BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian yang bersifat eksperimental.

Penelitian ini meliputi tiga tahap kerja, yaitu yang pertama tahap persiapan

meliputi sterilisasi semua alat yang akan digunakan, pembuatan ekstrak

etanol daun kelor, pembuatan media, dan penyiapan suspensi bakteri.

Kedua, tahap pelaksanaan yaitu pengujian aktivitas antibakteri ekstrak

etanol daun kelor terhadap bakteri Staphylococcus aureus. Ketiga, tahap

akhir penelitian yaitu melakukan pengamatan terhadap hasil pengujian dan

analisis data.

3.2 Populasi, Sampel, Tekhnik Sampling

3.2.1 Populasi

Populasi adalah keseluruhan obyek penelitian baik terdiri dari

benda yang nyata, abstrak, peristiwa ataupun gejala yang merupakan

sumber data dan memiliki karakter tertentu dan sama. Populasi yang

digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kelor (Moringa oleifera)

yang terdapat di Kecamatan Driyorejo, Gresik.

3.2.2 Sampel dan Tekhnik Sampling

Sampel adalah bagian dari populasi yang memiliki sifat – sifat

yang sama dari obyek yang merupakan sumber data. Sampel yang

digunakan dalam penelitian ini adalah daun dari tanaman kelor (Moringa

27
 28

oleifera) yang diambil dari desa Tenaru RT.04/RW.02 Kecamatan

Driyorejo Kabupaten Gresik.

 Kelompok I : Ekstrak dengan konsentrasi 40% = 3 sampel

 Kelompok II : Ekstrak dengan konsentrasi 35% = 3 sampel

 Kelompok III : Ekstrak dengan konsentrasi 30% = 3 sampel

 Kelompok IV : Ekstrak dengan konsentrasi 25% = 3 sampel

 Kelompok negatif : Etanol 96% = 4 sampel

 Kelompok positif : Antibiotik vankomisin 30 µg = 4 sampel

3.3 Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional

3.3.1 Jenis Variabel

Variabel utama yang pertama adalah daun kelor (Moringa oleifera)

yang diekstraksi dengan cara maserasi dengan etanol 96%.

Variabel utama yang kedua adalah bakteri yang digunakan dalam

pengujian aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus.

1. Variabel bebas

Variabel bebas yang dimaksud dalam penelitian ini adalah

variabel yang sengaja diubah-ubah untuk dipelajari pengaruhnya

terhadap variabel tergantung. Variabel bebas dalam penelitian ini

adalah ekstrak etanol 96% daun kelor (Moringa oleifera) pada

kadar 25%, 30%, 35%, 40%.

 29

2. Variabel kendali

Variabel kendali merupakan variabel yang mempengaruhi

variabel tergantung sehingga perlu ditetapkan kualifikasinya agar

hasil yang diperoleh tidak tersebar dan dapat diulang oleh peneliti

lain secara tepat. Variabel kendali dalam penelitian ini adalah

bakteri uji Staphylococcus aureus.

3. Variabel tergantung

Variabel tergantung merupakan kondisi atau karakteristik

yang berubah atau muncul ketika penelitian mengintroduksi,

mengubah, atau mengganti variabel bebas. Variabel tergantung

dalam penelitian ini adalah diameter daerah hambat pertumbuhan

bakteri uji oleh ekstrak etanol 96% daun kelor (Moringa oleifera)

pada kadar 25%, 30%, 35%, 40%.

4. Variabel moderator

Variabel moderator adalah variabel yang kemungkinan

mempengaruhi variabel tergantung tetapi tidak diutamakan diteliti.

Variabel moderator dalam penelitian ini adalah metode penyarian

daun kelor.

3.3.2 Definisi Operasional Variabel Utama

Pertama, daun kelor adalah daun dari tanaman kelor (Moringa

oleifera) yang terdapat di desa Tenaru RT.04/RW.02 Kecamatan Driyorejo

Kabupaten Gresik.
 30

Kedua, serbuk daun kelor yang dipisahkan dari ranting-rantingnya

kemudian dibersihkan dan dikeringkan menggunakan cahaya matahari

secara tidak langsung.

Ketiga, maserat daun kelor adalah hasil ekstraksi daun kelor

dengan cara maserasi selama 3 hari menggunakan pelarut etanol 96% lalu

dipekatkan dan dibuat ekstrak etanol 96% daun kelor pada kadar 25%,

30%, 35%, 40% sebagai sediaan uji.

Keempat, bakteri uji dalam penelitian ini adalah Staphylococcus

aureus.

Kelima, diameter daerah hambat menggunakan metode lubang

sumur. Diameter daerah hambat adalah daerah jernih disekeliling sumuran

yang tidak ditumbuhi oleh bakteri.

Keenam, yang disebut blanko dalam penelitian ini adalah penyari

yang digunakan dalam metode maserasi.

