Machine Translated by Google

Metode dalam Biologi MolekulerTM Metode dalam Biologi Molekuler

VOLUME 159

Asam Amino Asam Amino

Analisis Analisis

Protokol Protokol

Diedit oleh

Catherine Cooper Catherine Cooper

Nicolle Packer Nicolle Packer

Keith Williams Keith Williams

HUMANA PRESS HUMANA PRESS

Machine Translated by Google

Amino Asam Analisis 1

1
Analisis Asam Amino
Sebuah Ringkasan

Margaret I. Tyler

1. Kegunaan dan Kegunaan

Asam amino ditemukan baik dalam keadaan bebas atau sebagai rantai linier
dalam peptida dan protein. Ada 20 asam amino yang umum terdapat dalam protein,
yang ditunjukkan pada Tabel 1. Analisis asam amino memiliki peran penting dalam
mempelajari komposisi protein, makanan, dan bahan pakan. Asam amino bebas
juga ditentukan dalam bahan biologis, seperti plasma dan urin, dan dalam jus buah
dan anggur. Ketika dilakukan pada protein murni, analisis asam amino mampu
mengidentifikasi protein (2,3, dan Bab 8 dalam buku ini), dan analisis juga digunakan
sebagai prasyarat untuk degradasi Edman dan spektrometri massa dan untuk
menentukan metode pencernaan enzimatik atau kimia yang paling cocok untuk
studi lebih lanjut tentang protein. Ini juga merupakan metode yang berguna untuk
menghitung jumlah protein dalam sampel (lihat Bab 2 dalam buku ini) dan dapat
memberikan hasil yang lebih akurat daripada metode kolorimetri.

2. Pandangan Sejarah

Eksperimen paling awal pada hidrolisis asam protein dilakukan oleh Braconnot
pada tahun 1820, di mana asam sulfat pekat digunakan untuk menghidrolisis
gelatin, wol, dan serat otot (4). Berbagai reagen untuk melakukan hidrolisis protein
dicoba selama 100 tahun berikutnya, dengan 6 M HCl menjadi reagen yang paling
banyak diterima. Pada tahun 1972, Moore dan Stein (5) dianugerahi Hadiah Nobel
untuk mengembangkan instrumen otomatis untuk pemisahan asam amino pada
resin penukar ion dan kuantisasi asam amino menggunakan ninhydrin.
Baru-baru ini, kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) telah dikonfigurasi untuk
analisis asam amino. Beberapa metode menggunakan turunan postcolumn

Dari: Metode di Biologi Molekuler , vol. 159: Amino Asam Protokol Analisis
Diedit oleh: C. Cooper, N. Packer, dan K. Williams © Humana Press Inc., Totowa, NJ

1
Machine Translated by Google

2 Tyler

Tabel 1
Asam Amino Biasa

Penting
Simbol untuk

Nama 3 huruf 1 huruf manusia (1)

Asam amino asam
Asam aspartat Asp D Tidak

Asam glutamat Glu e Tidak

Asam amino netral

Alanin Ala SEBUAH Tidak

Asparagin Asn N Tidak

Sistein Cys C Tidak

Glutamin Gln Q Tidak

Glisin Gly G Tidak

Isoleusin Ile Saya Ya

Leusin Leu L Ya
Metionin Bertemu M Ya
Fenilalanin Ph F Ya
Serin Ser S Tidak

Treonin Thr T Ya
Triptofan Trp W Ya
Tirosin Tir Y Tidak

Valin Val V Ya
Asam amino dasar
Arginin Arg R Ya
Histidin Miliknya H Ya
Lisin Lys K Ya
Asam imino
Prolin Pro P Tidak

atisasi di mana asam amino dipisahkan pada kolom penukar ion diikuti oleh
derivatisasi dengan ninhydrin (6, dan Bab 2 dalam buku ini), fluorescamine
(7), atau o-phthalaldehyde (8). Pendekatan lain adalah menurunkan asam
amino sebelum pemisahan pada kolom HPLC fase terbalik.
Contoh dari teknik ini adalah dansyl (9), phenylisothiocyanate (PITC) (10, dan
Bab 12 dan 13 dari volume ini), 9-fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc) (11),
dan 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimyl carbamate (AQC) (12, dan Bab 4
dan 8 dalam buku ini).
3. Sensitivitas
Analisis asam amino dapat dilakukan secara akurat pada tingkat fmol
dengan metode deteksi fluoresensi, sedangkan untuk turunannya dideteksi dengan
Machine Translated by Google

