KEPANITERAAN KLKINIK

ILMU FORENSIK DAN MEDIKOLEGAL

Journal Reading

“Postmortem interval determination using mRNA markers and DNA

normalization”
Duo Peng, Meili Lv, Zhilong Li, Huan Tian, ShengQiu Qu, Bo Jin, Bing Long, Weibo Liang, Lin
Zhang (2019)

OLEH:
Rifqie Fathiarsya Courie
H1A320001

PEMBIMBING
dr. Arfi Syamsun, Sp. KF, M.Si.Med

DALAM RANGKA MENGIKUTI KEPANITERAAN KLINIK MADYA

BAGIAN/SMF ILMU FORENSIK DAN MEDIKOLEGAL
RUMAH SAKIT UMUM DAERAH PROVINSI NTB
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS MATARAM
2022
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
berkah dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan penulisan journal reading yang
berjudul ”Postmortem interval determination using mRNA markers and DNA
normalization” ini tepat pada waktunya. Journal reading ini disusun dalam rangka
mengikuti Kepaniteraan Klinik Madya di Bagian Ilmu Forensik dan Medikolegal RSUD
Provinsi NTB. Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada dr. Arfi Syamsun, Sp.KF, M.Si.Med selaku pembimbing
karena telah memberikan masukan dan saran dalam penyelesaian tugas. Penulis
menyadari bahwa dalam penulisan journal reading ini masih banyak kekurangan.
Oleh karena itu, kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan
demi kesempurnaan journal reading ini. Semoga journal reading ini dapat
memberikan manfaat dan tambahan pengetahuan khususnya kepada penulis dan
kepada pembaca dalam menjalankan praktik sehari-hari sebagai dokter. Terima
kasih.

Mataram, Januari 2022

Penyusun
 IDENTITAS JURNAL

Nama Penulis : Duo Peng, Meili Lv, Zhilong Li, Huan Tian, ShengQiu Qu, Bo Jin,
Bing Long, Weibo Liang, Lin Zhang

Judul Artikel : Postmortem interval determination using mRNA markers and DNA
normalization

Jurnal Asal : International Journal of Legal Medicine

Waktu Terbit : 2019

Jenis Artikel : Cross-sectional

DOI : https://doi.org/10.1007/s00414-019-02199-7
Postmortem interval determination using mRNA markers and DNA normalization

Abstrak

Penetapan Postmortem Interval (PMI) merupakan bagian penting dari

penyidikan tindak pidana, namun masih mengandung ketidakpastian. Degradasi
mRNA dalam penentuan PMI telah dipelajari dalam pembusukan; namun, beberapa
penelitian melaporkan tidak ada korelasi antara PMI dan degradasi RNA. Dengan
demikian, peneliti bertujuan untuk menentukan apakah terdapat korelasi antara
kuantitas RNA dengan PMI. Jaringan jantung dan otak dipisahkan dari model tikus
dengan PMI 0-48 jam dengan 29 titik waktu. Peneliti kemudian mengekstraksi DNA
dan RNA dalam satu tabung dengan kit koekstraksi Bioteke dan memilih beberapa
penanda mRNA yang terkait dengan hipoksia sel dan apoptosis sebagai gen target,
seperti Hypoxia-associated Factor (HAF), Apoptosis-inducing Factor (AIF),
Hypoxia-inducible Factor 2 alpha (HIF2a), dan Factor inhibiting HIF (FIH). Peneliti
mengukur jumlah penanda ini menggunakan real-time quantitative PCR (qPCR), dan
D-NA Caspase-3 dan 18S masing-masing digunakan untuk normalisasi. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa pada jaringan jantung, degradasi HIF2a, AIF, dan FIH
berkorelasi dengan PMI, demikian pula degradasi HIF2a, FIH, dan AIF pada jaringan
otak ketika dinormalisasi dengan DNA Caspase-3. Namun, ketika dinormalisasi
dengan 18S, hanya degradasi HIF2a di jaringan otak yang berkorelasi dengan PMI.
Menariknya, jumlah HAF dalam jaringan otak ditemukan meningkat setelah kematian
dengan normalisasi DNA 18S atau Caspase-3, dan secara signifikan berkorelasi
dengan 0-48 jam PMI. Hasil ini menunjukkan bahwa kuantitas mRNA dapat
digunakan untuk menentukan PMI dan DNA Caspase-3 layak untuk estimasi PMI.
Singkatnya, kami membuat model matematika untuk penentuan PMI menggunakan
beberapa penanda mRNA dan beberapa jaringan dan penelitian lebih lanjut
diperlukan untuk memvalidasi dan menyelidiki penanda ini dan model matematika
dalam jaringan manusia.