 31

3.4 Kerangka Konseptual

Daun Kelor

Ekstrak etanol
96% daun kelor

Antimikroba

Antifungi Antibakteri Antiviru

s

Metode pengujian Antibakteri

Dilusi Difusi Bioautografi

Kontrol positif Sampel ekstrak

Media +
Staphylococcus dengan berbagai
Kontrol negatif aureus konsentrasi

Zona bening sebagai

daerah hambatan
 32

3.5 Kerangka Kerja

Daun Kelor

Cuci sampai bersih

Dirajang

Dikeringkan dibawah sinar matahari

secara tidak langsung

Diserbuk

Serbuk simplisia daun kelor

Dimasukkan dalam erlenmeyer

Ditambahkan etanol 96%, dibiarkan
selama 3 hari dengan sesekali diaduk

Disaring

Maserat

Dipekatkan

Ekstrak

Uji aktivitas antibakteri

 33

Cawan Petri Steril

Masukkan suspensi NA yang dibuat sebanyak ± 1,26

gram dalam 45 ml air dan dipanaskan dengan suhu
100°C
Biarkan hingga memadat
Inokulasi bakteri Staphylococcus aureus pada media
agar, kemudian bungkus dengan kertas perkamen dan
inkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C

Media NA +
Staphylococcus
aureus

Dibuat lubang sumur

Ditetesi 50 µl ekstrak etanol 96% daun kelor dengan
konsentrasi 25%, 30%, 35%, 40%, antibiotik
vankomisin 30 µg sebagai kontrol positif, dan etanol
96% sebagai kontrol negatif.

Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam

Diukur media zona

hambat
 34

3.6 Teknik Pengumpulan Data

3.6.1 Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian adalah alat dan bahan yang digunakan dalam

penelitian ini yaitu:

1. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

 Ekstrak daun kelor (Moringa oliefera)

 Media nutrient agar

 Etanol 96%

 Aquadest

 Biakan murni Staphylococcus aureus

 Antibiotik vankomisin

2. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

 Erlenmeyer

 Beaker glass

 Gelas ukur

 Corong kaca

 Tabung reaksi

 Rak tabung reaksi

 Cawan petri

 Jarum ose
 35

 Incubator

 Oven

 Mikropipet

 Pembakar spirtus

 Autoklaf

 Termometer

 Neraca analitik

 Alumunium foil

 Kertas saring

 Kertas Perkamen

3.6.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Lokasi penelitian Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol 96%

Daun Kelor terhadap bakteri Staphylococcus aureus dilakukan di

laboratorium mikrobiologi Akademi Farmasi Mitra Sehat Mandiri

Sidoarjo. Penelitian ini dilakukan antara bulan Juni – Juli 2014.

3.6.3 Prosedur Penelitian

Prosedur penelitian ini dilakukan melalui langkah kerja berikut:

1. Determinasi Tanaman

Tahap pertama penelitian adalah melakukan determinasi daun

kelor (Moringa oleifera) bertujuan untuk menetapkan kebenaran yang

berkaitan dengan ciri-ciri morfologi baik secara makroskopis maupun

mikroskopis tanaman kelor (Moringa oleifera) terhadap kepustakaan

dan dibuktikan di laboratorium.

 36

2. Pengambilan dan Persiapan Bahan

Daun kelor diambil dari desa Tenaru RT.04/RW.02 Kecamatan

Driyorejo Kabupaten Gresik pada bulan Juni 2014. Daun dibersihkan

dari cemaran atau kotoran kemudian dijemur ditempat teduh terhindar

dari sinar matahari langsung sampai kering dalam bobot konstan.

Pembuatan serbuk dengan cara diblender sampai halus.

3. Metode yang Digunakan

Metode yang digunakan untuk uji aktifitas antibakteri adalah

metode lubang sumur, metode ini dilakukan dengan cara menanam

bakteri pada media nutrient agar kemudian melubangi atau membuat

sumur lalu memasukkan zat uji kedalam lubang sumur tersebut dan

diinkubasi selama 1x24 jam. Aktivitas antibakteri dilihat dengan

mengukur zona hambatan pertumbuhan Staphylococcus aureus

disekitar lubang sumur. Keuntungan metode ini adalah sampel cair

bisa masuk dengan pas pada lubang sumur untuk satu mikroorganisme.

4. Sterilisasi Alat

Sterilisasi adalah membebaskan tiap benda/substansi dari

semua kehidupan dalam bentuk apapun. Sterilisasi alat yang akan

digunakan sebelum semua peralatan digunakan, syarat sterilisasi ada 2

yaitu, pemanasan basah dan pemanasan kering. Pemanasan basah

(autoklaf) digunakan pada kebanyakan media pembenihan karena

mengandung air misalnya, media biakan dengan suhu 121° C selama

 37

30 menit. Pemanasan kering (oven) digunakan alat-alat dari gelas

misalnya cawan petri, tabung reaksi dengan suhu 160°C selama 2 jam.

