SV Total RNA Isolation System

Promega Z3101 (Blood)

Bahan yang harus disediakan user:

Persiapkan solusi Sistem Isolasi RNA Total SV

• 95% etanol, free RNase

• microcentrifuge
• RNA Red Blood Cell Lysis Solution
• water bath atau heating block, dipanaskan hingga 70°C
• Heparin/EDTA
• Tube 1.5-2ml atau 15ml

Prosedur pengerjaan:

1. Masukkan 1 ml darah (ke dalam tube steril yang berisi heparin atau EDTA)
Catatan: Untuk 1 ml darah lengkap dapat diproses dalam tube 1,5–2 ml. Volume yang lebih besar bisa
diproses menggunakan tube berbentuk kerucut 15ml.
2. Sentrifugasi pada 3.000rpm selama 5 menit.
untuk menghasilkan darah yang relatif jernih supernatan (sekitar 30% dari total volume) dan pellet (sekitar
60-70% dari total volume). Buang supernatan dengan memipet secara hati-hati dari bagian atas tube. Hati
hati jangan sampai menyentuh pellet. Perhatikan plasma kemungkinan akan berwarna merah karena lisis
eritrosit.
3. Tambahkan 1ml Red Blood Cell Lysis Solution dan resuspensi pelet dengan pipet 4-5 kali secara hati-hati.
Catatan: Tiga volume (relatif terhadap volume darah) Red Blood Cell Lysis Solution sudah cukup untuk
melisiskan sel darah merah. Jika tube yang digunakan berukuran lebih besar, satu resuspensi dengan tiga
volume Larutan Lisis Sel Darah Merah sudah cukup.
4. Centrifuge pada 3.000rpm selama 5 menit.
Catatan: Pelet mungkin tidak terlihat. Buang 1 ml supernatan dengan memipet dari bagian atas dan buang.
Biarkan sisa supernatan dan pelet sel di dalam tube.
5. Ulangi Langkah 3 dan 4 sebanyak dua kali (total sebanyak 3 kali).
Catatan: Karena jumlah leukosit sekitar 1% dari total volume darah, ukuran pelet sel akan menurun secara
signifikan selama prosedur lisis sel darah merah. Maka lakukan langkah 3-5 dengan hati-hati untuk
menghindari hilangnya pellet.
6. Buang supernatant dan sisakan 100μl supernatan dari tube, hati-hati agar pellet tidak tersentuh. Pastikan
bahwa BME telah ditambahkan ke RNA Lysis Buffer. Tambahkan 175µl RNA Lysis Buffer ke dalam tube. Pipet
untuk meresuspensi dan melisiskan sel.
7. Tambahkan 350µl RNA Dilution Buffer (biru). Mix dengan membolak-balik 3-4 kali.
8. Simpan pada waterbath atau heatingblock suhu 70°C selama 3 menit.
Hati-hati inkubasi leboh dari 3 menit dapat mengakibatkan keutuhan RNA terganggu.
9. Centrifuge pada 12.000–14.000 × g selama 10 menit pada suhu 20–25°C.
10. Pindahkan lisat yang telah dibersihkan ke tube steril dengan cara dipipet.
11. Untuk spin purification, tambahkan 200µl etanol 95% ke dalam lisat, dan campur dengan pemipetan 3–4
kali. Pindahkan ke Spin Column Assembly. Centrifuge pada 12.000–14.000 × g selama satu menit. Untuk
vacum purification, tambahkan 200µl etanol 95% ke dalam lisat, dan campur dengan pemipetan 3–4 kali.
Pindahkan campuran ini ke Spin Column Assembly.