Amino Asam Analisis 3

Meja 2
Perbandingan Kimia Derivatisasi Berbeda untuk Analisis Asam Amino

Ninhydrin OPA OPA PITC Fmoc AQC

Jenis derivatisasi postc postc prec prec prec prec

Mode deteksib c f f UV f f
Kepekaan pmol fmol fmol pmol fmol fmol
Kromatografic yaitu yaitu Rp Rp Rp Rp

OPA, orthophthalaldehyde; PITC, fenilisothiocyanate; Fmoc, 9-fluorenylmethyl

kloroformat; AQC, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate. apostc, kolom
pos; prec, prakolom. bc, kolorimetri; f, fluoresensi; UV, ultraviolet. yaitu, pertukaran
ion; rp, HPLC fase terbalik.

sinar ultraviolet (UV), analisisnya pada tingkat pmol. Tabel 2 memberikan

perbandingan berbagai kimia derivatisasi dan sensitivitasnya. Studi tahunan
yang membandingkan berbagai metode telah dilakukan oleh Asosiasi Fasilitas
Sumber Daya Biomolekuler (ABRF) (13,14). Strydom dan Cohen (15) telah
membandingkan kimia AQC dan PITC dan menemukan bahwa turunan AQC
lebih stabil.

4. Asam Amino Sulit

4.1. Triptofan

Triptofan dihancurkan dalam hidrolisis asam. Hidrolisis basa dengan NaOH,

Ba(OH)2, atau LiOH telah digunakan terutama dalam hidrolisis makanan dan
bahan pakan (16,17). Namun, hidrolisis asam tetap diperlukan untuk menentukan
asam amino lainnya.
Ada sejumlah metode yang diterbitkan untuk penentuan triptofan yang
menggunakan hidrolisis HCl 6 M standar dengan adanya aditif, beberapa di
antaranya termasuk asam thioglycolic (18), beta-mercapto ethanol (19), dan
asam mercaptoethanesulfonic ( 20).
4.2. Sistein dan Sistin

Sistein dan sistin tidak stabil selama hidrolisis asam, terutama dengan adanya
karbohidrat. Kandungan total sistein dan sistin dapat ditentukan dengan
mengoksidasi protein dengan asam performat, yang mengubah kedua bentuk
menjadi asam sisteat dan metionin menjadi metionin sulfon. Protein tersebut
kemudian dihidrolisis dengan 6 M HCl (17).
Senyawa disulfida seperti asam dithiopropionic dan asam dithiobutyric telah
diusulkan sebagai agen pelindung untuk sistein dan sistin selama masa asam.
Machine Translated by Google

4 Tyler

hidrolisis (21). Penggunaan asam dithiodiglycolic selama langkah hidrolisis asam,

diikuti dengan derivatisasi phenylisothiocyanate, memungkinkan sistein dan sistin
ditambah semua asam amino hidrolisat umum (tidak termasuk triptofan) untuk
ditentukan (22).
Reduksi jembatan disulfida, diikuti oleh alkilasi sistein dengan asam iodoasetat
atau 4-vinilpiridin juga digunakan untuk menentukan kandungan protein sistein-
plus sistin (23). Alkilasi dengan akrilamida menghasilkan sistein S-propionamida,
yang diubah menjadi asam sistein-S-propionat selama hidrolisis asam (24).

4.3. Asparagin dan Glutamin

Asparagin dan glutamin masing-masing adalah turunan amida dari asam
aspartat dan asam glutamat. Selama hidrolisis asam, yang memotong ikatan
amida, asparagin diubah menjadi asam aspartat dan glutamin menjadi asam glutamat.
Dengan demikian, jumlah yang ditentukan untuk asam aspartat mewakili total
asam aspartat dan asparagin dan juga untuk asam glutamat dan glutamin.
4.4. Asam amino D

Kandungan asam D-amino dari protein atau peptida dapat ditentukan dengan
menggunakan hidrolisis asam parsial pendek, diikuti oleh hidrolisis enzimatik
dengan pronase, dan kemudian dengan leusin aminopeptidase dan hidrolase
asam peptidil-D-amino (25).