5. Pembuatan Ekstrak Daun Kelor

Cara pembuatan :

Serbuk daun kelor ditimbang sebanyak 300 gram dimasukkan

kedalam erlenmeyer atau bejana tertutup dan rendam dalam etanol

96% sebanyak 1500 ml dengan perbandingan antara simplisia dan

penyarinya 1:5, kemudian didiamkan selama 3 hari sambil dilakukan

pengadukan atau pengocokan berulang. Setelah 3 hari, saring dengan

kertas saring kedalam erlenmeyer. Maserat yang diperoleh dari proses

diatas diuapkan sampai pelarut hilang. Ekstrak siap digunakan untuk

larutan uji.

6. Pembuatan Media Nutrient Agar

Cara pembuatan :

Menimbang 28 gram media nutrient agar kemudian

dicampurkan dengan aquadest 1000 ml dalam beaker glass. Panaskan

diatas api hingga suhu 100°C dan diaduk sampai larut dan homogen.

Masukkan kedalam cawan petri secara aseptis, biarkan sampai dingin

dan memadat. Setelah dingin dan padat, inokulasi dengan biakan

bakteri Staphylococcus aureus secara aseptis. Diinkubasi selama 1x24

jam pada suhu 37°C.

 38

7. Pembuatan larutan antibiotik vankomisin

Cara pembuatan :

Untuk mendapatkan konsentrasi 30μg antibiotik vankomisin

dilakukan dua kali pengenceran dengan menimbang 15 mg serbuk

vankomisin yang dilarutkan dalam 10 ml aquadest, kemudian ambil 2

ml larutan yang telah dibuat dan ditambahkan aquadest sampai 10 ml,

setelah itu diambil lagi 1 ml dari pengenceran pertama dan

ditambahkan aquadest sampai 10 ml.

8. Pembuatan Larutan Uji Aktivitas Antibakteri

Konsentrasi ekstrak yang dipakai adalah 25%, 30%, 35%, 40%.

Pada media agar yang sudah dibiakkan bakteri Staphylococcus aureus

tersebut, dibuat lubang berdiameter 5 mm dengan alat pelubang.

Kemudian masukkan 50 µl ekstrak etanol 96% daun kelor ke dalam

lubang tersebut yang akan diperiksa aktivitas antibakterinya. Biakan

bakteri tersebut diinkubasi didalam incubator pada suhu 37°C selama

24 jam, kemudian dilakukan pengukuran zona bening dengan

menggunakan jangka sorong. Dicatat data yang diperoleh dan

masukkan dalam tabel.

9. Pengamatan Hasil Pengujian

Hasil pengujian adanya aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol

96% daun kelor dengan metode lubang sumur dapat dilihat dengan ada

tidaknya daerah jernih yang teramati pada satuan millimeter yang

dibandingkan dengan blanko. Apabila adanya daerah hambatan

 39

pertumbuhan dari bakteri uji ditunjukkan dengan zona bening

disekeliling sumuran.

Pengamatan dapat dilakukan dengan mata biasa jika medium

jernih berarti tidak terdapat pertumbuhan bakteri sehingga dapat

disimpulkan bahwa ekstrak daun kelor yang terdapat pada medium uji

mampu menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri

Staphylococcus aureus. Sedangkan jika medium menunjukkan

kekeruhan, berarti ekstrak daun kelor yang terdapat dalam medium itu

tidak mampu menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri.

3.7 Analisa Data

Data hasil penelitian ini analisa data dilakukan dengan mengukur

daerah jernih disekitar lubang sumuran. Penghambatan bakteri

Staphylococcus aureus oleh ekstrak etanol 96% daun kelor pada kadar

25%, 30%, 35%, 40% terlihat wilayah jernih disekitar pertumbuhan

bakteri. Diameter wilayah jernih merupakan petunjuk kepekaan bakteri

terhadap ekstrak etanol 96% daun kelor. Dari hasil pengukuran, data

diolah menggunakan metode statistik yaitu standart deviasi dan koefisien

variasi untuk mengetahui kepastian data dari hasil penelitian.

SD=√ Ʃ¿ ¿ ¿

KV = SD x 100%
x
Keterangan :
 40

1) SD (Standar Deviasi) adalah ukuran keseragaman atau

kecenderungan penyebaran data

2) KV (Koefisien varian) adalah membandingkan varian nilai antara

dua variabel yang berbeda nilainya

3) x₁ adalah luas hambatan

4) x adalah rata-rata

5) n adalah banyaknya replikasi

Menurut pernyataan Ardiansyah (dalam Darmawi, dkk, 2013)

bahwa dalam ketentuan kekuatan antibakteri asal tumbuhan adalah zona

hambat 20 mm atau lebih berarti sangat kuat, zona hambat 10-20 mm

berarti kuat, 5-10 mm berarti sedang, dan zona hambat 5 mm atau kurang

berarti lemah. Bakteri yang dinyatakan peka terhadap antibakteri asal

tanaman apabila mempunyai zona hambat sebesar 12-24 mm.