei
Biosciences, Tokyo, Japan). Kontrol negatif dilakukan dengan menghilangkan antibodi
primer, dan menghilangkan antibodi primer dan sekunder diikuti oleh DAB. Beberapa
bagian diwarnai dengan hematoksilin dan eosin mengikuti petunjuk pabrik (Sigma
Aldrich, St Louis, MO, USA). Semua sampel diamati di bawah mikroskop cahaya
menggunakan Eclipse E800 Nikon (Nikon, Tokyo, Jepang). Gambar perwakilan
ditampilkan. Analisis kuantitatif dari area bernoda antibodi, yang dinyatakan sebagai
jumlah relatif jaringan gingiva dari mayat dibandingkan dengan dari donor yang sehat,
dinilai dengan penghitungan area dari lima bidang untuk masing-masing dari tiga slide
per sampel pada perbesaran 609 di Leica Qwin 3.0 perangkat lunak (Leica
Microsystems Srl, Cambridge, UK), yang memungkinkan area noda antibodi dipilih dan
diukur.
Ekstraksi mRNA dan reaksi berantai polimerase-transkripsi balik kuantitatif
(qRT-PCR)
RNeasy Mini Kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) digunakan
untuk mengekstrak RNA dari jaringan gingiva, dan 200 ng dari total RNA
ditranskripsikan menjadi cDNA untai pertama menggunakan SuperScriptTM III One-Step
RT-PCR System (Invitrogen , Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia). Tingkat ekspresi
mRNA HIF-1a dianalisis menggunakan PCR waktu nyata oleh mesin PCR 7500 Waktu
Nyata (Applied Biosystems, Life Technologies, Monza, Italia). Untuk penghitungan
mRNA, uji TaqMan (Life Technologies, Thermo Fischer Scientific, Monza Italy) khusus
untuk HIF-1a (HIF-1a; Hs00153153_m1) digunakan. Tingkat ekspresi gen relatif
dinormalisasi dengan gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase (GAPDH;
Hs99999905_m1). Data disajikan sebagai perubahan lipat relatif terhadap level dalam
sampel kontrol dengan menggunakan rumus, 2DDCT, seperti yang direkomendasikan
oleh pabrikan (Buletin Pengguna nomor 2 P / N 4303859; Biosistem Terapan).

Analisis statistik Analisis

morfometrik gambar imunohistokimia dan nilai PCR waktu nyata disajikan
sebagai mean SD, dan setiap jenis percobaan diulang tiga kali. Uji-t Student dengan
koreksi Welch diterapkan untuk mengevaluasi perbedaan antara kelompok. Analisis
statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 5.0
(Perangkat Lunak GraphPad, San Diego, CA, USA). Nilai P <0,05 dianggap signifikan
secara statistik.