5. Modifikasi Asam Amino

Asam amino terfosforilasi dapat dianalisis menggunakan berbagai kimiawi
yang berbeda (26), tetapi studi ABRF tahun 1993 menemukan bahwa metode
precolumn lebih berhasil (27). Phosphoserine (28,29), phosphothreonine (29), dan
phosphotyrosine (29) memiliki kestabilan yang bervariasi. Pemulihan tertinggi
untuk fosfoserin dan fosfotirosin dihasilkan dengan waktu hidrolisis 60 menit atau
kurang pada 110ºC, sedangkan untuk fosfotreonin, waktu hidrolisis 2 jam
memberikan hasil yang lebih baik (26). Bab 14 dalam buku ini membahas analisis
asam fosfoamino secara lebih luas.
Ada banyak asam amino dan turunan langka lainnya yang dapat dianalisis.
Ini termasuk hidroksiprolin (17,30, dan Bab 16 dalam buku ini) dan hidroksilisin
(17,30, dan Bab 2 buku ini), ditemukan dalam kolagen. Taurin memiliki kepentingan
diet dan dapat dengan mudah ditentukan dalam formula bayi, makanan hewan
peliharaan, plasma, urin, dan ekstrak jaringan (17, dan Bab 10 dari volume ini).
Modifikasi pascatranslasi, termasuk asam amino glikosilasi (31, dan Bab 2 dan 7
buku ini) dan asam amino terglikasi (32,33), penting dalam mempelajari fungsi
protein. Bab 18 dari buku ini menjelaskan penerapan spektrometri massa pada
analisis asam amino terglikasi.
Machine Translated by Google

Amino Asam Analisis 5

6. Keterbatasan—Kontaminan dan Tindakan Pencegahan

Keakuratan analisis asam amino sangat bergantung pada keutuhan sampel.

Kebersihan semua permukaan kontak sampel sangat penting, demikian pula kemurnian
semua reagen yang digunakan. Jejak garam, logam, atau detergen dapat memengaruhi
keakuratan hasil.
Langkah hidrolisis sangat penting, seperti yang ditunjukkan dalam studi kolaboratif
AAA ABRF 1994 (34). Banyak laboratorium sekarang dengan memuaskan melakukan
hidrolisis 1 jam dalam 6 M HCl pada 150°C di bawah vakum. Metode tradisional
menggunakan 6 M HCl selama 20-24 jam pada 110°C di bawah vakum. Kehilangan
serin, treonin, dan pada tingkat yang lebih rendah, tirosin dapat terjadi pada kondisi
ini. Selama hidrolisis asam, beberapa ikatan amida antara asam amino alifatik lebih
sulit untuk dibelah. Tautan Ala–Ala, Ile–Ile, Val–Val, Val–Ile, Ile–Val, dan Ala–Val tahan
terhadap hidrolisis dan mungkin memerlukan waktu hidrolisis yang lebih lama yaitu 48
atau 72 jam pada suhu 110ºC (35).