Kata kunci : penentuan PMI, Koekstraksi DNA dan RNA, Degradasi, Penanda
mRNA
Pendahuluan

Postmortem interval (PMI) adalah masalah penting dalam ilmu forensik dan
dapat digunakan untuk memperkirakan secara retrospektif saat kematian, yang
penting bagi polisi sebagai titik awal untuk penyelidikan mereka. Metode dan proses
konvensional digunakan untuk memperkirakan PMI, seperti skor dekomposisi dan
proses fisik atau fisikokimia (pendinginan tubuh, lividitas postmortem, rigor mortis,
dan keteraturan supravital otot rangka). Namun, metode ini hanya digunakan untuk
memperkirakan PMI yang relatif pendek dengan jendela estimasi yang lebar. Pada
tahun 2003, Bauer et al. melaporkan bahwa degradasi mRNA adalah indikator yang
mungkin untuk estimasi PMI, dan kemudian dalam beberapa tahun terakhir, degradasi
RNA terbukti berkorelasi dengan PMI menggunakan nomor integritas RNA (RIN)
dan PCR kuantitatif (qPCR). Namun, Heinrich et al. menunjukkan bahwa tidak ada
korelasi antara PMI dan degradasi RNA, dan Van melaporkan bahwa hubungan
antara degradasi RNA dan PMI tidak dianjurkan. Dengan demikian, peneliti bertujuan
untuk menentukan apakah ada hubungan antara kuantitas RNA dan PMI. Sethi dan Li
melaporkan bahwa miRNAs memiliki stabilitas terbatas dalam interval postmortem
pendek dari jaringan otak manusia; karenanya, peneliti bertujuan untuk
mengeksplorasi hubungan antara mRNA dan 0-48 jam PMI.

Setelah kematian, tidak adanya aliran darah mengakibatkan kekurangan

oksigen seluler dan mempercepat proses apoptosis sel. Hypoxia inducible factor 1
alpha (HIF1a), yang terlibat dalam kekurangan oksigen seluler, dilaporkan menjadi
penanda untuk estimasi PMI. Jadi, dalam penelitian ini, peneliti menyelidiki
hubungan antara PMI dan beberapa mRNA lain yang terkait dengan kekurangan
oksigen seluler. Selain itu, tidak ada penelitian yang meneliti korelasi antara PMI dan
mRNA yang terkait dengan apoptosis. Oleh karena itu, mRNA dari HIF2a (subunit
lain dari HIF), Hypoxia-associated Factor (HAF), Factor Inhibiting HIF (FIH),
Apoptosis-inducing Factor (AIF) dimasukkan dalam penelitian ini. Selain itu, peneliti
merancang primer yang berbeda untuk HIF2a untuk menghasilkan amplikon yang
lebih besar (HIF2a-L: 365 bp) dan amplikon yang lebih kecil (HIF2a-S: 79 bp) untuk
pengujian awal terhadap kerentanannya untuk penentuan PMI.
Real-time qPCR adalah metode yang baik untuk mendeteksi profil RNA, dan
secara luas digunakan dalam penentuan PMI. Berbagai jenis RNA seperti rRNA,
snRNA, microRNAs, dan circRNAs telah digunakan untuk normalisasi dalam
estimasi PMI. Dalam penelitian PMI sebelumnya, peneliti menggunakan DNA untuk
menormalkan mRNA di qPCR, dan ekspresi mRNA ditemukan berkorelasi dengan
PMI. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, peneliti menggunakan DNA (Caspase-3)
sebagai gen normalisasi untuk memvalidasi kelayakannya dalam penentuan PMI.
Dalam penelitian ini, peneliti bertujuan untuk menyelidiki jumlah mRNA HIF2a,
HAF, FIH, dan AIF dalam PMI 0-48 jam dengan qPCR dan mengevaluasi
kelayakannya menggunakan DNA Caspase-3 sebagai gen normalisasi dalam estimasi
PMI. Untuk meningkatkan efisiensi pemanfaatan sampel, peneliti mengekstraksi
DNA dan RNA dengan kit koekstraksi Bioteke dari jaringan jantung dan otak tikus
selama 0-48 jam PMI dengan 29 titik waktu. Setelah mendeteksi penanda mRNA,
18S, dan DNA Caspase-3 dengan qPCR, peneliti akhirnya membangun model
matematika untuk penentuan PMI menggunakan beberapa penanda mRNA dan
berbagai jaringan.

