Aquaculture Microbiology

Machine Translated by Google
John Thomas
Editor Natarajan Amaresan
Akuakultur
Mikrobiologi
BUKU PEGANGAN S PRINGER P ROTOCOLS
Untuk volume lebih

lanjut: http://www.springer.com/series/8623
Buku Pegangan Protokol Springer mengumpulkan beragam metode dan protokol laboratorium
langkah demi langkah dari seluruh kehidupan dan ilmu biomedis. Setiap protokol disediakan
dalam format Protokol Springer: siap direproduksi secara bertahap. Setiap protokol dibuka
dengan ikhtisar pengantar, daftar bahan dan reagen yang diperlukan untuk menyelesaikan
eksperimen, dan diikuti dengan prosedur mendetail yang didukung oleh bagian catatan
bermanfaat yang menawarkan tip dan trik perdagangan serta saran pemecahan masalah.
Dengan fokus pada koleksi protokol besar yang komprehensif dan kepenulisan internasional,
Buku Pegangan Protokol Springer adalah tambahan yang berharga untuk laboratorium.
Mikrobiologi Akuakultur
Diedit oleh
John Thomas
Pusat Nanobioteknologi, Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India
Natarajan Amaresan
Institut Bioteknologi CG Bhakta, Universitas Uka Tarsadia, Surat, Gujarat, India
Editor
John Thomas Natarajan Amaresan
Pusat Nanobioteknologi CG Bhakta Institut Bioteknologi
Institut Teknologi Vellore Universitas Uka Tarsadia
Vellore, Tamil Nadu, India Surat, Gujarat, India
ISSN 1949-2448 ISSN 1949-2456 (elektronik)

Springer Protocols Handbooks
ISBN 978-1-0716-3031-0 ISBN 978-1-0716-3032-7 (eBook) https://doi.org/
10.1007/978-1-0716-3032-7
© Editor (jika ada) dan Penulis, di bawah lisensi eksklusif untuk Springer Science+Business Media, LLC, bagian dari Springer Nature 2023 Karya
ini tunduk pada hak cipta.
Semua hak semata-mata dan secara eksklusif dilisensikan oleh Penerbit, baik keseluruhan atau sebagian dari materi yang bersangkutan,
khususnya hak penerjemahan, pencetakan ulang, penggunaan kembali ilustrasi, pembacaan, penyiaran, reproduksi pada mikrofilm atau dengan
cara fisik lainnya, dan transmisi atau penyimpanan dan pengambilan informasi, adaptasi elektronik, perangkat lunak komputer, atau dengan
metodologi serupa atau berbeda yang sekarang dikenal atau selanjutnya dikembangkan.
Penggunaan nama deskriptif umum, nama terdaftar, merek dagang, merek layanan, dll. dalam publikasi ini tidak menyiratkan, meskipun tidak ada
pernyataan khusus, bahwa nama tersebut dikecualikan dari undang-undang dan peraturan perlindungan yang relevan dan oleh karena itu bebas
untuk penggunaan umum. menggunakan.
Penerbit, penulis, dan editor dapat berasumsi bahwa nasihat dan informasi dalam buku ini diyakini benar dan akurat pada tanggal penerbitan.
Baik penerbit maupun penulis atau editor tidak memberikan jaminan, tersurat maupun tersirat, sehubungan dengan materi yang terkandung di sini
atau atas kesalahan atau kelalaian yang mungkin telah dibuat. Penerbit tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang
diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.
Jejak Humana ini diterbitkan oleh perusahaan terdaftar Springer Science+Business Media, LLC, bagian dari Springer Nature.
Alamat perusahaan terdaftar adalah: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, USA
Kata pengantar
Manual ini terdiri dari beberapa bab yang berhubungan dengan teknik yang terlibat dalam studi
patogen akuatik yang menyebabkan infeksi, terutama pada ikan. Ini mencakup berbagai teknik
dasar dan lanjutan yang terkait dengan penelitian tentang isolasi dan identifikasi patogen bakteri,
virus, dan jamur, dan bakteri probiotik. Selain itu, membahas pengobatan patogen menggunakan
ekstrak rumput laut, ekstrak tumbuhan obat, dan actinomycetes.
Pengetahuan dan informasi yang dibagikan dalam manual ini memberikan informasi tentang
berbagai protokol yang harus diikuti saat melakukan percobaan. Para editor sangat berterima kasih
kepada setiap penulis atau tim penulis yang meluangkan waktu untuk menulis bab yang
komprehensif berdasarkan keahlian mereka dalam berbagai protokol. Protokol-protokol yang
tercakup dalam manual ini diikuti secara luas oleh para peneliti dan, karenanya, akan sangat
berguna. Mahasiswa pasca sarjana, sarjana penelitian, postdoctoral fellows, dan guru dari
berbagai disiplin ilmu dalam mikrobiologi, bioteknologi, dan ilmu kelautan adalah target pembaca
manual ini. Membaca manual ini akan memicu diskusi lebih lanjut di antara para peneliti yang
bekerja di akuakultur, bioteknologi, mikrobiologi, dan mata pelajaran terkait lainnya, sehingga
memperluas cakupannya yang lebih luas. Peneliti akan mendapatkan lebih banyak pengetahuan
tentang informasi yang dibagikan di sini tentang berbagai protokol.
Vellore, Tamil Nadu, India John Thomas

Surat, Gujarat, India Natarajan Amaresan
Oktober 2022
ay
Isi
kata pengantar. . ............................................................... ................. ay
Kontributor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
BAGIAN I ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PATOGEN DARI IKAN
1 Isolasi dan Identifikasi Aeromonas sp. dari Ikan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Mirunalini Ganesan, Ravi Mani, and Sakthinarenderan Sai
2 Isolasi dan Identifikasi Mikroorganisme Penyebab Edwardsiellosis. . . . . . . . 11
Sakthinarenderan Sai, Ravi Mani, dan Mirunalini Ganesan
3 Metode Karakterisasi Flavobacterium pada Ikan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Yamini Gopi, Sakthinarenderan Sai, Mirunalini Ganesan, dan Ravi
Mani
4 Isolasi dan Identifikasi Spesies Citrobacter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Sakthinarenderan
Sai, Ravi Mani, dan Mirunalini Ganesan 5 Isolasi dan Identifikasi Virus
Infectious Salmon Anemia dari
Udang. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Haimanti
Mondal, John Thomas, Natrajan Chandrasekaran, dan Amitava
Mukherjee
6 Isolasi dan Identifikasi Betanodavirus dari Udang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Haimanti Mondal, John Thomas, Natrajan Chandrasekaran, Amitava
Mukherjee, dan Natarajan Amaresan 7 Isolasi dan
Identifikasi Virus Hemorrhagic Septicemia
dari udang. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Haimanti Mondal, John Thomas, Natrajan Chandrasekaran, Amitava
Mukherjee, and Natarajan Amaresan 8 Isolasi dan
Identifikasi Patogen dari Ikan:
Tilapia Lake Virus (TiLV). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 SR
Saranya, Vernita Priya, AT Manishkumar, and R.
Sudhakaran
9 Isolasi dan Identifikasi Patogen dari Udang: IHHNV . . . . . . . . . . . . . 59
VM Amrutha, R. Bharath, K. Karthikeyan, R. Vidya, and R.
Sudhakaran
10 Isolasi dan Identifikasi Ichthyophonus hoferi dari Ikan . . . . . . . . . . . . . . . 69 Haimanti Mondal,
John Thomas, Natrajan Chandrasekaran, and Amitava Mukherjee 11
Isolasi dan Identifikasi
Branchiomyces demigrans dari Ikan . . . . . . . . . . 73 Haimanti Mondal, John Thomas, Natrajan
Chandrasekaran, dan Amitava Mukherjee
vi
viii Isi
12 Isolasi dan Identifikasi Parasit Microsporidian, Enterocytozoon

hepatopenaei Infeksi Udang Penaeid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 K.
Karthikeyan, VM Amrutha, SR Saranya, dan R.
Sudhakaran
BAGIAN II ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PROBIOTIK

DALAM AKUAKULTUR
Metode Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Mahalakshmi S. Patil, . . . . . . . . . 85 13
Raghu Ram Achar, dan Ann Catherine Archer
14 Isolasi Bakteri Probiotik dari Usus Hewan Perairan. . . . . . . . . . . . . . 99 S. Vidhya Hindu dan John
Thomas 15 Karakterisasi Sifat Probiotik
dari Isolasi Bakteri . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Mahalakshmi S. Patil, Raghu Ram Achar, dan Ann
Catherine Archer
16 Aktivitas Antibakteri Bakteri Probiotik dari Akuakultur. . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Mahalakshmi S.