Referensi

1. Ensiklopedi Ilmu Pangan Teknologi Pangan dan Gizi, vol. 1 (Macrae, R., Robinson, RK,
and Sadler, MJ, eds.), Academic, London, hal. 149.
2. Hobohm, U., Houthaeve, T., dan Sander, C. (1994) Analisis asam amino dan pencarian
komposisi database protein sebagai metode cepat dan murah untuk mengidentifikasi
protein. Anal. Biokimia. 222, 202–209.
3. Schegg, KM, Denslow, ND, Andersen, TT, Bao, YA, Cohen, SA, Mahrenholz, AM, dan
Mann, K. (1997) Kuantisasi dan identifikasi protein dengan analisis asam amino:
percobaan kolaboratif ABRF-96, dalam Teknik dalam Kimia Protein VIII (Marshak, D.,
ed.), Akademik, San Diego, CA, hlm. 207–216.
4. Braconnot, H. (1820) Ann. Chim. Fisika. 13, 113.
5. Moore, S. dan Stein, WH (1963) Penentuan kromatografi asam amino dengan
menggunakan peralatan pencatat otomatis, dalam Methods in Enzymology, vol. 6
(Colowick, SP dan Kaplan, NO, eds.), Academic, New York, hlm. 819–831.
6. Samejima, K., Dairman, W., dan Udenfriend, S. (1971) Kondensasi ninhidrin dengan
aldehida dan amina primer untuk menghasilkan produk terner yang sangat berpendar. 1.
Studi tentang mekanisme reaksi dan beberapa karakteristik produk kondensasi. Anal.
Biokimia. 42, 222–236.
7. Stein, S., Bohlen, P., Stone, J., Dairman, W., dan Udenfriend, S. (1973) Analisis asam
amino dengan fluorescamine pada tingkat picomole. Lengkungan. Biokimia. Biofisika.
155, 202–212.
8. Roth, M. (1971) Reaksi fluoresensi untuk asam amino. Anal. kimia 43, 880–882.
9. Tapuhi, Y., Schmidt, DE, Lindner, W., dan Karger, BL (1981) Dansilasi asam amino untuk
analisis kromatografi cair kinerja tinggi. Anal. Biokimia. 115, 123–129.

10. Bidlingmeyer, BA, Cohen, SA, dan Tarvin, T. (1984) Analisis cepat asam amino
menggunakan derivatisasi pra-kolom. J. Kromatog. 336, 93–104.
Machine Translated by Google

6 Tyler

11. Haynes, PA, Sheumack, D., Kibby, J., dan Redmond, JW (1991) Analisis asam amino
menggunakan derivatisasi dengan 9-fluorenylmethyl chloroformate dan fase terbalik
kromatografi cair kinerja tinggi. J. Kromatog. 540, 177–185.
12. Strydom, DJ dan Cohen, SA (1993) dalam Teknik Kimia Protein IV (Angeletti, RH,
ed.), Akademik, San Diego, CA, hlm. 299–307.
13. Marenholz, AM, Denslow, ND, Andersen, TT, Schegg, KM, Mann, K., Cohen, SA,
dkk. (1996) Analisis asam amino — pemulihan dari membran PVDF: percobaan
kolaboratif ABRF-95AAA, dalam Teknik Kimia Protein VII (Marsak, DR, ed.),
Akademik, San Diego, CA, hlm. 323–330.
14. Tarr, GE, Paxton, RJ, Pan, YC-E, Ericsson, LH, dan Crabb, JW (1991)
Analisis asam amino 1990: studi kolaboratif ketiga dari asosiasi fasilitas sumber daya
biomolekuler (ABRF) dalam Teknik Kimia Protein II (Villafranca, JJ, ed.), Akademik,
San Diego, CA, hlm. 139–150.
15. Strydom, DJ dan Cohen, SA (1994) Perbandingan analisis asam amino dengan
derivatisasi precolumn phenylisothiocyanate dan 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimyl
carbamate. Anal. Biokimia. 222, 19–28.
16. Delhaye, S. dan Landry, J. (1986) Kromatografi cair kinerja tinggi dan spektrofotometri
ultraviolet untuk kuantisasi triptofan dalam sate hidrolis baritik. Anal. Biokimia. 159,
175–178.
17. Cohen, SA, Meys, M., dan Tarvin, TL (1988) Metode PicoTag. Manual Teknik Lanjutan
untuk Analisis Asam Amino. Divisi Kromatografi Perairan, Millipore Corp., Milford, MA.