Metode dan Material

Pengumpulan sampel

Sebanyak 87 tikus dewasa sehat C57BL/6 digunakan dalam penelitian ini, dan
mereka dikorbankan dengan dilakukan dislokasi serviks setelah dibius. Tikus-tikus ini
diperoleh dari Animal Experimental Center of Basic Science and Forensic Medicine
di Universitas Sichuan, dan penggunaannya telah disetujui oleh Applied Science
Ethics Panel of Sichuan University. Model tikus dibuat dengan menginkubasinya
pada suhu 37 °C dan kemudian mendapatkan jaringan otak (n = 3) dan jantung (n = 3)
pada setiap titik waktu PMI. Interval titik waktu setidaknya 0,5 jam, dan total 29 titik
waktu (0 jam, 0,5 jam, 1,0 jam, 1,5 jam, 2,0 jam, 2,5 jam, 3,0 jam, 3,5 jam, 4,0 jam,
4,5 jam, 5,0 jam , 5,5 jam, 6,0 jam, 7,0 jam, 8,0 jam, 9,0 jam, 10,0 jam, 11,0 jam, 12,0
jam, 13,0 jam, 14,0 jam, 15,0 jam, 16,0 jam, 18,0 jam, 20,0 jam, 22,0 jam, 24,0 jam,
36,0 jam, 48,0 jam) dimasukkan dalam penelitian ini. Sampel jantung (n = 87) dan
otak (n = 87) yang dikumpulkan disimpan pada suhu - 80 °C hingga penggunaan
lebih lanjut.

Ekstraksi asam nukleat dan sintesis cDNA

Asam nukleat (DNA dan RNA) diekstraksi bersama dari 25 ± 3 mg jaringan

jantung dan otak (n = 87 untuk masing-masing) dalam satu tabung menggunakan kit
koekstraksi Bioteke (Bioteke, Beijing, Cina). Semua proses dilakukan sesuai dengan
instruksi yang diberikan oleh produsen kit. Selanjutnya, RNA adalah transkrip
terbalik dengan primer acak menggunakan kit Sintesis cDNA RevertAid First Strand
(Thermo, CA, USA) pada instrumen PCR gradien nexus Mastercycler® (Eppendorf,
Hamburg, Jerman). Dalam total volume 10 μL, reaksi transkripsi balik mengandung
μ1 L koekstraksi dan 2 μL buffer reaksi, 1 μL campuran dNTP, 0,5 μL primer heksamer
acak, 0,5 μL RevertAid RT, 0,5 μL RiboLock RNase Inhibitor, dan 4,5 μL RNase-free
water. Kontrol negatif dimasukkan dalam reaksi transkripsi terbalik.

Desain primer
Primer RNA dan DNA dirancang menggunakan Primer Premier software
v5.0. Primer untuk DNA Caspase-3 ditempatkan di intron untuk mencegah
amplifikasi RNA. Pasangan primer mRNA (setidaknya satu primer) dirancang untuk
menjangkau dua ekson untuk menghindari amplifikasi DNA. Kemudian, primer ini
kemudian dianalisis dengan UCSC. Dua amplikon panjang yang berbeda dari HIF2a
(HIF2a-L: 365 bp dan HIF2a-S: 79 bp) dirancang untuk pengujian awal terhadap
pengaruh panjang pada penentuan PMI. Selain itu, reaksi transkripsi balik tanpa
penambahan enzim RevertAid RT (minus reverse transcription) juga dilakukan untuk
menilai kekhususan primer yang dirancang oleh peneliti.]

Real-time quantitatve PCR

 DNA dan cDNA dikuantifikasi oleh SYBR Green dengan primer spesifik pada
instrumen ABI 7500 (Thermo, CA, USA). Volume reaksi adalah 10 L, yang berisi 5 L
SYBR Green mix, masing-masing 1 L primer maju dan mundur (forward dan reverse),
1 L cDNA atau DNA, dan 2 L RNase-free water. Kondisi reaksi kuantifikasi adalah
95 °C selama 15 menit dan 40 siklus dengan 94 °C selama 15 detik, 57 °C selama 30
detik (FIH adalah 62 °C), dan 72 °C selama 34 detik. Setiap reaksi qPCR dilakukan
dalam rangkap tiga. Kontrol negatif A Int J Legal Med disertakan di setiap pelat.
Kurva leleh masing-masing primer dikumpulkan untuk memastikan bahwa hanya ada
satu produk dalam qPCR. Semua produk primer ini divalidasi menurut panjangnya
dengan elektroforesis gel poliakrilamida. Untuk memverifikasi bahwa DNA Caspase-
3 tidak terpengaruh oleh transkripsi terbalik, Caspase-3 diukur sebelum dan sesudah
transkripsi terbalik.