Patil, Anagha Sudhama Jahgirdar, Ann Catherine Archer,
dan Raghu Ram Achar
BAGIAN III METODE PENGOBATAN INFEKSI PADA IKAN DAN UDANG
17 Pembuatan Ekstrak Alga Laut (Rumput Laut) dan Kuantifikasi

dari Phytocompound. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 S.
Thanigaivel, John Thomas, Natrajan Chandrasekaran, and
Amitava Mukherjee
18 Mengobati Infeksi Bakteri pada Ikan dan Udang
Menggunakan Ekstrak ................................................. 141
Rumput Laut S. Thanigaivel, John Thomas, Natrajan
Chandrasekaran, dan Amitava Mukherjee
19 Penyiapan dan Perawatan Pakan Pelet Enkapsulasi Rumput Laut di Perikanan
Akuakultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 S.
Thanigaivel, John Thomas, Natrajan Chandrasekaran, and
Amitava Mukherjee
20 Perlakuan Penggunaan Rumput Laut pada Ikan dan Udang dengan Metode In Vivo . . . . . . . . .
149 R. Bharath, K. Karthikeyan, R. Vidya, dan R. Sudhakaran
BAGIAN IV PENGOBATAN MENGGUNAKAN TANAMAN OBAT
21 Pengobatan Menggunakan Tanaman Obat Pada Ikan dan Udang. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159

Vernita Priya, AT Manishkumar, K. Karthikeyan, and R.
Sudhakaran
22 Penyiapan Pakan dan Karakterisasi Pakan yang Disuplementasi dengan
Phytocompounds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 N. Chandra
Mohana, AM Nethravathi, Raghu Ram Achar, KM Anil Kumar, dan
Jalahalli M. Siddesha
Isi ix
BAGIAN V AQUATIC ACTINOMYCETES DAN COPEPODS
23 Isolasi dan Identifikasi Actinomycetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Haimanti

Mondal, John Thomas, dan Natarajan Amaresan 24 Uji Aktivitas
Hemolitik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 Haimanti Mondal, John
Thomas, dan Natarajan Amaresan 25 Uji
Sitotoksisitas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 Haimanti
Mondal, John Thomas, dan Natarajan Amaresan
26 Aktivitas Antibakteri dan Ekstraksi Senyawa Bioaktif
dari Actinomycetes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
Haimanti Mondal, John Thomas, and Natarajan Amaresan 27 Isolasi
dan Identifikasi Harpacticoid Copepod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
MF Yasmeen dan A. Saboor
Indeks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
Kontributor
RAGHU RAM ACHAR • Divisi Biokimia, Fakultas Ilmu Hayati, Akademi Tinggi JSS
Pendidikan & Penelitian, Mysuru, Karnataka, India
NATARAJAN AMARESAN • Institut Bioteknologi CG Bhakta, Universitas Uka Tarsadia,
Bardoli, Surat, Gujarat, India
VM AMRUTHA • Laboratorium Bioteknologi Akuakultur, School of Bio Sciences and
Technology, Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India KM
ANIL KUMAR • Departemen Ilmu Lingkungan , JSS Academy of Higher Education &
Research, Mysuru, India ANN
CATHERINE ARCHER • Departemen of Microbiology, JSS Academy of Higher Education &
Research, Mysuru, Karnataka, India R.
BHARATH • VIT School of Agricultural Innovations and Advanced Learning (VAIAL), Institut
Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India; Laboratorium Bioteknologi Akuakultur,
Sekolah Ilmu dan Teknologi Bio, Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India N.
CHANDRA MOHANA
• Departemen Mikrobiologi, Akademi Pendidikan Tinggi & Penelitian JSS, Mysuru, India
NATRAJAN
CHANDRASEKARAN • Pusat Nanobioteknologi, Vellore Institut Teknologi, Vellore, Tamil Nadu,
India MIRUNALINI
GANESAN • Pusat Penelitian Kelautan, Kol. Dr. Fasilitas Lapangan Penelitian Kelautan
Jeppiaar, Institut Sains dan Teknologi Sathyabama (Dianggap sebagai Universitas),
Chennai, Tamil Nadu, India
YAMINI GOPI • Pusat Penelitian Kelautan, Col. Dr. Jeppiaar Ocean Research Field Facility,
Sathyabama Institute of Science and Technology (Dianggap sebagai Universitas),
K. KARTHIKEYAN • Laboratorium Bioteknologi Akuakultur, Sekolah Sains dan
Teknologi Bio, Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India
RAVI MANI • Pusat Penelitian Kelautan, Kolonel Dr. Jeppiaar Fasilitas Lapangan
Penelitian Kelautan, Institut Sains dan Teknologi Sathyabama (Dianggap sebagai
Universitas),
Chennai, Tamil Nadu, India AT MANISHKUMAR • Laboratorium Bioteknologi Akuakultur,
Sekolah Ilmu dan Teknologi Bio, Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India
HAIMANTI MONDAL • Pusat Nanobioteknologi, Vellore Institute of Technology, Vellore, Tamil
Nadu, India
AMITAVA MUKHERJEE • Pusat Nanobiotechnology, Vellore Institute of Technology, Vellore,
Tamil Nadu, India
AM NETHRAVATHI • Post Graduate Department of Studies and Research in Biotechnology,
Sahyadri Sekolah Tinggi Sains (Otonomi), Universitas Kuvempu, Shivamogga, India
MAHALAKSHMI S. PATIL • Departemen Mikrobiologi, Akademi Pendidikan Tinggi & Penelitian
JSS, Mysuru, Karnataka, India
VERNITA PRIYA • Laboratorium Bioteknologi Akuakultur, Sekolah Ilmu dan Teknologi
Bio, Institut Vellore Teknologi, Vellore, Tamil Nadu, India A. SABOOR •
PG & Departemen Riset Zoologi, Perguruan Tinggi Baru (Otonomi),
xi
xii Kontributor
SAKTHINARENDERAN SAI • Pusat Penelitian Kelautan, Col. Dr. Jeppiaar Ocean Research
Field Facility, Sathyabama Institute of Science and Technology (Dianggap
Universitas), Chennai, Tamil Nadu, India
SR SARANYA • Laboratorium Bioteknologi Akuakultur, School of Bio Sciences and
Technology, Vellore Institute of Technology, Vellore, Tamil
Nadu, India JALAHALLI M. SIDDESHA • Divisi Biokimia, School of Life Sciences, JSS Academy of
Pendidikan Tinggi & Penelitian, Mysuru, India
R. SUHDAKARAN • Laboratorium Bioteknologi Akuakultur, Sekolah Ilmu dan
Teknologi Bio, Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India
ANAGHA SUDHAMA JAHGIRDAR • Departemen Studi Zoologi, Universitas Mysore,
Mysuru, Karnataka, India
S. THANIGAIVEL • Departemen Bioteknologi, Fakultas Sains & Humaniora, Institut Sains
dan Teknologi SRM, Kattankulathur, Tamil Nadu, India JOHN THOMAS
• Pusat Nanobioteknologi, Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil
Nadu, India
S. VIDHYA HINDU • Sekolah Tinggi Seni dan Sains Jaya, Thiruvallur, Tamil Nadu, India
R. VIDYA • Sekolah VIT Inovasi Pertanian dan Pembelajaran Lanjutan (VAIAL),
Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India
MF YASMEEN • PG & Departemen Riset Zoologi, Universitas Keadilan Basheer Ahmed
Sayeed untuk Wanita (Otonomi), Chennai, Tamil Nadu, India
Bagian I
Isolasi dan Identifikasi Patogen dari Ikan

