Machine Translated by Google

SEKUENSI DNA
Machine Translated by Google

TUJUAN
Memperkenalkan siswa pada pengurutan DNA: •
Apa itu? • Penggunaan pengurutan DNA •
Sejarah • Metode Dasar:

- Pengurutan Maxam-Gilbert
- Metode pemutusan rantai
• Metode Lanjutan
Machine Translated by Google

Apa itu?

Pengurutan DNA
adalah proses untuk
menentukan urutan
nukleotida (adenin,
guanin, sitosin, dan
timin) yang tepat di
dalam molekul DNA.

http://en.wikipedia.com
Machine Translated by Google

PENGGUNAAN SEKUENSI DNA

• Pengurutan asam nukleat dapat digunakan untuk

menentukan urutan gen individu, wilayah genetik yang
lebih besar (yaitu kelompok gen atau operon), kromosom
penuh atau seluruh genom.

• Urutan DNA telah banyak digunakan untuk penelitian

biologi dasar, dan dalam berbagai bidang terapan seperti
diagnostik, bioteknologi, biologi forensik, dan sistematika
biologi.
Machine Translated by Google

Pada tahun 2003 para ilmuwan di

Proyek Genom Manusia
memperoleh urutan DNA
dari 3 miliar pasangan
basa yang menyusun
genom manusia
Machine Translated by Google

Bagaimana mereka melakukannya…

• DNA dari 5 manusia

• 2 laki-laki, 3 perempuan
• 2 bule, masing-masing satu
orang asia, afrika, hispanik

• Potong DNA dengan

enzim restriksi •
Diligasi menjadi BAC & YAC,
lalu menumbuhkannya •
Mengurutkan BAC • Biarkan
superkomputer menyatukan
potongan-potongan itu
Machine Translated by Google

SEJARAH SEKUENSI DNA

• Urutan DNA pertama
diperoleh pada awal tahun
1970-an oleh para peneliti
akademis menggunakan
metode yang melelahkan
berdasarkan kromatografi
dua dimensi.

• Petunjuk utama pengurutan RNA adalah urutan gen

lengkap pertama dan genom lengkap Bacteriophage
MS2, yang diidentifikasi dan diterbitkan oleh Walter
Fiers dan rekan kerjanya di Universitas Ghent
(Belgia), pada tahun 1972 dan 1976.
Machine Translated by Google

• Frederick Sanger • Walter Gilbert dan Allan

mengembangkan
metode sekuensing DNA
cepat di MRC Centre,
Cambridge, Inggris dan
menerbitkan metode untuk
"sekuensing DNA dengan
inhibitor pemutusan rantai"
pada tahun 1977.
Maxam di Harvard juga
mengembangkan metode
pengurutan, termasuk satu
untuk "pengurutan DNA
dengan degradasi kimia"
pada tahun 1973.

PENDIRI DARI
SEKUENSI DNA
Machine Translated by Google

Institut California Semi-otomatis pertama

1986
Teknologi dan Smith mesin pengurutan DNA

Memasarkan mesin
Biosistem Terapan pengurutan otomatis pertama, 1987
ABI 370

US National Institutes of Health

(NIH) telah memulai uji coba
pengurutan skala besar pada
Institut Kesehatan Mycoplasma capricolum,
1990
Escherichia coli, Caenorhabditis
Nasional AS (NIH)
elegans, dan Saccharomyces
cerevisiae dengan biaya US$0,75
per basis
Machine Translated by Google

Pål Nyrén dan muridnya 1996

Mostafa Ronaghi di Menerbitkan metode
Institut Teknologi Kerajaan pyrosequencing mereka
di Stockholm

Dipublikasikan dan dipasarkan

Lynx Terapi "Urutan tanda tangan 2000

paralel besar-besaran", atau

MPSS

Memasarkan versi pyrosequencing

454 Ilmu Hayati 2004
yang diparalelkan

• Versi pertama dari mesin mereka berkurang

biaya pengurutan 6 kali lipat dibandingkan
dengan pengurutan Sanger otomatis, dan merupakan
teknologi pengurutan generasi kedua yang baru ,
setelah MPSS.
Machine Translated by Google

Metode Pengurutan

ÿPengurutan bahan kimia Maxam/Gilbert

ÿPengurutan pemutusan rantai sanger
ÿPyrosequencing ÿPengurutan susunan
Machine Translated by Google