5. Diskusi
Menetapkan PMI sangat penting dalam praktik forensik, karena memungkinkan
momen kematian diperkirakan secara retrospektif. Kapasitas untuk memperkirakan
waktu kematian tetap terbatas, dan setiap metode berpotensi mengalami kesalahan;
Namun, literatur terus dikembangkan dengan strategi baru dan inovatif yang menyoroti
semua kemungkinan perubahan yang dapat diidentifikasi yang mungkin terjadi setelah
kematian dimana nilai temporal dapat dianggap berasal (Henssege & Madea, 2004).
Dalam studi ini, kadar protein HIF-1a dan mRNA diselidiki dalam spesimen gingiva untuk
menilai apakah mungkin ada pola ekspresi terkait dengan PMI yang berbeda. Gingiva
dipilih untuk mempelajari ekspresi mRNA HIF-1a dan HIF-1a karena metode
pengambilan sampelnya cepat, sederhana dan tidak mutilasi. Selain itu, gingiva
biasanya dilindungi dari jaringan labial, sehingga membatasi dampak faktor lingkungan,
yang dapat menyebabkan kerusakan jaringan yang cepat. Dengan demikian, jaringan
gingiva, sebagai daerah yang lebih stabil untuk investigasi, merupakan pilihan yang
paling sesuai untuk analisis protein dan mRNA. Akhirnya, ekspresi HIF-1a tampaknya
terkait dengan kerusakan sel morfologis bersamaan (Zhu et al. 2008) terkait dengan
hipoksia. Memang, ekspresi HIF telah dikaitkan dengan berbagai penyebab kematian di
berbagai organ, target khusus hipoksia. Secara khusus, peningkatan ekspresi HIF telah
diamati: di jaringan miokard dalam kasus iskemia miokard (Blanco Pampın et al. 2006)
atau kematian jantung (Zhu et al. 2008); di paru-paru dalam kasus asfiksia mekanis
(Cecchi et al. 2014); dan di ginjal, terutama dalam kasus kegagalan sirkulasi akut (Zhao
et al. 2006). Namun, sepengetahuan kami, jaringan gingiva bukanlah target spesifik
hipoksia pada periode peri mortem; dengan demikian, tidak ada alasan untuk
menghipotesiskan pola hipoksia yang berbeda terkait dengan ekspresi HIF-1a di
jaringan gingiva yang terkait dengan penyebab kematian tertentu. Menurut penelitian
sebelumnya (Takedachi et al. 2017), dalam sampel post mortem kami, imunostaining
HIF-1a lebih tinggi di epitel oral daripada di jaringan ikat sub-oral, sehingga
mencerminkan distribusi in vivo yang diamati pada tikus di bawah kondisi peradangan
hipoksia. Menariknya, seperti yang ditunjukkan pada sel epitel dalam model tikus, di
mana tingkat ekspresi HIF-1a relatif lebih tinggi di lapisan suprabasal, hasil kami
menunjukkan reaktivitas pewarnaan yang tinggi untuk HIF-1a yang dapat dideteksi di
lapisan yang lebih dalam dari mukosa mulut dan menurun secara bertahap di lapisan
yang lebih dangkal. Hasil ini dapat dikaitkan dengan fakta bahwa lapisan sel basal
memiliki tingkat kerentanan yang lebih tinggi terhadap kekurangan oksigen, sedangkan
di lapisan atas, aktivitas seluler berkurang dengan hilangnya organel nukleus dan
sitoplasma.
Mempertimbangkan pola ekspresi HIF-1a, immunostaining tidak ada pada
kelompok kontrol (waktu = 0), memuncak pada 1-3 hari (sampel SPMI), dan secara
bertahap menurun pada 4–5 dan 8–9 hari setelah kematian (LPMI sampel). Temuan ini
konsisten dengan pola ekspresi yang diamati untuk faktor pertumbuhan endotel
vaskular, penanda terkait hipoksia imunohistokimia serupa, yang levelnya dalam
jaringan organ yang berbeda diukur untuk memperkirakan PMI (Thaik-Oo et al. 2002).
Puncak ekspresi HIF-1a yang terjadi dalam 3 hari setelah kematian dapat dijelaskan
oleh gangguan post mortem aliran darah yang menyebabkan keadaan kekurangan
oksigen seluler yang berkepanjangan, yang sebanding dengan stres iskemik kronis (Zhu
et al. 2008), dengan ekspresi HIF-1a bersamaan. Penurunan selanjutnya dari
imunostaining HIF-1a mungkin terkait dengan nekrosis seluler dan terkait dengan proses
transformatif dengan degradasi HIF-1a bersamaan dengan gangguan nuklir (Kitanaka &
Kuchino, 1999). Studi lain pada jaringan miokard (Zhu et al. 2008) dan ginjal (Zhao et al.
2006) menunjukkan bahwa HIF-1a adalah penanda hipoksia yang baik karena
ekspresinya tidak bergantung pada jenis kelamin, usia dan waktu sejak kematian. Poin
terakhir ini tampaknya kontras dengan hasil kami; Namun, berbeda dengan studi pada
jaringan miokard (Zhu et al. 2008) dan ginjal (Zhao et al. 2006), sampel yang kami teliti
juga mempertimbangkan PMI lebih dari 2 hari untuk jaringan gingiva, menyoroti puncak
ekspresi HIF1a yang terjadi pada 3 hari. setelah kematian dan secara bertahap menurun
sampai PMI selama 9 hari. Studi terbaru menunjukkan bahwa RNA lebih stabil daripada
yang diperkirakan sebelumnya; Oleh karena itu, banyak digunakan sebagai alat yang
berharga dalam patologi forensik, termasuk dalam mengidentifikasi cairan tubuh,
memperkirakan usia noda biologis dan mempelajari mekanisme kematian (Sampaio-
Silva et al. 2013). Miskin dkk. (2016) menunjukkan bahwa RNA yang diekstraksi dari
jaringan rongga mulut menunjukkan degradasi RNA tergantung waktu yang rendah
hingga 21 hari; karena alasan ini, ini merupakan kandidat ideal untuk estimasi PMI.
Kami berhasil mengekstraksi RNA dari sampel post mortem hingga 9 hari, dan analisis
qRT-PCR menunjukkan amplifikasi ekspresi mRNA HIF-1a dalam sampel SPMI dan
MPMI. Namun, tidak ada sinyal yang terdeteksi dalam sampel LPMI, yang sesuai
dengan sinyal lemah dari protein yang dievaluasi dengan imunohistokimia. Singkatnya,
dari hasil kami, kami dapat menyimpulkan bahwa jaringan gingiva menunjukkan
hubungan antara tingkat ekspresi mRNA HIF-1a dan HIF-1a dan waktu berlalu dari
kematian yang dapat berfungsi sebagai dasar tambahan untuk estimasi PMI. Secara
rinci, penelitian kami menunjukkan bahwa SPMI dan MPMI ditandai dengan peningkatan
ekspresi protein HIF-1a dibandingkan dengan LPMI, di mana ekspresi protein tidak lagi
dapat dideteksi. Metode yang disarankan adalah alat yang menjanjikan untuk
membedakan kematian yang terjadi dalam 1 minggu dari kematian yang terjadi lebih
dari 1 minggu yang lalu. Meskipun studi konfirmasi lebih lanjut diperlukan, hasil ini
tampaknya menggembirakan dan menunjukkan bahwa pendekatan ini, yang didasarkan
pada metodologi imunohistokimia dan morfologi, mungkin memiliki potensi tinggi untuk
menjadi alat yang berguna, alternatif yang berharga atau tambahan untuk metode lain
dalam forensik. Batasan PMI. Selanjutnya, dengan menggunakan teknik Anatomi
Forensik dasar ini, identifikasi penanda baru dan parameter morfologi dapat menjadi alat
pelengkap yang penting dalam Patologi Forensik tradisional.