Analisis Data
Nilai Cq dihitung menggunakan software ABI 7500 System SDS v1.4.
Peneliti pertama-tama mengevaluasi stabilitas gen 18S, Caspase-3 DNA, dan mRNA
HIF2a-S, FIH, AIF, dan HAF dengan RefFinder, alat untuk menilai gen referensi
yang andal untuk analisis ekspresi gen. Kemudian diperoleh nilai dCq sebagai
berikut: dCq = Cqtarget – Cqnormalization. Korelasi dan hubungan 0-48 jam PMI
dan ekspresi mRNA (nilai dCq) kemudian dihitung menggunakan GraphPad 7.0 dan
MATLAB 2016a. Kurva fit nonlinier digunakan untuk membangun model
matematika PMI dan ekspresi setiap mRNA tunggal. Model dengan nilai R tertinggi
dipilih sebagai model matematika yang optimal. Pada akhirnya, peneliti
menggunakan model bertahap untuk membangun PMI penentuan model matematika
menggunakan jantung dan otak jaringan dan beberapa penanda.

Hasil dan Pembahasan

Dalam studi ini, dua yang berbeda jaringan jantung dan otak dimasukkan
karena mereka telah diusulkan untuk menjadi jaringan yang cocok untuk analisis
mRNA dan estimasi PMI. Primer yang dirancang menggunakan perangkat lunak
Primer Premier v5.0 tercantum pada Tabel 1; primer ini dianalisis dengan UCSC, dan
produk qPCR divalidasi dengan elektroforesis gel poliakrilamida (data tidak
ditampilkan). Kurva leleh tunggal dari setiap primer dikumpulkan dalam qPCR dan
pita tunggal diperoleh dari elektroforesis gel poliakrilamida (data tidak ditampilkan).
Terlebih lagi, ketika produk reaksi transkripsi balik minus digunakan sebagai
template qPCR, sinyal Caspase-3 dikumpulkan sebagai pengganti penanda RNA
lainnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa primer Caspase-3 spesifik untuk DNA
dan primer lainnya spesifik untuk RNA. Hasil ini tidak hanya memverifikasi primer
yang digunakan dalam penelitian kami tetapi juga menunjukkan bahwa DNA dan
RNA berhasil diekstraksi bersama dengan kit koekstraksi Bioteke. Posisi relatif
HIF2a-S dan HIF2a-L ditunjukkan pada Gambar 1.
Tabel 1. Primer untuk mRNA, DNA Caspase-3, dan 18S
Penanda Ukuran Forward primer (5’-3’) Reverse primer (5’ – 3’)
(bp)
HIF2a-S 79 GGGACGGTCATCTACAAC TCTCGATCTCACTCAGCA
(mRNA)
HIF2a-L 365 CAAGGGGCAGGTGGTATC TCTGGCTTCCGAAATCGA
(mRNA)
AIF 63 CAATCAGTTGGAGTCAGC TACCTTCCTTCCATCTTT
(mRNA)
HAF 105 GTGAAAGACCATTGCAGC TTTCCCAGTGAGGTGTTC
(mRNA)
FIH 156 AGGAAATGTGACACCTGCTC AAGTCCACCTGGCTCTGC
(mRNA)
Caspase-3 157 ATGTGGGGCCATCGTTACAG CACCAGGTTGTCACAGGGTT
(DNA)
18S 127 TTCTGGCCAACGGTCTAGACAAC CCAGTGGTCTTGGTGTGCA
(rRNA)

Caspase-3 sangat penting untuk proses tertentu yang terkait dengan

pembongkaran sel dan pembentukan badan apoptosis, dan telah dipelajari secara luas.
Namun, penggunaan DNA Caspase-3 untuk normalisasi dalam estimasi PMI belum
dilaporkan; oleh karena itu, dalam penelitian ini, pertama-tama peneliti mengevaluasi
stabilitas DNA dan mRNA menggunakan alat RefFinder. Alat RefFinder
memanfaatkan program komputasi (seperti BestKeeper, geNorm, Normfinder, atau
metode delta-CT komparatif) untuk memberi peringkat dan membandingkan kandidat
gen referensi. Software ini mengukur rata-rata geometrik dari bobot yang dikaitkan
untuk peringkat akhir keseluruhan. Dan itu dapat mengevaluasi dan memilih gen
referensi dari kumpulan data eksperimental yang luas. Nilai Cq dari semua sampel
diperoleh dengan software SDS, dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1 dan Tabel 2.
Hanya satu sampel (No. H87, PMI = 48 jam, Tabel 2) tidak terdeteksi dengan
HIF2a-L. Jadi, dalam evaluasi stabilitas gen dengan RefFinder, peneliti
membandingkan 18S, Caspase-3 DNA, HIF2a-S, FIH, AIF, dan HAF, dan peringkat
komprehensif ditunjukkan pada Gambar 1. Di jaringan otak dan jantung, 18S adalah
gen yang paling stabil, dan DNA Caspase-3 masing-masing adalah yang ketiga dan
kedua yang paling stabil. Peringkat stabilitas gen 18S dan Caspase-3 menunjukkan
bahwa salah satunya dapat digunakan sebagai gen referensi dalam penelitian kami.
Selain itu, temuan kami bahwa 18S adalah gen yang paling stabil konsisten dengan
hasil penelitian lain.