Bab 1
Isolasi dan Identifikasi Aeromonas sp. dari Ikan

Mirunalini Ganesan, Ravi Mani, and Sakthinarenderan Sai
Abstrak
Aeromonas merupakan bakteri patogen penting yang sering diisolasi dari ikan berpenyakit di seluruh dunia. Penyakit
ikan bakteri, terutama septikemia hemoragik bakteri dan septikemia Aeromonas motil pada ikan air tawar,
menyebabkan kerugian besar. Para peneliti mengamati perubahan histopatologis pada usus, hati, dan ginjal ikan
yang terkena. Banyak peneliti telah mengisolasi dan mengidentifikasi Aeromonas hydrophila dari ikan mas, lele,
bertengger, dan belut dan menemukan bahwa mereka sangat patogen. Di sini, kami menjelaskan metode yang
digunakan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi Aeromonas spp. pada ikan dengan tes biokimia dan cara lain.
Tujuan kami adalah memberikan pedoman kepada pembaca tentang cara mengidentifikasi infeksi Aeromonas dan mengisolasi bak
Kata kunci Bakteri penyakit ikan, Aeromonas, Isolasi, Identifikasi, Karakterisasi
1. Perkenalan
Aeromonas spp. adalah patogen oportunistik yang sering

menyebabkan infeksi akibat kerusakan inang atau stres [1].
Penyakit manusia yang disebabkan oleh bakteri ini termasuk
endokarditis, gastroenteritis, peritonitis, dan septikemia [2].
Mereka juga merupakan infeksi yang paling umum pada ikan
budidaya [3]. Aeromonas spp., antara lain A. caviae, A. veronii,
A. salmonicida [4, 5], A. hydrophila [6], A. sobria, dan A.
bestiarum. Di antaranya, A. hydrophila dianggap paling berbahaya
bagi hewan air, menyebabkan penyakit hemoragik pada ikan
budidaya secara teratur [7]. A. veronii, di sisi lain, baru-baru ini
ditemukan menginfeksi ikan dengan banyak gejala dan kelainan
histologis yang sama dengan A. hydrophila. Faktor virulensi
digunakan untuk mengukur virulensi dan toksisitas infeksi bakteri.
Patogenisitas A. veronii sebagian besar disebabkan faktor
virulensi dan interaksi sinergis. Faktor virulensi termasuk
enterotoksin sitotoksik (act, alt, ast), aerolysin (aer), polar flagella
(fla), serin protease (ser), elastase (ahyB), lipase (bibir), DNase
(exu), gliserofosfolipid: kolesterol asiltransferase ( gcaT), dan sistem sekresi
John Thomas and Natarajan Amaresan (eds.), Aquaculture Microbiology, Springer Protocols Handbooks,
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_1,
© Penulis, di bawah lisensi eksklusif untuk Springer Science +Business Media, LLC, bagian dari Springer Nature 2023
3
4 Mirunalini Ganesan dkk.
patofisiologi dan epidemiologi A. veronii, sangat penting untuk mengeksplorasi

karakteristik terkait virulensi dari isolat klinis [8]. Namun, data dan informasi
mengenai ikan sakit masih langka.
Untuk mengklarifikasi apa yang merupakan platform pengembangan yang
menguntungkan untuk patogen ini, penting untuk menganalisis sifat pertumbuhan
isolat bakteri dalam berbagai keadaan. Aeromonas adalah bakteri lingkungan
perairan tertentu yang dapat ditransfer secara tidak teratur ke manusia [9, 10].
Makanan yang berasal dari hewan, ikan, dan sayuran telah lama dianggap
sebagai pembawa utama Aero monas spp. infeksi. Gastroenteritis adalah infeksi
manusia yang paling umum yang disebabkan oleh Aeromonas spp.; namun,
penyakit serius lainnya, seperti infeksi sistemik, lebih jarang terjadi dan biasanya
berhubungan dengan individu dengan gangguan sistem imun. Selanjutnya,
mikroba ini diketahui menyebabkan infeksi besar pada ikan. Aero monas spp.
dapat bertahan hidup dan berkembang biak pada suhu rendah pada berbagai
produk makanan yang disimpan antara 2 dan 10 C, seperti daging sapi, daging
sapi panggang, dan babi, bahkan dapat menghasilkan faktor virulensi pada suhu
rendah tersebut. Meskipun kejadian wabah bawaan makanan yang disebabkan
oleh Aeromonas spp. relatif rendah di masa lalu, keberadaan mereka dalam
rantai makanan tidak boleh diabaikan. Sedikit penelitian telah dilakukan pada
kejadian Aeromonas spp. pada ikan beku, padahal sudah banyak survei
prevalensi Aeromonas spp. dalam produk makanan. Selain itu, studi ini
menggunakan strain yang salah diidentifikasi menggunakan pendekatan biokimia
standar, yang menghasilkan hasil yang tidak memuaskan.
2 Bahan
2.1 Isolasi • Ikan yang terinfeksi.

Aeromonas dari • Jarum.
Ikan yang Terinfeksi
• Kit pembedahan.
• Cawan petri. •
Inkubator.
2.2 Metode • Lihat manual laboratorium mikrobiologi standar.

Pewarnaan dan Biokimia
2.3 Identifikasi • Bahan kimia halus reaksi PCR sesuai protokol standar. • Primer-
Molekul F-50 AGAGTTTGATCATGGCTCAG 30 ,R-50
GGTTACCTTGTTACGACTT30 .
• Thermocycler. •
Geldoc/transiluminator.
Isolasi dan Identifikasi Aeromonas sp. dari Ikan 5
3 Metode
3.1 Pengambilan Sampel Ikan • Kumpulkan ikan dengan tanda-tanda klinis seperti penggelapan kulit,
pendarahan luar, dan pendarahan dalam di hati, ginjal, dan kulit, atau
kombinasi dari gejala-gejala tersebut.
• Sterilkan peralatan, seperti jarum, dengan menyemprotnya dengan
alkohol 70% dan kemudian memaparkannya langsung ke api. •
Sterilkan cawan Petri dengan autoklaf selama 10–15 menit pada suhu 121
C dan tekanan 1 atm. • Bedah
hati, limpa, dan ginjal dari ikan setelah dibersihkan
kulit mereka dengan etil alkohol 75%.
3.2 Isolasi • Homogenkan organ yang dibedah dengan 2 mL PBS dan sentrifus pada
Bakteri 500 rpm selama 5 menit. • Buang
supernatan dan cuci pelet tiga kali
dengan PBS.
• Terakhir suspensikan pelet dengan 1 mL PBS steril. •