18. Yokote, Y., Murayama, A., dan Akahane, K. (1985) Pemulihan triptofan dari hidrolisat
asam protein selama 25 menit. Anal. Biokimia. 152, 245–249.
19. Ng, LT, Pascaud, A., dan Pascaud, M. (1987) hidrolisis asam klorida protein dan
penentuan triptofan dengan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik. Anal.
Biokimia. 167, 47–52.
20. Yamada, H, Moriya, H., dan Tsugita, A. (1991) Pengembangan metode hidrolisis
asam dengan pemulihan triptofan dan sistein yang tinggi untuk mikrokuantitas
protein. Anal. Biokimia. 198, 1–5.
21. Barkholt, V. dan Jensen, AL (1989) Analisis asam amino: penentuan cys teine
ditambah setengah-cystine dalam protein setelah hidrolisis asam klorida dengan
senyawa disulfida sebagai aditif. Anal. Biokimia. 177, 318–322.
22. Hoogerheide, JG dan Campbell, CM (1992) Penentuan sistein ditambah setengah
sistin dalam protein dan hidrolisat peptida: penggunaan asam dithiodiglycolic dan
derivatisasi phenylisothiocyanate. Anal. Biokimia. 201, 146–151.
23. Inglis, AS (1983) Metode hidrolisis tunggal untuk semua asam amino, termasuk cys
teine dan tryptophan, dalam Methods in Enzymology, vol. 91. Akademik, San Diego,
CA, hlm. 26–36.
24. Yan, JX, Kett, WC, Herbert, BR, Gooley, AA, Packer, NH, dan Williams, KL (1998)
Identifikasi dan kuantisasi sistein dalam protein dipisahkan dengan elektroforesis
gel. J. Kromatog. 813, 187–200.
Machine Translated by Google

Amino Asam Analisis 7

25. D'Aniello, A., Petrucelli, L., Gardner, C., dan Fisher, G. (1993) Peningkatan metode untuk
menghidrolisis protein dan peptida tanpa memperkenalkan rasemisasi dan untuk
menentukan kandungan asam D-amino yang sebenarnya. Anal. Biokimia. 213, 290–295.
26. Yan, JX, Packer, NH, Gooley, AA, dan Williams, KL (1998) Protein fosforilasi: teknologi
untuk identifikasi asam fosfoamino. J.
kromatografi. A.808 , 23–41.
27. Yüksel, K. Ü., Andersen, TT, Apostol, I., Fox, JW, Crabb, JW, Paxton, RJ, and Strydom,
DJ (1994) Analisis asam amino fosfo-peptida: ABRF-93AAA, dalam Teknik dalam Kimia
Protein V (Crabb, JW, ed.), Akademik, San Diego, CA, hlm. 231–240.

28. Meyer, HE, Swiderek, K., Hoffmann-Posorske, E., Korte, H., dan Heilmeyer, L.
M., Jr. (1987) Penentuan kuantitatif fosfoserin dengan kromatografi cair kinerja tinggi
sebagai feniltiokarbamil-S-etilsistein. Aplikasi untuk jumlah peptida dan protein picomolar.
J. Kromatog. 397, 113–121.
29. Ringer, DP (1991) Pemisahan fosfotirosin, fosfoserin dan fosfotreonin dengan kromatografi
cair kinerja tinggi, dalam Methods in Enzymology, vol. 201. Akademik, San Diego, CA,
hlm. 3–10.
30. Manual Operator Sistem Analisis Asam Amino Waters AccQ.Tag (1993). Millipore Corp.,
Melford, MA.
31. Packer, NH, Lawson, MA, Jardine, DR, Sanchez, JC, dan Gooley, AA
(1998) Menganalisis glikoprotein yang dipisahkan dengan elektroforesis gel dua dimensi.
Elektroforesis 19, 981–988.
32. Walton, DJ dan McPherson, JD (1987) Analisis asam amino terglikasi dengan kromatografi
cair kinerja tinggi turunan feniltiokarbamil. Anal.
Biokimia. 164, 547–553.
33. Cayot, P. dan Tainturier, G. (1997) Kuantisasi gugus protein amino dengan metode asam
trinitrobenzenesulfonic: pemeriksaan ulang. Anal. Biokimia. 249, 184– 200.

34. Yüksel, K. Ü., Andersen, TT, Apostol, I., Fox, JW, Crabb, JW, Paxton, RJ, and Strydom,
DJ (1994) Proses hidrolisis dan kualitas analisis asam amino: ABRF- Uji coba kolaboratif
94AAA, dalam Teknik dalam Kimia Protein VI (Crabb, JW, ed.), Academic, San Diego,
CA, hlm. 185–192.
35. Ozols, J. (1990) Analisis asam amino, dalam Methods in Enzymology, vol. 182. Aca
demic, San Diego, CA, hlm. 587–601.