a
 b

Gambar 1. Peringkat stabilitas gen komprehensif di otak dan jaringan jantung. Karena
HIF2a-L tidak terdeteksi pada sampel No. H87, kami mengurutkan penanda lain di jaringan
otak (a) dan jaringan jantung (b) dengan RefFinder
Dalam penelitian ini, peneliti mengekstraksi DNA dan RNA dalam satu
tabung; dengan demikian, DNA dan RNA secara bersamaan mengalami transkripsi
terbalik. Secara teori, DNA Caspase-3 tidak berpartisipasi dalam transkripsi terbalik,
dan jumlah DNA diencerkan oleh volume reaksi transkripsi balik. Untuk
memverifikasi bahwa DNA Caspase-3 tidak terpengaruh oleh transkripsi balik,
peneliti menghitung nilai Cq yang berbeda sebelum dan sesudah transkripsi terbalik.
Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 3. Nilai terukur dan teoretis berbeda 0,5,
menunjukkan bahwa DNA Caspase-3 tidak terpengaruh oleh transkripsi terbalik
kecuali untuk pengenceran. Sedangkan sinyal qPCR dengan Caspase-3 sebelum
transkripsi terbalik juga menunjukkan bahwa primer Caspase-3 spesifik untuk DNA.
Berdasarkan peringkat stabilitas gen pada Gambar 1 dan temuan bahwa DNA
Caspase-3 tidak terpengaruh dalam transkripsi terbalik (Tabel 3), peneliti memilih
DNA Caspase-3 dan 18S untuk normalisasi masing-masing dalam penelitian ini.
Kemudian, dengan menggunakan persamaan dCq = Cqtarget – Cqnormalization,
peneliti menghitung nilai dCq dari semua sampel. Korelasi antara 0-48 jam PMI dan
setiap penanda mRNA dihitung dan ditunjukkan pada Gambar 2 (jaringan otak) dan
3 (jaringan jantung).
Seperti ditunjukkan pada Gambar 2, nilai dCq dari HIF2a-S dan HIF2aL
dalam jaringan otak meningkat dari waktu ke waktu setelah kematian, menunjukkan
bahwa HIF2a-S dan HIF2a-L terdegradasi dalam 0-48 jam PMI. Hubungan ini
mengungkapkan bahwa degradasi HIF2a-S dan HIF2a-L berkorelasi dengan PMI
(Gambar 2a, b). Namun, ekspresi HAF menurun setelah kematian dan ditemukan
terkait dengan PMI dengan normalisasi 18S atau Caspase-3 (Gambar 2c). Selain itu,
tidak ada korelasi yang signifikan antara PMI dan ekspresi AIF ketika dinormalisasi
dengan 18S (P > 0,05). Namun, ekspresi penanda AIF secara signifikan berkorelasi
dengan 0-48 jam PMI ketika dinormalisasi dengan Caspase-3 (Gambar 2d), seperti
halnya penanda FIH (Gambar 2e). Model matematika tercantum dalam Tabel 2, dan
semuanya polinomial kubik. Nilai R model matematika dengan normalisasi Caspase-3
sebanding dengan yang dengan normalisasi 18S. Hasil ini menunjukkan bahwa pada
jaringan otak, DNA Caspase-3 layak digunakan dalam penentuan PMI dengan
penanda mRNA.
X mewakili titik waktu lg, dan Y mewakili dCq penanda
Semua mRNA di jaringan jantung dinormalisasi dengan 18S dan dengan
Caspase-3, dan hubungan antara PMI dan ekspresi penanda mRNA ditunjukkan pada
Gambar. 3. model matematika dengan nilai R tertinggi untuk setiap penanda
tercantum pada Tabel 3. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, ekspresi HIF2a-
S, HIF2a-L, AIF, dan FIH di jaringan jantung menurun setelah kematian, dan nilai P
berkorelasi secara signifikan dengan 0-48 jam PMI, sedangkan nilai P untuk HAF
tidak berkorelasi ketika dinormalisasi dengan 18S atau Caspase-3. Nilai R model
(Tabel 3) sedikit lebih tinggi ketika dinormalisasi dengan 18S kecuali untuk HIF2a-L,
yang konsisten dengan hasil jaringan otak. Oleh karena itu, disimpulkan bahwa
Caspase-3 dapat digunakan untuk menormalkan penanda mRNA untuk estimasi PMI.
X mewakili titik waktu lg, dan Y mewakili dCq penanda
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, di jaringan otak, peringkat koefisien
korelasi antara PMI dan ekspresi penanda adalah HIF2a-S > HIF2a-L > HAF ketika
dinormalisasi dengan 18S dan HIF2a-S > HIF2a-L > HAF > FIH > AIF bila
dinormalisasi dengan Caspase-3. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3, peringkat
untuk koefisien korelasi dalam jaringan jantung adalah HIF2a-S > HIF2a-L > AIF >
FIH dengan normalisasi 18S atau Caspase-3. Di kedua jaringan jantung dan otak,
HIF2a ditemukan memiliki hubungan terkuat dengan PMI terlepas dari ukuran
fragmen, menunjukkan bahwa degradasi HIF2a merupakan indikator yang baik untuk
penentuan PMI.

