PERCOBAAN IV

ISOLASI
Tujuan Percobaan

Pada akhir praktikum diharapkan mahasiswa dapat memahami dan dapat

melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela pohon berikut analisis kualitatif golongan
senyawatersebut dengan metode kromatografi lapisan tipis.
Tinjauan Pustaka
Flavonoid merupakan salah satu kelompok senyawa metabolit sekunder yang paling
banyak ditemukan di dalam jaringan tanaman (Rajalakshmi, 2011). Flavonoid berperan
sebagai antioksidan dengan cara mendonasikan atom hidrogennya atau melalui
kemampuannya mengkelat logam, berada dalam bentuk glukosida (mengandung rantai
samping glukosa) atau dalam bentuk bebas yang disebut aglikon (Rajalakshmi, 2011).
Tanaman yang mengandung senyawa flavonoid dapat digunakan sebagai antikanker,
antioksidan, antiinflamasi, antialergi dan antihipertensi . Peran terpenting flavonoid dari
sayuran dan buah segar adalah mengurangi resiko terkena penyakit jantung dan stroke .
Menurut Sarastani (2012) kebanyakan sumber antioksidan alami adalah tanaman yang
mengandung senyawa fenol yang tersebar di seluruh bagian tanaman baik di kayu, biji,
daun, buah, akar, bunga maupun serbuk sari.
Flavonoid mempunyai kerangka dasar 15 atom karbon yang terdiri dari dua cincin
benzen (C6) terikat pada suatu rantai propana (C3) sehingga membentuk suatu susunan
C6-C3- C6. Kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzen tersubstitusi)
disambungkan oleh rantai alifatik tiga-karbon. Pengelompokan flavonoid dibedakan
berdasarkan cincin heterosiklik-oksigen tambahan dan gugus hidroksilnya. Salah satu
kelompok senyawa flavonoid adalah Quersetin yang memiliki lima gugus hidroksil
yang mampu meredam radikal bebas DPPH (Rahayu dkk, 2014). Flavonoid di alam
sering dijumpai dalam bentuk glikosidanya . Apabila suatu senyawa terdapat banyak
ikatan glikosidanya maka senyawa tersebut cenderung bersifat lebih polar. Sehingga
pada proses ekstraksi, senyawa metabolit sekunder akan lebih terekstrak pada pelarut-
pelarut polar, senyawa yang bekerja kurang spesifik karena terikat dengan gugus gula
dan pada proses pemisahan senyawa dengan KLT akan cenderung tertahan pada fase
diamnya. (Rahayu dkk, 2014)
Maserasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau
pengadukan pada temperatur kamar. Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip
metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan (Ferdiansyah, 2006). Metode
maserasi dipilih karena metode ini murah dan mudah dilakukan, selain itu
dikhawatirkan senyawa yang terkandung dalam kencur merupakan senyawa yang tidak
tahan terhadap panas. Untuk mendapatkan ekstrak dalam waktu yang relatif cepat dapat
dilakukan pengadukan dengan menggunakan shaker berkekuatan 120 rpm selama 24
jam Maserasi merupakan proses yang sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa
bahan alam. Perendaman sampel tumbuhan dengan maserasi akan terjadi kontak sampel
dan pelarut yang cukup lama. Terdistribusinya pelarut organik yang terus menerus ke
dalam sel tumbuhan mengakibatkan perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel.
Sehingga, pemecahan dinding dan membran sel dan metabolit sekunder yang berada
dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik. Hal ini membuat ekstraksi
senyawa berlangsung sempurna karena lama perendaman yang dilakukan .Kelebihan
dari metode maserasi adalah sederhana, relatif murah, tidak memerlukan peralatan yang
rumit, terjadi kontak antara sampel dan pelarut yang cukup lama dan dapat menghindari
kerusakan komponen senyawa yang tidak tahan panas. Kekurangan dari metode ini
adalah membutuhkan waktu yang lama untuk mencari pelarut organik yang dapat
melarutkan dengan baik senyawa yang akan diisolasi dan harus mempunyai titik didih
yang tinggi pula sehingga tidak mudah menguap (Voight, 2010).
Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan komponen dalam suatu sampel
dimana komponen tersebut didistribusikan di antara dua fasa yaitu fasa gerak dan fasa
diam. Fasa gerak adalah fasa yang membawa cuplikan, sedangkan fase diam adalah fase
yang menahan cuplikan secara efektif .
Pada KLT pemisahan yang terjadi secara adsorbsi, sedangkan dalam kromatografi
kertas proses pemisahannya terjadi secara partisi. Fase diamnya berupa padatan
penyerap yang dihasilkan pada sebuah plat datar dari gelas, plastik atau alumunium
sehingga membentuk lapisan tipis dengan ketebalan tertentu. Pelarut sebagai fasa gerak
atau eluen merupakan faktor yang menentukan gerakan komponen-komponen dalam
campuran. Pemilihan pelarut tergantung pada sifat kelarutan komponen tersebut
terhadap pelarut yang digunakan. Trappe dalam Sastrohamidjojo mengatakan bahwa
kekuatan dari elusi deret-
deret pelarut untuk senyawa-senyawa dalam KLT dengan menggunakan silika gel akan
turun dengan urutan sebagai berikut : air murni > metanol > etanol > propanol > aseton
> etil asetat > kloroform > metil klorida > benzena > toluena > trikloroetilen
>tetraklorida
> sikloheksana > heksana. Fasa gerak yang bersifat lebih polar digunakan untuk
mengelusi senyawa-senyawa yang adsorbsinya kuat, sedangkan fasa gerak yang kurang
polar digunakan untuk mengelusi senyawa yang adsorbsinya lemah (Sastrohamidjojo,
2010).
Analisis suatu senyawa dalam KLT biasanya dilakukan dengan dibandingkan terhadap
senyawa standarnya. Pengamatan yang lazim berdasarkan pada kedudukan dari noda
relatif terhadap batas pelarut yang dikenal sebagai harga Rf (Retardation factor) yang
didefinisikan sebagai berikut : Rf = jarak komponen yang begerak atau jarak pelarut
yang bergerak. Identifikasi awal senyawa pada kromatogram dapat dilakukan dengan
melihat warna noda di bawah sinar UV atau dengan menyemprotkan pereaksi warna
sesuai dengan jenis atau kelas senyawa yang dianalisis Pemilihan pelarut yang tepat
akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa
bahan alam terhadap pelarut tersebut. Secara umum pelarut metanol merupakan pelarut
yang paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam,
karena dapat melarutkan seluruh golongan metabolit sekunder .Pelarut yang digunakan
pada penelitian ini yaitu etanol didasarkan pada pemilihan variasi pelarut yang sesuai.
Pelarut tersebut memiliki titik didih yang cukup rendah, pelarut dapat mudah diuapkan
tanpa menggunakan suhu yang tinggi, bersifat inert, dapat melarutkan senyawaan yang
sesuai dengan cukup cepat serta memiliki harga yang terjangkau .kelarutan terhadap air
dari etanol tersebut juga semakin tinggi dengan semakin tingginya tingkat kepolarannya.
Titik didih masing etanol 78 °C. Flavonoid mempunyai sejumlah gugushidroksil
sehingga merupakan senyawa polar .melakukan isolasi flavonoid dengan pelarut
methanol, etanol
p.a dan etanol 70%. Pada hasil penelitiannya menunjukan bahwa pelarut dengan
kepolaran yang lebih rendah dapat mengekstrak flavonoid dalam konsentrasi tinggi.
Metode Praktikum