Siapkan medium Luria–Bertani (LB) (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract,
10 g/L NaCl, 15 g/L agar: pH 7) dan autoklaf.
• Tuangkan media yang telah diautoklaf ke dalam cawan Petri dan biarkan
memadat. • Tambahkan 0,1 ÿL pelet tersuspensi dan ratakan
pelat. • Inkubasi pada suhu 37 C selama 24-48 jam dan amati koloninya.
3.3 Identifikasi dari • Aeromonas adalah bakteri berbentuk batang, tidak membentuk spora,
Bakteri Aeromonas oksidase positif, memfermentasi glukosa, anaerob fakultatif, dan Gram-
negatif yang hidup di air.
• Aeromonas spp. koloni pada agar kedelai trypticase halus, cembung,
dan bulat, dan berwarna tan / buff. • Lakukan pewarnaan
Gram sesuai protokol standar.
3.4 Karakterisasi • Aeromonas spp. koloni pada agar kedelai trypticase halus, cembung,
dari Bakteri Aeromonas dan bulat, dan berwarna tan / buff. Hasil karakterisasi Aeromonas
spp. ditunjukkan pada Tabel 1. • Timbang 25 g daging ikan
secara aseptis dan homogenkan selama 2 menit dalam kantong stomiter
yang berisi 225 mL air alkali pepton. • Setelah 18 jam inkubasi pada
suhu 37 C, inokulasikan aliquot pengayaan dalam agar darah yang
mengandung 30 mg/L ampisilin dan inkubasi selama 24 jam pada
suhu 28 C.
• Pilih lebih atau kurang dari lima dugaan koloni Aeromonas untuk
identifikasi lebih lanjut, tetapi pertimbangkan hanya satu isolat yang
mewakili satu spesies dari setiap sampel untuk penghitungan kejadian.
Tabel 1
Hasil karakterisasi Aeromonas spp. [12]
Hasil untuk spesies berikut

Karakteristik A. hydrophila A. caviae A. sobria A. veronii A. salmonicida
Karakteristik fisiologis
Pewarnaan gram
Membentuk tongkat tongkat tongkat tongkat tongkat
Motilitas + + + + +
Katalase + + + + +
oksidase + + + + Nd
Gas dari glukosaa + + +
metil merah + + Nd Nd
Voges–Proskauera + +
Lisin dekarboksilasea + + + Nd
Ornitin dekarboksilasea + Nd
Vibriostatik 0/129 + + + Nd Nd
Produksi:
Indolea ++++ +
Urease Nd
Nitrat + + + Nd
Kongo merah + + Nd Nd
H2S dari L-sistein + Nd
Hidrolisis dari:
Arbutina + + Nd Nd Nd
Inulin Nd Nd
DNase + + Nd +
Elastina + Nd
Esculina + + +
Pati +++ Nd
agar-agar + +/ Nd Nd
Beta hemolisis + Nd +
Hemolisis alfa + Nd Nd
Prolin + + + Nd Nd
Asam dari:
(lanjutan)
Tabel
1 (lanjutan)
Adonitol
D-Arabitol + Nd
L-Arabitol Nd Nd
L-Arabinosea + Nd +
D-Arabinosa + + Nd Nd
D-Fukosa Nd Nd
L-Fukosa Nd Nd
Galaktosa + + + Nd Nd
Glukonat + + Nd
Dulcitol Nd
Laktosa + + + +
D-Mannitola + ++Nd +
Maltosa + + + + +
Melibiosa Nd +
Inositol
D-Manosa + + + + Nd
Salicin + + +
Malonat + Nd
D- Sorbitola
Sakarosa (sukrosa)a ++++ +
Pemanfaatan:
Asetat + + Nd Nd
Arginin dihidrolase + + Nd
Histidin + + + Nd Nd
Lisin + + + Nd Nd
Kasein + Nd Nd
Protease + + Nd Nd
Hemaglutinasi + Nd Nd
Kerentanan antibiotik
Ampisilin R R R R R
(lanjutan)
Tabel
1 (lanjutan)
Cephalothin R R S Nd R
Gentamisin R R R S NA
Penisilin R R R R NA
Tetrasiklin S S S S NA
Neomisin S S S M NA
Karbenisilin R R S Nd NA
Oksasilin S S S R NA
Kloramfenikol S S S S S
Nitrofurantoin S S S S NA
Cefuroxime S S S Nd NA
Cefotaxime S S S Nd NA
Ciprofloxacin R R R S NA
Klindamisin R R R R NA
Eritromisin R R R M R
Streptomisin R R R Nd NA
Imipenem S S S S NA
kanamisin R R R S NA
Piperasilin S S S R NA
Polimiksin B R R R S NA
Rifampisin R R R S NA
Trimethoprim-sulfamethoxazole S S S Nd NA
+ menunjukkan hasil positif, menunjukkan hasil negatif, +/ tidak dapat ditentukan, Nd tidak ditentukan, R resisten terhadap
antibiotik, S rentan terhadap antibiotik, resistensi medium M, NA tidak tersedia
A
Tes utama untuk Aeromonas spp.
• Pertahankan biakan stok dari setiap galur untuk waktu singkat pada
suhu kamar di atas dasar agar darah agar miring dan untuk
penyimpanan lebih lama, dan bekukan pada suhu 70 C dalam 20%
(b/v) gliserol– Kaldu Todd–Hewitt (Oxoid, Madrid, Spanyol ) atau
liofilisasi dalam serum glukosa kuda 7,5% sebagai krioprotektor.
3.4.1 Aktivitas Hemolitik • Pada basis agar (Oxoid) ditambah dengan 5% eritrosit domba, galur
dievaluasi aktivitas hemolitiknya.
• Oleskan setiap suspensi di atas pelat dengan lima mikroliter dan inkubasi selama
24 jam pada suhu 22 C dan 37 C.
• Kehadiran zona tidak berwarna yang berbeda di sekitar koloni menunjukkan

aktivitas hemolitik [11].
3.4.2 Aktivitas Proteolitik • Tentukan hidrolisis kasein dengan mengolesi setiap suspensi pada agar Mueller–
Hinton (Oxoid) yang mengandung 10% (b/v) susu skim (Difco, Barcelona,
Spanyol) dan inkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. • Aktivitas kaseinase
ditunjukkan dengan munculnya zona bening di sekitar koloni. Setiap suspensi

dimasukkan ke dalam sumur berdiameter 4 mm yang dipotong menjadi gel
agarosa dan diinkubasi selama 20 jam pada suhu 22 C.
• Endapkan gelatin yang tidak terhidrolisis dengan merendam pelat dalam larutan
amonium sulfat jenuh pada suhu 70 C.
• Aktivitas gelatinase ditunjukkan dengan munculnya zona bening di sekitar koloni.
3.4.3 Aktivitas Lipolitik • Oleskan 5 mL suspensi ke resazurin-butter agar dan incu

diamkan pada suhu 37 C selama 24 jam.
• Kehadiran koloni merah muda menunjukkan aktivitas lipase.
3.4.4 Aktivitas Nuklir • Nuklease ekstraseluler (DNase) ditentukan pada pelat agar DNase (Difco) dengan
metil hijau 0,005%. • Coretkan 5 µL suspensi bakteri
pada cawan dan inkubasi pada

37 C selama 24 jam.
• Lingkaran merah muda di sekitar koloni menunjukkan aktivitas nuklease.
3.4.5 Serapan Congo • Kemampuan menyerap pewarna merah Kongo ditentukan pada cawan agar yang
Red Dye dilengkapi dengan 50 ÿg/mL/mL pewarna merah Kongo. • Coretkan 5 µL
suspensi bakteri pada cawan dan inkubasi pada

37 C selama 24 jam.
• Koloni jeruk dianggap positif dan menunjukkan intensitas yang berbeda dalam
serapan pewarna sebagai + dan ++.
3.4.6 Molekul Identifikasi ulang semua strain berdasarkan pola polimorfisme panjang fragmen
Identifikasi restriksi (RFLP) yang diperoleh dari 16S rDNA mengikuti metode yang dijelaskan
oleh Borrell et al. [9].
Tambahkan 200 ÿM masing-masing dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP.
Tambahkan 5 ÿL 1 penyangga PCR (50 mM KCL, 10 mM Tris–HCl,

pH 8,3).
Tambahkan 5 ÿL 2,5 mM MgCl2.