Gambar 2. Korelasi antara 0-48 h PMI dan penanda mRNA di jaringan otak ketika dinormalisasi
dengan 18S dan Caspase-3, masing-masing. Korelasi antara 0–48 jam PMI dan HIF2a-S ditunjukkan
pada (a), HIF2a-L pada (b), HAF pada (c), AIF pada (d), dan FIH pada (e). Nilai P> 0,05 ditunjukkan
dengan warna merah

HIF1a dan HIF2a dianggap sebagai isoform Hypoxia-inducible Factor alpha

(HIFa) utama yang memediasi program transkripsi HIF positif, yang memungkinkan
respon cepat terhadap hipoksia. Degradasi HIF1a dilaporkan berkorelasi dengan
estimasi PMI dalam studi PMI kami sebelumnya dan oleh kelompok penelitian lain.
Namun, HIF2a juga menunjukkan degradasi pada 0-48 jam PMI dan berkorelasi
dengan estimasi PMI. Seperti dapat dilihat dari posisi relatif fragmen HIF2a-S dan
HIF2a-L (Gambar 1), fragmen HIF2a-S dikelilingi oleh fragmen HIF2a-L, dan
ekspresi HIF2a-S dalam 0– 48 jam PMI lebih tinggi daripada HIF2a-L di otak dan
jantung (Gambar 2 dan Gambar 3). Dengan demikian, peneliti berhipotesis bahwa
semakin pendek fragmen penanda mRNA, semakin mudah untuk menentukan waktu
sejak kematian. Dikombinasikan dengan korelasi PMI (HIF2a-S > HIF2a-L), tingkat
ekspresi penanda mRNA yang lebih tinggi mungkin lebih cocok untuk penentuan
PMI, tetapi ini perlu dipelajari lebih lanjut.
Tabel 2. Persamaan dan nilai R dari penanda pada jaringan otak
Penanda Normalisasi Model matematika Nilai R
HIF2a-S 18S Y = 4.22×X3 −5.95×X2 + 2.24×X + 0.35 0.94
Caspase-3 Y = 2.99×X3 −3.04×X2 + 2.49×X−8.13 0.87
HIF2a-L 18S Y = 5.26×X3 −8.90×X2 + 3.65×X + 8.00 0.83
Caspase-3 Y = 4.42×X3 −6.60×X2 + 5.15×X−0.47 0.83
FIH 18S Non Non
Caspase-3 Y = 1.22×X3 −1.94×X2 + 1.69×X−4.05 0.54
AIF 18S Non Non
Caspase-3 Y = 2.67×X3 −4.91×X2 + 4.25×X + 3.11 0.34
HAF 18S Y = − 3.05*X3 + 6.11*X2 −5.10×X + 11.1 0.79
Caspase-3 Y = − 4.29×X3 + 9.02×X2 −4.89×X + 2.72 0.60

