•

Pengembangan Teknik
pcr
• RNA sebagai cetakan maka
Awalnya Teknik PCR hanya terlebih dahulu dilakukan
digunakan untuk amplifikasi molekul proses transkripsi balik
DNA dengan menggunakan DNA (reverse transcription)
sebagai bahan awal (starting terhadap molekul mRNA
material) sebagai cetakan, molekul sehingga diperoleh molekul
DNA harus diisolasi terlebih dahulu cDNA (complementary DNA).
dari sel/jaringan.
• Molekul cDNA tersebut
• Saat ini telah memungkinkan kemudian digunakan sebagai
menggunakan molekul RNA cetakan dalam proses PCR.
sebagai bahan awal yaitu
Teknik RT-PCR ini sangat berguna
dengan berkembangnya Reverse
untuk mendeteksi ekspresi gen,
Transcriptase PCR (RT-PCR).
untuk amplifikasi RNA sebelum
• Saat ini juga telah dilakukan cloning dan analisis, maupun
dikembangkan Teknik PCR untuk diagnosis agen infektif maupun
yang tidak memerlukan isolasi penyakit genetic.
molekul DNA yaitu dengan
•
menggunakan sel atau jaringan
sebagai bahan awal yang
dikenal sebagai PCR In Situ.
Teknik RT-PCR memerlukan
Reverse transcriptase pcr (rt-pcr) enzim transcriptase balik (reverse
transcriptase).
• Teknik ini dikembangkan untuk
melakukan analisis terhadap “Enzim transcriptase balik adalah
molekul RNA hasil transkripsi enzim DNA polymerase yang
yang terdapat dalam jumlah menggunakan molekul RNA
sangat sedikit di dalam sel. sebagai cetakan untuk menyintesis
molekul DNA (cDNA) yang
• Oleh karena PCR tidak dapat
dilakukan dengan menggunakan
 komplementer dengan molekul • Pasangan DNA–DNA, DNA–
RNA tersebut” RNA, atau RNA–RNA dapat
terbentuk melalui proses ini.
Beberapa enzim transcriptase balik
yang dapat digunakan antara lain: • Hibridisasi DNA–DNA
terbentuk dalam blot
a) mesophilic viral reverse
Southern sedangkan hibridisasi
transcriptase (Rtase) yang
DNA–RNA terbentuk dalam
dikode oleh virus avian
blot Northern.
myoblastosis (AMV) maupun
oleh virus Moloney murine Hasil ikatan basa yang
leukemia (M-MuLV) dibentuk dari hibridisasi disebut
b) Tth DNA polymerase. hibrida

Rtase yang dikode oleh AMV In Situ Hybridisation (hibridisasi in

maupum M-MuLV bersifat sangat situ) adalah Teknik analisis DNA atau
prosesif dan mampu menyintesis mRNA dengan melakukan analisis
cDNA sampai sepanjang 10kb. langsung sel pada jaringan yang
bersangkutan tanpa harus melakukan
Tth DNA polymerase mampu
isolasi DNA atau mRNA terlebih
menyintesis cDNA sampai sepanjang 1
dahulu.
– 2 kb. Tth DNA polymerase
diisolasi dari eubakteri thermofilik • Teknik ini memerlukan molekul
Thermus thermophilus HBS. RNA atau DNA target dalam
jumlah paling tidak 20 kopi
In situ hybridization
dalam satu sel agar dapat
Hibridisasi adalah pembentukan terdeteksi.
ikatan dupleks stabil antara dua
• Teknik hibridisasi in situ paling
rangkaian nukleotida yang saling
sering digunakan untuk analisis
komplementer melalu perpasangan
mRNA karena jumlahnya per
basa N.
sel pada umumnya lebih
• Hibridisasi dapat menunjukkan banyak dibanding dengan DNA.
suatu keseragaman sekuens.
PCR in situ
• Jumlah genom virus laten memperkuat salinan cDNA dari
yang menginfeksi suatu sel, mRNA yang ada apabila
misalnya seringkali hanya jumlah sangat rendah dalam
terdiri atas beberapa kopi. spesimen klinis yang
mengandung populasi tipe sel
• Mutasi gen, translokasi
yang heterogen.
kromosom dan perubahan
patologis awal seringkali hanya • Nested PCR biasanya
melibatkan beberapa kopi melibatkan dua reaksi
sekuen nukleotida sehingga amplifikasi berurutan, yang
akan sukar dideteksi dengan masing-masing menggunakan
Teknik hibridisasi in situ. pasangan primer yang berbeda.