Tambahkan 2 ÿL dari 5 pM dari setiap primer.
Tambahkan 3 ÿL dari 10 ng DNA genom.
Lakukan PCR dengan ketentuan sebagai berikut: denaturasi pada 93 C selama 3

menit, dilanjutkan dengan 35 siklus pada 94 C selama 1 menit, 56 C selama 1 menit,
dan 72 C selama 2 menit. Setelah siklus terakhir, ekstensi pada 72 C dibiarkan selama
10 menit.
3.4.7 Antimikroba Resistensi semua strain terhadap agen antimikroba yang berbeda ditentukan dengan
Kerawanan metode difusi cakram seperti yang dijelaskan oleh Institute CALS [12].
Terima kasih
Pekerjaan ini didukung oleh hibah Kementerian Ilmu Bumi (MoES) (MoES/36/OOIS/
53/2016), Pemerintah. India, dan Institut Sains dan Teknologi Sathyabama.
Referensi
1. Jeney Z, Jeney G (2020) Sejak Januari 2020 pada ikan zebra: identifikasi, karakterisasi,
Elsevier telah membuat pusat sumber daya patogenisitas, dan respons imun. Imunol Kerang
COVID-19 dengan informasi gratis dalam bahasa Ikan 80:573–581. https://doi. org/10.1016/
Inggris dan Man darin tentang novel coronavirus COVID-19.j.fsi.2018.06.049 7. Marinho-Neto
Pusat informasi COVID-19 dihosting di Elsevier FA, Claudiano GS, Yunis Aguinaga J et al (2019)
Connect, berita dan informasi publik perusahaan Aspek morfologis, mikrobiologis dan ultrastruktural
sepsis oleh Aeromonas hydrophila di Piaractus
2. Janda JM, Abbott L (2006) Enterobacteria. ASM mesopo tamicus. PLoS Satu 14:1–20. https://
Press, Washington, DC doi.org/ 10.1371/journal.pone.0222626 8. Sen K,
3. Hossain S, Dahanayake PS, De Silva BCJ et al Rodgers M (2004) Distribusi enam
(2019) Aeromonas spp. diisolasi dari ikan zebra faktor virulensi pada spesies Aeromonas yang
(Danio rerio): antibiotik gram, gen resistensi diisolasi dari utilitas air minum AS: identifikasi
antimikroba dan kaset gen integron kelas 1. Lett PCR. J Appl Microbiol 97:1077–1086. https://
Appl Mikrobiol 68:370–377. https://doi.org/10.1111/ doi.org/10.1111/j.1365-2672.2004. 02398.x
lam. 13138
4. Zhu M, Wang XR, Li J et al (2016) Identifikasi dan 9. Borrell N, Acinas SG, Figueras MJ, Martÿńez
sifat virulensi Aeromonas veronii bv. sobria isolat Murcia AJ (1997) Identifikasi isolat klinis
menyebabkan sindrom ulseratif loach Misgurnus Aeromonas dengan polimorfisme panjang fragmen
anguillicaudatus. restriksi gen 16S rRNA yang diamplifikasi PCR.
J Fish Dis 39:777–781. https://doi.org/10. 1111/ Mikrobiol J Clin 35:1671–1674. https: // apakah
jfd.12413 5. Long saya. org / 1 0. 1 1 2 8 / j cm. 3 5. 7. 1671-1674.1997
M, Nielsen TK, Leisner JJ et al (2016)
Aeromonas salmonicida subsp. galur salmonicida 10. Janda JM, Abbott SL (2010) Genus Aero monas:
yang diisolasi dari ikan air tawar Tiongkok taksonomi, patogenisitas, dan infeksi. Klinik
mengandung pulau genomik baru dan kemungkinan Mikrobiol Wahyu 23:35–73. https://doi.org/10.1128/
file pro elemen genetik bergerak spesifik regional. CMR.00039-09 11. Gerhardt P,
Mikrobiol FEMS Lett 363:1–8. https:// doi.org/ Murray RGE, Castilow RN, Nester EW, Wood WA,
10.1093/femsle/fnw190 6. Krieg NR, Phillips G (1981)
Chandrarathna HPSU, Nikapitiya C, Danan jaya Manual metode untuk bakteriologi umum.
SHS et al (2018) Hasil koinfeksi dengan Aeromonas Masyarakat Mikrobiologi Amerika, Washington,
hydrophila dan A. veronii yang resistan terhadap DC 12. Institut
berbagai obat dan oportunistik CALS (2008) Pl Pl Pl. Kualitas 1–6
Bab 2
Isolasi dan Identifikasi Penyebab Edwardsiellosis

Mikroorganisme
Abstrak
Isolasi dan identifikasi bakteri patogen sangat penting untuk manajemen kesehatan perairan. Mengidentifikasi
bakteri patogen yang tepat pada tingkat spesies sangat penting dalam mempersiapkan praktik pencegahan dan
pengelolaan penyakit. Edwardsiellosis adalah epidemi yang disebabkan oleh Edwardsiella sp. Hal ini menyebabkan
kerugian ekonomi yang besar bagi budidaya ikan di habitat laut dan air tawar. Bab ini membahas berbagai protokol
untuk isolasi dan identifikasi mereka.
Kata kunci Edwardsiella, API 20E, Immunoassay blot, amplifikasi Edwardsiellosis polimerase,
uji PCR
1. Perkenalan
Edwardsiellosis adalah wabah bakteri penting di sebagian besar

sistem akuakultur tropis. Organisme penyebab adalah bakteri
batang Gram negatif yang termasuk dalam famili
Enterobacteriaceae dan genus Edwardsiella [1]. Ini terdiri dari
lima spesies: E. tarda [2], E. ictaluri [3], E. hoshinae [4], E.
piscicida [5], dan E. anguillarum [6]. Wabah penyakit telah
dilaporkan pada 20 spesies ikan air tawar dan laut di seluruh
dunia [7, 8]. Isolasi dan identifikasi spesies ikan patogen penting
untuk pengendalian dan pencegahan kerugian ekonomi besar
dalam budidaya air. Bab ini menjelaskan protokol untuk
mengisolasi dan mengidentifikasi berbagai teknik identifikasi
yang digunakan untuk Edwardsiella spp. dari spesies ikan yang terinfeksi.
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_2,
11
12 Sakthinarenderan Sai dkk.
2 Bahan

Edwardsiella dari • Pisau bedah.
Ikan yang Terinfeksi
• Kit pembedahan.
Inkubator.

2.3 Identifikasi • Bahan kimia halus reaksi PCR sesuai protokol standar.
Molekul • Primer:
1. EtfD- F 5ÿGGTAACCTGATTTGGCGTTC 3ÿ.

