Modul Praktikum - Isolasi DNA - TF
Modul Praktikum - Isolasi DNA - TF
BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
Disusun oleh:
Tessa Fauziah, S.Si., M.Si.
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI
PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SINGAPERBANGSA KARARWANG
2023
ISOLASI DNA
I. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu menjabarkan tahapan isolasi DNA
2. Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA
III.2 Prosedur
Tahapan isolasi DNA genom dari tanaman berikut mengikuti protokol dari Doyle & Doyle
(1987) dengan modifikasi.
1. Dokumentasikan setiap langkah dalam praktikum ini.
2. Buat 800 uL CTAB isolation buffer dalam microtube 2 mL dengan komposisi seperti
berikut.
Tabel 1. Kompisisi CTAB isolation buffer
No. Komponen Konsentrasi Konsentrasi Vol. yang
akhir stok ditambahkan
1 CTAB 2% 100%
2 EDTA pH 8.0 20 mM 0,5 M
3 Tris-HCl pH 8.0 100 mM 1M
4 NaCl 1,4 M 5M
5 2-mercaptoethanol 0,2 %
6 PVP40 100 mg/g sampel
Total volume 600 uL
3. Panaskan CTAB isolation buffer pada suhu 65oC dalam water bath atau dry bath.
4. Gerus 0,5 gram jaringan daun padi menggunakan lumpang dan alu serta nitrogen cair
mortar hingga halus berbentuk powder atau bubuk.
5. Masukan sampel bubuk ke dalam microtube 2 mL berisi CTAB isolation buffer (poin 1)
6. Inkubasi homogenate pada suhu 65oC selama 30 menit, setiap 10 menit dihomogenkan
menggunakan vortex selama 1 menit.
7. Setelah itu, tambahkan kloroform:isoamil alkohol (C:I) 24:1 sebanyak 1 volume larutan
sampel (±600 uL).
8. Vortex homogenat selama 2 menit.
9. Setelah itu, sentrifuga selama 20 menit pada suhu 4o C, 6000 rpm.
10. Pindahkan supernatan (bagian cairan paling atas) ke microtube 2 mL baru dengan perlahan
menggunakan mikropipet 100 uL.
11. Tambahkan 1 volume 0,5 M NH4Ac (±600 uL) dan isopropanol dingin (±600).
12. Inkubasi selama 1 jam pada suhu -20ºC.
13. Setelah inkubasi selesai, sentrifuga pada suhu 4ºC, 6000 rpm selama 20 menit, untuk
memperoleh pelet DNA.
14. Buang supernatan dan cuci pelet dengan menambahkan 200 uL etanol dingin 70% dan
sentrifuga pada suhu 4ºC, 6000 rpm selama 20 menit.
15. Tandai pelet di microtube dengan spidol lalu kering anginkan pelet dengan membalikan
microtube diatas tisu dan dibiarkan 10-15 menit terkena udara agar etanol hilang.
16. Larutkan pelet DNA dalam 30 µL NFW.
17. Simpan isolat DNA pada suhu -20ºC jika untuk analisis selanjutnya.
Referensi
Aboul-Maaty, N.AF., Oraby, H.AS. Extraction of high-quality genomic DNA from different
plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent 43, 25 (2019).
https://doi.org/10.1186/s42269-019-0066-1
Ardiana, Dwi Wahyuni. 2009. Teknik Isolasi Dna Genom Tanaman Pepaya Dan Jeruk Dengan
Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 (1), 12-16.
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. (1987): A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochem. Bull., 19, 11-15.
Triani, N. (2020). ISOLASI DNA TANAMAN JERUK DENGAN MENGGUNAKAN
METODE CTAB (CETYL TRIMETHYL AMMONIUM BROMIDE). G-Tech: Jurnal
Teknologi Terapan, 3(2), 221–226. https://doi.org/10.33379/gtech.v3i2.419