• Oleh karena itu, untuk analisis • Produk dari reaksi amplifikasi

molekul DNA yang jumlah pertama digunakan sebagai
kopinya sangat sedikit di cetakan untuk PCR kedua,
dalam sel, harus dilakukan menggunakan primer
amplifikasi terlebih dahulu oligonukleotida yang
secara in situ. ditempatkan secara internal
pada pasangan primer
• Teknik yang mengombinasikan
pertama.
amplifikasi PCR dengan
hibridisasi in situ dikenal • Penggunaan dua pasang
sebagai Teknik PCR In Situ oligonukleotida memungkinkan
(Komminoth dan Long, 1995; jumlah siklus yang lebih tinggi
Gu, 1995). untuk dilakukan, sehingga
meningkatkan sensitivitas
Nested PCR
PCR.
• Nested PCR digunakan untuk
• Spesifisitas reaksi yang
meningkatkan sensitivitas
ditingkatkan berasal dari
dan/atau spesifisitas PCR,
pengikatan dua set primer
misalnya, ketika memperkuat
yang terpisah ke templat
anggota tertentu dari keluarga
target yang sama.
gen polimorfik atau ketika
 Nested PCR adalah metode dapat bekerja dengan baik
yang efisien untuk mengamplifikasi dalam suatu reaksi tunggal,
segmen template yang panjang serta ukuran amplikon.
tetapi membutuhkan pengetahuan
• Dengan demikian, panjang
tentang urutan target.
suatu pasangan basa harus
berbeda dan dapat
membentuk pita yang berbeda
ketika diamati dengan
elektroforesis gel agarosa
MULTIPLEX PCR

Multiplex PCR adalah adaptasi

dari teknik PCR yang memungkinkan Ilustrasi metode multiplex
amplifikasi secara simultan dari
pcr
berbagai sekuen gen.

• Multiplex PCR berisi berbagai

macam set primer dengan
campuran reagen PCR tunggal
untuk memproduksi amplikon
dari berbagai ukuran yang
spesifik terhadap sekuens DNA
yang berbeda.

• Dengan pentargetan gen

sekaligus, informasi tambahan
dapat diperoleh dari running-
test tunggal yang tidak akan
membutuhkan beberapa kali
reagen dan lebih banyak waktu
untuk melakukan.

• Temperatur pada tahapan • Multiplex PCR pertama kali di

annealing harus dioptimasi gunakan pada tahun 1988
untuk tiap set primer agar untuk mendeteksi delesi pada
 gen dystrophin (Chamberlain,
et. al., 1988).

• Pada tahun 2008 multiplex

digunakan untuk menganalisis
mikrosatelit dan SNPs
(Hayden, et. al., 2008).

• Multiplex PCR umumnya

digunakan untuk diagnosis
penyakit atau patogen
berbeda dalam suatu sampel
yang sama.

Aplikasi metode multiplex PCR

diantaranya dapat digunakan:

a. untuk identifikasi patogen,

deteksi GMOs (Genetically
Modified Organisms)
b. analisis polimorfisme
c. analisis mutase
d. analisis delesi gen
e. deteksi RNA
f. peneltian mengenai forensik
dan lain sebagainya.

• Pada dasarnya, prosedur dan

komponen dalam reaksi
multiplex PCR sama dengan
PCR reguler.