EttR 5ÿGGATCACCTGGATCTTAT CC 3ÿ [9].
2. 16S rRNA- F 5ÿAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3ÿ
16S rRNA-R 5ÿ GGTTACCTTGT TACGACTT 3ÿ [10]. 5ÿ
3. EvpP- F
GTGATCAAAGAAAACTGGAGCTCTCTCGACTT3ÿ
R EypP-R 5ÿGACCGTCAGGTTTGGAATATAGAA CTGTGT3ÿ [11].
3 Metode
• Siapkan isolat bakteri dari organ seperti hati, usus, dan ginjal dari ikan yang
diinfestasi. Gunakan pisau bedah steril dan ambil sampel secara aseptik.
3.1 Isolasi dari • Setelah diseksi, homogenkan sampel jaringan dalam salin fisiologis (larutan
Edwardsiella spp. NaCl 0,5%). • Ambil homogenat
dengan ose steril dan guratkan pada agar tryptic soy dengan 5% darah domba
atau xylose lysine deoxycholate agar plate kemudian inkubasi pada suhu 37
°C selama 24 jam.
• Pigmentasi koloni bulat atau melingkar atau abu-abu atau putih keabu-abuan
setelah inkubasi 24 atau 48 jam merupakan ciri khas Edwardsiella spp.
• Pemeriksaan isolat bakteri dengan uji fenotipik, biokimia, dan molekuler untuk
identifikasi sampai tingkat spesies.
Isolasi dan Identifikasi Mikroorganisme Penyebab Edwardsiellosis 13
3.1.1 Isolasi E. • Amati koloni kecil berwarna putih keabu-abuan yang muncul pada agar xylose lysine
spesies tarda, E. piscicida, deoxycholate setelah 24 jam inkubasi pada suhu 37 °C.
dan E. hoshinae
• Subkultur pada cawan agar MacConkey dan inkubasi pada suhu 37 °C

selama 24 jam.
• Subkultur semua koloni laktosa non-fermentasi pada agar kedelai triptik yang mengandung
NaCl 0,5% dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. • Lakukan semua tes
identifikasi menggunakan biakan semalam dalam agar kedelai tryptic [12].
3.1.2 Isolasi dari • Lakukan pengamatan basah terhadap ikan yang terinfeksi (diduga E. ictaluri). • Gosok
Edwardsiella spp. homogenat sampel jaringan dalam agar kedelai trypticase dengan 5% pelat agar darah
domba (SBA) atau brain-heart infusion (BHI) dan inkubasi pada suhu 26°C selama 48
jam.
• Subkulturkan kembali isolat tersebut dalam media yang sama menggunakan biakan yang
diinkubasi selama 48 jam.
• Lakukan semua uji identifikasi menggunakan biakan semalaman dalam tryptic

agar kedelai.
3.2 Identifikasi • Lakukan pewarnaan Gram dan uji biokimia spesifik untuk identifikasi dasar.
Awal dari
Isolat
3.2.1 Pewarnaan Gram • Secara asketis, siapkan apusan yang seragam dari isolat bakteri dalam slide kaca bersih
menggunakan setetes air steril atau larutan garam.
• Biarkan mengering dengan sendirinya dan perbaiki dengan
panas. • Kemudian tambahkan beberapa tetes larutan kristal violet dan biarkan selama 1
menit dan cuci dengan air suling. • Genangi apusan dengan
yodium Gram selama satu menit.
• Kemudian cuci perlahan dengan air suling atau air ledeng sampai
warna ungu menghilang.
• Dekolorisasi menggunakan etil alkohol 95% sampai menjadi jernih dan imme
bilas dengan air secara teratur (5-10 detik).
• Setelah itu tambahkan safranin (counterstain) selama 45 detik dan bilas lagi dengan air
suling. Keringkan udara, keringkan, dan amati di bawah mikroskop optik.
3.2.2 Uji Biokimia [12] • Deteksi enzim katalase menggunakan hidrogen peroksida sebagai substrat
yang menghasilkan air dan oksigen.
• Lakukan pengujian ini menggunakan biakan yang ditumbuhkan dalam semalam di cawan
Tes katalase
TSA. • Edwardsiella spp. menunjukkan katalase positif menunjukkan gelembung untuk
mation dalam tabung atau slide kaca.
Uji Oksidase • Lakukan tes ini untuk mendeteksi adanya sitokrom oksidase
enzim pada sel bakteri.
• Pembentukan warna ungu memastikan oksidase positif dalam waktu 10 detik

pada reaksi dengan larutan encer 1% dari tetrametil fenilendiamina
dihidroklorida. • Edwardsiella spp.
menunjukkan negatif untuk uji oksidase.
Uji Ion Gula Tiga Kali • Uji ini menunjukkan kemampuan bakteri memfermentasi laktosa, sukrosa, dan
glukosa dengan menghasilkan produksi gas H2S .
• Edwardsiella spp. menunjukkan positif untuk tes ini.
Tes Produksi Indole • Tambahkan reagen Kovac ke dalam media SIM (sulfur, indole, dan motility). •
Inkubasi selama 24 jam dan amati adanya warna merah tua. • Edwardsiella
spp. menunjukkan positif untuk tes ini.
Tes Sitrat Simmons • Tumbuhkan isolat bakteri pada simmon sitrat miring dengan cara menusukkan
inokulum pada permukaan miring dan inkubasi pada suhu 37°C selama seminggu.
• Kemudian amati perubahan warna. Edwardsiella spp. menunjukkan hasil negatif

terhadap tes ini yang menunjukkan bahwa sitrat tidak dapat digunakan sebagai
satu-satunya sumber karbon.
Tes Lisin Dekarboksilase • Inokulasikan isolat bakteri dalam kaldu lisin dan inkubasi pada suhu 37°C
selama 4 hari.
• Amati setelah 96 jam inkubasi. Edwardsiella spp. menunjukkan posisi

tif untuk tes ini.
• Warna ungu menunjukkan kemampuan dekarboksilasi isolat

dan mempertahankan pH basa media.
3.2.3 Identifikasi Cepat • API20E adalah strip plastik berisi 21 tes biokimia yang membentuk sistem
Menggunakan Kit identifikasi untuk Enterobacteriaceae dan batang Gram-negatif non-rewel lainnya.
API20E Komersial
• Inokulasi isolat bakteri pada substrat mikrotubulus dan incu
bat untuk mengidentifikasinya.
• Berikan nilai numerik untuk perubahan warna pada reaksi substrat (yaitu,
perubahan warna), sesuai panduan pabrikan. • Secara total, tujuh digit angka
diperoleh untuk mengidentifikasi spesies [13].

3.2.4 Molekul • Isolasi DNA dari strain bakteri baik secara manual maupun menggunakan
Identifikasi Isolat metode kit.
Isolasi DNA dari

Edwardsiella sp.
Strain Patogen dari • Metode manual yang dimodifikasi menggunakan metode sel rebus
Ikan langsung yang dijelaskan oleh
Ram Savan [14]. • Kultur 1 mL isolat patogen dalam kaldu dan sentrifus
pada 5000 × g selama 3 menit pada suhu 25 °C untuk mendapatkan
pelet sel bakteri. • Rebus pelet pada 95 °C selama 5 menit dengan

melarutkannya kembali dalam 250 ÿL buffer TE (10 mmoL/L Tris–HCl,
1 m mol/L Ethylenedia mine tetraacetic acid
(EDTA), pH 8.0). • Sekali lagi, centrifuge pada kondisi yang sama, lalu kumpulkan superna
tant dan menggunakannya sebagai DNA cetakan.
Ekstraksi DNA Langsung • Membedah sebagian kecil limpa (20 mg) menggunakan pisau bedah steril
dari Limpa dan secara aseptis pindahkan ke tabung mikrosentrifus 1,5 mL.
• Ekstrak DNA menggunakan metode manual atau kit komersial. •
Gunakan DNeasy Blood and Tissue kit dari Qiagen dan ikuti protokol
produsen untuk bakteri Gram-negatif. • Kuantifikasi ekstrak
DNA menggunakan spektrofotometer NanoDrop.
Identifikasi Menggunakan • Siapkan campuran PCR dengan menambahkan 1 ÿL 16S rRNA/EvpP/etfD