A. Alat

1. Penguap putar (Rotary evaporator )

2. Penotol mikro
3. Pipet tetes
4. Papan tetes
5. Lampu ultra lembayung
6. Vial
7. Lempeng KLT
8. Kertas saring
9. Pinset
10. Tabung reaksi
11. Alat-alat gelas
12. Alat penyemprot lempeng KLT

B. Bahan

Simplisia Manihot utilissima Pohl

 Cara Kerja

a) Isolasi

Timbang 40 gram serbuk bahan, masukkan dalam panci

infus dan tambahkan 240 ml air lalu Didihkan selama 30
menit

campuran melalui corong Buchner sehingga diperoleh filtrat yang jernih dan pindahkan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang be

Simpan dalam lemari es selama 1 minggu sehingga terbentuk kristal amorf putih kekuningan

an jernih dengan hati- hati agar kristal tidak ikut tertuang, kemudian saring kristal yang ada pada dasar erlenmeyer melalui ke

kristal yang menempel pada dasar erlenmeyer bilas dengan air suling dan tuangkan bilasan ke kertas saring, cuci kristal deng

rtas saring bersama endapan pada suhu 50 °C, sampai kering kemudian ditimbang untuk memperoleh rendemen dari hasil ya
 b) Identifikasi

Ambil sedikit padatan dengan ujung spatel kecil, larutkan dalam 2 ml campuran metanol air sama banyak, vorteks hingga lar

Larutan siap dianalisis secara kualitatif dengan kromatografi lapis tipis dengan kondisi :
Fase diam: Silika gel GF 254 Fase gerak: asam asetat 15 %
Cupilkan: larutan sampel dan pembanding larutan rutin dalam metanol 50 %masing- masing
Deteksi: Uap amoniak, dibawah sinar tampak dan UV 366

Setiap kali deteksi, tandai bercak flavonoaid yang terlihat dengan sebuah titik di sebelah k
Daftar Pustaka

Priyanto RA. A, 2012. Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif pada Buah Bakau
(Rhizophora mucronata Lamk.). Departemen Teknologi Hasil Perairan Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor.
Rajalakhsmi, D dan S. Narasimhan. 2011. Food Antioxidants : Sources and Methods of
Evaluation dalam D.L. Madhavi: Food Antooxidants,
Technologial Toxilogical and Health Perspectives. Marcel Dekker Inc., Hongkong : 76-
77.
Sarastani, D., Suwarna T., Soekarto, T., Muchtadi, R. 2012. Aktivitas Antioksidan
Ekstrak dan Fraksi Ekstrak Biji Atung. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan.
Vol. XIII No. 2. 149-156.
Sastrohamidjojo, H. 2010. Kromatografi. Yogyakarta: Liberty.
Voight R. 2010. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, diterjemahkan oleh
Soendarinoerono. Gajah Mada Universitty Press : Yogyakarta