Suatu studi telah melaporkan bahwa FIH mengatur oksidasi untuk

mempercepat respons metabolik yang dimediasi HIF terhadap hipoksia. HIF1a dan
HIF2a ditemukan berkorelasi dengan PMI; karenanya, peneliti menyelidiki hubungan
antara FIH dan PMI 0-48 jam. Hasil dalam penelitian kami menunjukkan bahwa
degradasi FIH berkorelasi positif dengan PMI kecuali ketika dinormalisasi dengan
18S di jaringan otak. Penjelasan yang mungkin untuk ini adalah perbedaan dalam gen
normalisasi. Selain itu, nilai R (Tabel 2 dan Tabel 3) berkisar antara 0,41-0,54,
menunjukkan bahwa degradasi FIH merupakan indikator yang baik untuk estimasi
PMI.
Guan membuktikan bahwa HAF mengatur ekspresi HIFa, dan HIF1a terbukti
menjadi penanda untuk estimasi PMI. Jadi, peneliti bermaksud untuk menentukan
apakah ada hubungan antara ekspresi HAF dan PMI. Akibatnya, ekspresi HAF
meningkat di jaringan otak dan tidak menunjukkan perubahan yang jelas pada
jaringan jantung, sedangkan ekspresi mRNA lain, termasuk penanda HIF2a, dalam
penelitian ini menurun seiring waktu setelah kematian. Oleh karena itu, peneliti
menyimpulkan bahwa tidak semua jenis mRNA terdegradasi setelah kematian karena
tingkat ekspresi mRNA dinamis pada PMI awal. Menariknya, peningkatan ekspresi
HAF berkorelasi baik dengan PMI di jaringan otak, menunjukkan bahwa HAF di
jaringan otak dapat digunakan untuk memperkirakan PMI.
Sampai saat ini, tidak ada penelitian yang menilai hubungan antara mRNA
terkait apoptosis dan PMI. AIF dilaporkan terlibat dalam kondensasi kromatin perifer
caspase-independen dan fragmentasi DNA untuk menginduksi apoptosis sel dalam
kondisi stres. Oleh karena itu, peneliti mengeksplorasi hubungan antara PMI dan
ekspresi AIF. Peneliti mengamati bahwa degradasi AIF berkorelasi baik dengan 0-48
jam PMI (Tabel 3 dan Gambar 3) di jaringan jantung. Namun, pada jaringan otak
menunjukkan korelasi paling lemah dengan PMI, yang kemungkinan disebabkan oleh
perbedaan jaringan. Selain itu, perbedaan ini juga mengakibatkan ekspresi HAF
berkorelasi dengan PMI di jaringan otak tetapi tidak di jaringan jantung.
Tao telah menyebutkan bahwa penting untuk memasukkan lebih banyak
indikator mRNA dalam penentuan PMI, sehingga penanda yang ditemukan dalam
penelitian ini. Studi korelasi dengan PMI di jantung dan otak digunakan untuk
membangun model matematika yang komprehensif melalui analisis regresi langkah-
demi-langkah. Untuk marker HIF2a, HIF2a-S digunakan untuk membangun model
karena nilai R-nya lebih tinggi dari HIF2a-L. Hasilnya tercantum dalam Tabel 4.
Ketika peneliti menggunakan DNA 18S dan Caspase-3 untuk normalisasi, 4 penanda
berbeda dalam 2 jaringan dimasukkan dalam model matematika, dan nilai R masing-
masing adalah 0,87 dan 0,85. Dengan demikian, peneliti mengidentifikasi beberapa
penanda mRNA yang signifikan seperti HIF2a, FIH, dan AIF untuk penentuan PMI di
jaringan otak dan jantung dan mengembangkan model matematika, tetapi studi lebih
lanjut diperlukan untuk memvalidasinya dalam jaringan manusia.
Gambar 3. Korelasi antara 0-48 jam PMI dan penanda mRNA di jaringan jantung ketika dinormalisasi
dengan 18S dan Caspase-3, masing-masing. Korelasi antara 0–48 jam PMI dan HIF2a-S ditunjukkan
pada (a), HIF2a-L pada (b), HAF pada (c), AIF pada (d), dan FIH pada (e). Nilai P> 0,05 ditunjukkan
dengan warna merah\
Tabel 3. Persamaan dan nilai R dari penanda pada jaringan jantung
Penanda Normalisasi Model matematika Nilai R
3 2
HIF2a-S 18S Y = 3.78×X −2.93×X + 0.11×X + 3.51 0.83
Caspase-3 Y = 2.58×X3 −1.54×X2 + 0.70×X−1.69 0.77
HIF2a-L 18S Y = − 0.14×X3 + 3.20×X2 + 0.19×X + 7.11 0.72
Caspase-3 Y = − 1.94×X3 + 5.49×X2 + 0.57×X + 1.89 0.73
3 2
FIH 18S Y = − 2.02×X + 3.53×X + 0.51×X + 5.15 0.54
Caspase-3 Y = − 2.85×X3 + 3.91×X2 + 1.70×X−0.11 0.41
AIF 18S Y = − 2.45×X3 + 9.16×X2 −3.29×X + 9.39 0.70
Caspase-3 Y = − 4.01×X3 + 10.84×X2 −2.57×X + 4.16 0.66
HAF 18S Non Non
Caspase-3 Non Non

Tabel 4. Model matematika menggunakan berbagai penanda pada berbagai organ

Normalissasi Persamaan Nilai P Nilai R
18S Y = − 0.394−0.087×X1 + 0.864×X2 + 0.039×X3 + <0.0001 0.87
0.098×X4
Caspase-3 Y = 1.105 + 0.171×X2 + 0.0336×X3 + <0.0001 0.85
0.036×X4−0.120×X5
X1 = dCq FIH di otak ; X2 = dCq dari HIF2a-S di otak; X3 = dCq AIF di jantung; X4 = dCq dari FIH
di jantung; X5 = dCq HAF di otak; Y = lg titik waktu