Uji PCR Konvensional (maju; 10 ÿM), 1 ÿL EvpP/etfD (mundur; 10 ÿM) dan 20 ÿL air suling steril.
• Setel siklus PCR ke -95 °C selama 5 menit, kemudian 30 siklus 30 detik

pada 95 °C, 30 detik pada 55 °C, dan 10 detik pada 72 °C dan
perpanjangan akhir pada 72 °C selama 2 min.
• Tentukan produk yang diamplifikasi dengan gel agarosa 1% (b/v).

elektroforesis.
• Siapkan gel agarosa dalam buffer TAE (Tris–asetat–EDTA) 1×, 0,04 m M
Tris-HCL, 1 mM asam etilendiamintetraasetat, pH 8,0), dan 0,06 ÿg/mL
etidium bromida untuk visualisasi.
• Pita yang diamati pada rentang dari 400 hingga 445 pasangan
basa. • Untuk identifikasi tingkat spesies, murnikan produk PCR atau elusi
menggunakan Qiaquick PCR cleanup kit (Qiagen) mengikuti protokol
pabrikan dan sekuensing melalui Illumina Next gen
sequencer.
• Bandingkan urutan menggunakan program BLASTN dari National Center
for Biotechnology Information [15].
Identifikasi Menggunakan RPA adalah uji cepat, spesifik, dan sensitif yang digunakan untuk amplifikasi
Rekombinase Polimerase asam nukleat dengan rekombinase, protein pengikat rantai tunggal, dan
Uji Amplifikasi (RPA). polimerase DNA dalam kondisi isotermal.
• Gunakan 1 ng/ÿL konsentrasi cetakan DNA dan tambahkan ke dalam

campuran reaksi RPA.
• Campuran reaksi RPA terdiri dari primer RPA 0,42 ÿM, buffer rehidrasi 1×,
dan air bebas DNase (kit komersial: Kat. no. T00001, Jiangsu Qitian gene
Biotechnology Co., China).
Untuk campuran ini, tambahkan templat DNA.
• Biarkan reaksi tidak terganggu selama 15 menit pada suhu 39 °C dan
tentukan produk amplifikasi yang dikonfirmasi dengan metode elektroforesis
gel agarosa.
• Untuk identifikasi tingkat spesies, murnikan produk PCR atau elusi
menggunakan Qiaquick PCR cleanup kit (Qiagen) mengikuti protokol
pabrikan dan sekuens menggunakan Illumina Next gen sequencer.
• Jalankan urutannya menggunakan program BLASTN dari Nasional

Pusat Informasi Bioteknologi [11].
3.2.5 Identifikasi dari Seluruh profil protein sel memungkinkan seseorang untuk mendeteksi strain secara
Edwardsiella spp. Isolasi sangat spesifik menggunakan Immunoassay dan ELISA.
oleh ELISA
• Inokulasi biakan Edwardsiella spp. dalam tryptone soy broth (TSB) dan
inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C.
Ekstraksi Seluruh Sel
Protein (WCP)
• Perbaiki biakan bakteri menggunakan formalin 2% dan simpan pada suhu 4
°C selama 24 jam. Kemudian disentrifugasi pada 2800 rpm selama
45 menit pada suhu 4 °C. • Buang supernatan dan resuspensi pelet dalam
salin buffer fosfat (pH 7,2). Sekali lagi, centrifuge pada 5000 rpm selama
sekitar 15 menit.
• Setelah pelet, tanpa mengganggunya, simpan untuk sonikasi pada 45 Hz

selama 10 menit.
• Setelah sonikasi, centrifuge lagi pada 10.000 rpm selama 15 menit. •

Supernatan dikumpulkan dan disimpan pada -20 °C hingga analisis lebih
lanjut. Supernatan ini adalah antigen WCP.
Produksi Poliklonal • Suntikkan antigen WCP ke kaki belakang kelinci putih untuk menghasilkan
Antibodi pada Kelinci antibodi poliklonal. • Suntikkan 150
µg antigen WCP bersama dengan emulsi Freund's complete adjuvant (FCA),
secara intramuskuler. • Berikan dosis booster pada kelinci
pada hari ke 14 dan 28 imunisasi.
• Kumpulkan sampel darah dari kelinci pada hari ke-42 pasca imunisasi dan
biarkan menggumpal pada suhu kamar selama 2–3 jam. •
Sentrifuge sampel darah beku pada 5000 rpm selama 10 menit
mendapatkan serum darah dan menyimpannya pada -20 °C.
SDS–PAGE (Sodium • Campurkan antigen WCP dan buffer pemuatan gel 2× SDS dengan rasio 1:2 dan
Dodesil Sulfat– panaskan pada 100 °C selama 5 menit.
Gel poliakrilamida
• Lakukan elektroforesis sampel protein menggunakan separator 12%.
Elektroforesis) Analisis
gel dan gel susun 4%.
• Biarkan gel bekerja pada 120 V sampai pewarna biru bromofenol mencapai
dasar gel. • Warnai gel dengan
Coomassie brilliant blue R-250 diikuti dengan
destaining.
Blot Barat WCP Setelah SDS-PAGE, periksa reaktivitas antiserum kelinci terhadap antigen
Antigen WCP menggunakan Western blot immunoassay.
• Lakukan transfer elektro running gel ke nitroselulosa

membran (0,45 ÿm).
• Cuci membran menggunakan air suling, dan blokir dengan larutan susu
bubuk skim 5% dalam dapar fosfat (PBS) yang mengandung 0,05%
Tween 20 dan inkubasi dengan antibodi primer pada suhu 37 °C selama
1 jam.
• Sekali lagi, cuci menggunakan PBS, lalu inkubasi menggunakan antibodi

sekunder (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG) pada suhu 37 °C selama
1 jam.
• Terakhir cuci menggunakan air deionisasi, dan tentukan antibodi yang

terikat dengan mereaksikannya dengan substrat peroksidase membran
3,3ÿ,5,5ÿ-tetramethylbenzidine.
• Hentikan reaksi warna dengan membilas membran dengan deionisasi
air.
Dot-ELISA untuk Spesies • Lapisi strip kertas nitroselulosa dengan 3 ÿL antigen WCP Edwardsiella spp.
Identifikasi dan keringkan selama berjam-jam pada suhu kamar. • Kemudian
blokir strip dalam PBS yang mengandung 5% bubuk susu skim pada suhu
37 °C selama 30 menit.
• Inkubasi selama satu jam pada suhu 37 °C, dengan antibodi primer (1:400
pengenceran).
• Sekali lagi, cuci strip membran beberapa kali dan inkubasi dengan antibodi
sekunder dengan kondisi yang sama selama 30 menit. • Selanjutnya
inkubasi kertas nitroselulosa dengan reagen kompleks anti-sapi selama 30
menit.
• Terakhir, inkubasi dengan reagen 3-amino-9-etilkarbazol (AEC) selama