Pengurutan Maxam-Gilbert

DMS TETAPI H H+S

G G C
C
G SEBUAH T
C
G G T
C
G G C
C
SEBUAH T
G C

SEBUAH C
SEBUAH T

Pengurutan Maxam-Gilbert dilakukan dengan

pemutusan rantai pada nukleotida tertentu.
Machine Translated by Google

ÿ Pengurutan Maxam-Gilbert
Machine Translated by Google

Film sinar-X untuk autoradiografi, menghasilkan serangkaian pita

gelap yang masing-masing sesuai dengan fragmen DNA berlabel radioaktif
Machine Translated by Google

• Dikembangkan oleh Frederick Sanger dan

rekan kerja pada tahun 1977 segera menjadi
metode pilihan, karena relatif
Metode dasar: mudah dan dapat diandalkan.
Metode pemutusan
• Metode terminator rantai menggunakan
rantai (juga dikenal lebih sedikit bahan kimia beracun dan
sebagai jumlah radioaktivitas yang lebih rendah
Pengurutan Sanger) daripada metode Maxam dan Gilbert.

• Karena kemudahan komparatifnya, the

Metode Sanger segera
diotomatisasi dan merupakan metode
yang digunakan pada generasi pertama DNA
sequencer.
Machine Translated by Google
Machine Translated by Google

Urutan Pemutusan Rantai (Sanger).

3ÿ

GATC G

Fragmen yang lebih panjang T

SEBUAH

ddG
SEBUAH

SEBUAH

C
Fragmen yang lebih pendek SEBUAH

ddG T

5ÿ

Gel sekuensing dibaca dari bawah ke atas (5ÿ hingga 3ÿ).

Machine Translated by Google

Pembacaan Gel Metode Dasar (Kiri)

Kromatografi hasil pengurutan otomatis (kanan)

Machine Translated by Google
Machine Translated by Google
Machine Translated by Google

METODE GENERASI BERIKUTNYA

• Memproduksi teknologi pengurutan throughput
tinggi (atau pengurutan generasi berikutnya) yang
memparalelkan proses pengurutan, menghasilkan
ribuan atau jutaan pengurutan secara bersamaan.
• Teknologi pengurutan throughput tinggi
dimaksudkan untuk menurunkan biaya pengurutan
DNA melebihi yang mungkin dilakukan dengan
metode terminator pewarna standar
Machine Translated by Google

Perbandingan metode
pengurutan generasi berikutnya

Real-time molekul
semikonduktor ion Pengurutan Pengurutan Pemutusan rantai
tunggal Pyrosequencing
metode (Pengurutan dengan sintesis dengan ligasi
pengurutan (Pasifik (454)
Ion Torrent) (Iluminasi) (pengurutan SOLiD) (Pengurutan Sanger)
bio)

Baca panjang Rata-rata 2900 bp[38] 200 bp 87% 700 bp 50 hingga 250 bp 50+35 atau 50+50 bp 400 hingga 900 bp

(mode panjang baca), 99% (mode

Ketepatan akurasi) 98% 99,9% 98% 99,9% 99,9%

Dibaca per lari 35–75 ribu [39] hingga 5 juta 1 juta hingga 3 miliar 1,2 hingga 1,4 miliar T/A

1 sampai 10

30 menit hingga hari, tergantung

20 menit ke 3
Waktu per lari 2 jam 24 jam sequencer dan 1 sampai 2 minggu
2 jam [40] jam
panjang baca yang
ditentukan[41]
Biaya per 1 juta basis
$2 $1 $10 $0,05 hingga $0,15 $0,13 $2400
(dalam US$)
Potensi hasil urutan
Panjang bacaan tinggi, tergantung
Pembacaan individu
terpanjang. Cepat. Peralatan yang Ukuran baca panjang. pada model sequencer
Keuntungan Biaya rendah per pangkalan. yang panjang. Berguna
Mendeteksi 4mC, 5mC, lebih murah. Cepat. Cepat. dan aplikasi yang
untuk banyak aplikasi.
6mA.[42] diinginkan.

Hasil rendah pada tinggi Lari adalah Lebih mahal dan

ketepatan. Homopolimer mahal. Peralatan bisa sangat Lebih lambat dari yang lain tidak praktis untuk
Kekurangan
Peralatan bisa sangat kesalahan. Homopolimer mahal. metode. proyek pengurutan yang
mahal. kesalahan. lebih besar.

http://en.wikipedia.com