Meskipun kejadian pada periode premortem seperti hipoksia dan koma dapat
mengubah tingkat beberapa mRNA, penggunaan degradasi RNA dalam forensik
sebagai indikator untuk estimasi PMI mungkin tidak terpengaruh oleh faktor-faktor
ini. White melaporkan tidak ada efek nyata dari PMI pada RIN, terutama sebelum 36
jam, dan penelitian telah melaporkan bahwa RNA terdeteksi hingga 144 jam PMI
dan bahwa fragmentasi DNA berlanjut pada kecepatan konstan selama 3 hari jika
mayat tidak dipengaruhi oleh faktor luar, dengan demikian, peneliti secara langsung
menghitung koekstraksi jaringan menggunakan real-time qPCR. Selain itu, peneliti
memverifikasi bahwa jumlah DNA Caspase-3 tidak terpengaruh oleh transkripsi balik
RNA kecuali untuk pengenceran volume reaksi. Oleh karena itu, peneliti
membuktikan bahwa RNA dan DNA dalam satu tabung dapat bersama-sama
digunakan untuk memperkirakan PMI dengan desain primer yang sesuai. Dan metode
koanalisis mRNA dan DNA merupakan metode pelengkap untuk penentuan PMI.
Selain itu, karena DNA dan RNA diisolasi dalam satu tabung dalam metode
koekstraksi, mereka kemudian dapat dideteksi dalam satu reaksi, dan prosedur ini
akan sangat berguna untuk situasi dengan biomaterial terbatas seperti dalam kasus
sains forensik.

Kesimpulan
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa jumlah HIF2a, AIF, dan FIH dalam
jaringan jantung menurun dari waktu ke waktu setelah kematian dan bahwa degradasi
mereka berkorelasi dengan 0-48 jam PMI. Hasil ini konsisten dengan mereka yang
memiliki jaringan otak ketika dinormalisasi dengan DNA Caspase-3. Namun, ketika
dinormalisasi dengan 18S, FIH dan AIF tidak menunjukkan hubungan dengan PMI di
otak. Dikombinasikan dengan peringkat stabilitas gen, peneliti menyimpulkan bahwa
DNA Caspase-3 layak untuk digunakan dalam penentuan PMI. Selain itu,
peningkatan ekspresi HAF berkorelasi dengan 0-48 jam PMI di otak. Hasil ini
menunjukkan bahwa DNA dan RNA dapat berhasil diekstraksi bersama dalam satu
tabung, kuantitas tidak semua mRNA menurun pada 0-48 jam PMI, dan korelasi
antara PMI dan mRNA bervariasi di antara jaringan yang berbeda dan penanda yang
berbeda. Namun, peneliti menemukan bahwa degradasi HIF2a adalah indikator yang
baik di jaringan jantung dan otak untuk estimasi PMI 0-48 jam. Selain itu, fragmen
HIF2a yang lebih pendek memiliki korelasi yang lebih kuat dengan PMI daripada
fragmen HIF2a yang lebih panjang, menunjukkan bahwa fragmen yang lebih pendek
lebih cocok untuk penanda mRNA untuk digunakan dalam penentuan PMI. Akhirnya,
peneliti membangun model matematika dengan beberapa penanda mRNA dan
beberapa jaringan. Namun, validasi dan penyelidikan penanda dan model matematika
ini pada jaringan manusia memerlukan studi lebih lanjut.

ANALISIS JURNAL

1. Kelebihan jurnal :
 Jurnal ini memiliki judul dan abstrak yang jelas dan memberikan gambaran
umum mengenai isi jurnal
 Jurnal ini menjelaskan secara rinci pengolahan sampel jaringan otak dan
jantung untuk memperoleh DNA dan RNA yang digunakan dalam
perhitungan PMI
2. Kekurangan jurnal :
 Jurnal ini tidak menjelaskan bagaimana faktor eksternal lainnya yang terlibat
dengan DNA dan RNA yang berpengaruh terhadap estimasi PMI.
 Beberapa sumber pustaka yang digunakan pada jurnal ini memiliki tahun
terbit yang lebih dari 10 tahun terakhir.

Kesimpulan Jurnal dengan judul “Postmortem interval determination using mRNA

markers and DNA normalization ” disusun dengan baik. Dalam jurnal ini menjelaskan
rinci pengolahan sampel jaringan otak dan jantung untuk memperoleh DNA dan RNA
yang digunakan dalam perhitungan PMI. Jurnal ini dapat dijadikan sebagai sumber
bacaan dan referensi bagi pembaca.
 DAFTAR PUSTAKA

Peng D, Lv M, Li Z, Tian H, Qu S, Jin B, Long B, Liang W, Zhang L. Postmortem

interval determination using mRNA markers and DNA normalization. Int J
Legal Med. 2019 Jan;134(1):149-157. doi: 10.1007/s00414-019-02199-7. Epub
2019 Nov 26. PMID: 31773316.