10 menit dalam gelap.
• Cuci strip membran nitroselulosa dengan air suling, keringkan di udara

pada suhu kamar, dan deteksi bercak [16].
Terima kasih
Pekerjaan ini didukung oleh Kementerian Ilmu Bumi (MoES)
MoES/36/OOIS/53/2016), Pemprov. India, dan Institut Sains dan Teknologi
Sathyabama.
Referensi
1. Griffin MJ, Quiniou SM, Cody T, Tabuchi M, Ware C et 9. Sakai T, Iida T, Osatomi KKK (2007) Deteksi gen
al (2013) Analisis komparatif isolat Edwardsiella dari fimbrial Tipe 1 pada strain Edwardsiella tarda patogen
ikan di Amerika Serikat bagian timur mengidentifikasi dan non-patogen ikan dengan PCR. Fish Pathol
dua taksa genetik yang berbeda di antara organisme 42:115–117 10. Lan J, Zhang XH,
yang secara fenotip diklasifikasikan sebagai E. tarda. Wang Y, Chen J, Han Y (2008) Isolasi galur Edwardsiella
Vet Microbiol 165:358–372 2. Ewing WH, McWhorter
tarda yang tidak biasa dari turbot dan buat teknik
AC, LA Escobar MR (1965) Edwardsiella: genus baru deteksi PCR dengan gen gyrB.
bakteri Entero berdasarkan spesies baru, E. tarda.
J Appl Microbiol 105:644–651 11.
Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon 15:33–38 3. Hawke
Jiang J, Fan Y, Zhang S, Wang Q, Zhang Y, Liu Q, Shao
JP (1979) Bakteri yang terkait dengan penyakit ikan lele S (2022) Deteksi cepat Edwardsiella piscicida di
yang dibudidayakan di tambak. J Fish Res Board tempat menggunakan amplifikasi recombi nase
Canada 36:1508–1512 4. Grimont PAD, polimerase dengan aliran lateral.
Grimont F, Richard CSR (1980) Edwardsiella hoshinae, Aquac Rep 22:100945
spesies baru Enterobacteriaceae. Curr Microbiol 12. Kebede BHT (2016) Isolasi dan identifikasi Edwardsiella
4:347– 351 tarda dari Danau Zeway dan Langano, Oromia Selatan,
Ethiopia. Ikan Aquac J 7:184
5. Abayneh T, Colquhoun DJSH (2013)
Edwardsiella piscicida sp. nov.a spesies baru patogen 13. Natalija TP, Rozelindra CR, Strunjak-Perovic I (2007)
ikan. J Appl Microbiol 114: 644–654 Uji fenotip komersial (API 20E) dalam diagnosis bakteri
ikan: review.
Veterina´rnÿ´medicÿńa 52:49–53
6. Shao S, Lai Q, Liu Q, Wu H, Xiao J dkk (2015)
Karakterisasi filogenomik dari galur Edwardsiella 14. Savan R, Igarashi A, Matsuoka S, Sakai M (2004)
ET080813T yang sangat mematikan mengkodekan Deteksi edwardsiellosis yang sensitif dan cepat pada
dua kelompok gen T3SS dan tiga T6SS yang berbeda: ikan dengan metode amplifikasi termal iso yang
usulkan spesies baru sebagai Edward siella dimediasi loop. Appl Environ Microbiol 70:621–624
anguillarum Sp. Sistem Aplikasi Mikrobiol 38: 36–47
15. Castro N, Toranzo AE, Nu'n˜ez S dkk (2010)
7. Katharios P, Kokkari C, Dourala NSM (2015) Evaluasi empat pasangan primer reaksi berantai
Laporan pertama edwardsiellosis pada ikan air tawar polimerase untuk deteksi Edwardsiella tarda di turbot.
bermoncong tajam yang dibudidayakan di kandang, Dis Aquat Org 90:55–61. https://doi.org/10.3354/
Diplodus puntazzo dari Mediterania: laporan kasus. dao02203 16. Das BK, Sahu I, Kumari S et
Dokter Hewan BMC Res 11:155
al (2014) Jenis feno dan profil protein sel utuh strain
8. Yi G, Kaiyu W, Defang C, Fanling FYH (2010) Edwardsiella tarda yang diisolasi dari ikan air tawar
Isolasi dan karakterisasi Edwardsiella ictaluri dari yang terinfeksi. Aplikasi Mikrobiol Int J Curr Sci 3:235–
budidaya lele kuning (Pelteoba grus fulvidraco). Isr J 247
Aquac 62:105–115
bagian 3
Metode Karakterisasi Flavobacterium pada Ikan

Yamini Gopi, Sakthinarenderan Sai, Mirunalini Ganesan, dan Ravi Mani
Abstrak
Penyakit insang bakteri, sindrom ikan trout pelangi, penyakit Columnaris, dan penyakit air dingin bakteri
disebabkan oleh bakteri yang bersifat patogen terhadap ikan. Mereka milik keluarga Flavobacteriaceae. Mereka
terlihat dengan pigmentasi kuning pada organisme air. Jenis bakteri ini diisolasi dan diidentifikasi menggunakan
teknik seperti pewarnaan Gram, motilitas, motilitas meluncur, uji biokimia, dan API 20E. Itu juga dapat
diidentifikasi menggunakan metode teknis dengan jumlah lempeng dan mikroskop. Karakterisasi molekuler
seperti ekstraksi DNA, reaksi berantai polimerase (PCR), dan analisis filogenetik juga dilakukan untuk mengidentifikasi spesie
Kata kunci Flavobacteriaceae, Pigmentasi kuning, Pewarnaan Gram, Motilitas, Motilitas meluncur, Uji
biokimia, API 20E, Mikroskop, Jumlah lempeng, Ekstraksi DNA, PCR, Filogeni
1. Perkenalan
Flavobacterium spp. menghuni lingkungan segar dan laut dapat

menghasilkan koloni berpigmen kuning pada kultur. Sangat penting
untuk mengetahui informasi klinis tentang sel bakteri untuk
membedakannya menjadi patogen atau saprofit. Oleh karena itu,
sel-sel yang menghasilkan pigmentasi kuning, biasanya panjang
dan tipis, melekat pada permukaan atau epitel spesies akuatik yang
termasuk dalam famili Flavobacteriaceae [1]. Genus Flavobacterium
terdiri dari lebih dari 100 spesies [2]. Sebagian besar Flavobacterium
spp. adalah Gram-negatif, panjang, batang meluncur ramping
dengan lebar 4–10 ÿm dan lebar 0,3–0,5 ÿm, sangat aerobik [3],
dan ukuran koloni bulat, cembung, rizoid, dan rata, yang tumbuh
pada suhu optimal 20 –30 C untuk sebagian besar spesies.
Diantaranya banyak yang merupakan agen patogen dan penyebab
berbagai penyakit pada ikan. Flavo bacterium psychrophilum
adalah agen penyebab sindrom rainbow trout fry dan penyakit air
dingin bakteri [4]. Jenis penyakit ini terjadi di air dingin pada suhu
16 C, dengan lesi terbuka di permukaan luar ikan. Flavobacterium branchiophilu
John Thomas dan Natarajan Amaresan (eds.), Mikrobiologi Akuakultur, Buku Pegangan Protokol Springer,
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_3,
19
20 Yamini Gopi dkk.
ium succinicans adalah patogen yang menyebabkan penyakit

insang bakteri pada ikan [5]. F. johnsoniae, F. hydatis, F. chilense,
F. araucananum, F. oncorhynchi, F. plurextorum, F. tructae, F.
piscis, F. collinsii, F. branchiarum, F. branchiicola, dan F.
spartansii adalah lainnya Flavo bakteri spp. berhubungan dengan
penyakit ikan. Penyakit Flavobakteri juga bersifat patogen bagi
amfibi dan manusia [6]. Isolasi dan Identifikasi Flavobacterium
spp. didasarkan pada karakterisasi morfologi, biokimia, dan molekuler.
2 Bahan
Flavobacterium • Usap steril.
spp. dari Ikan
• Shieh menengah.
• Tobramisin. •
Agar Cytophaga. •
Neomisin. •
Polimiksin B. •
Pelat petri. •
Inkubator.
2.2 Pewarnaan • Pewarnaan umum, uji motilitas, dan biokimia dilakukan sesuai
dan Uji Biokimia protokol standar API20 E Kit.
2.3 Molekul • Kaldu Shieh.

Identifikasi
• Tobramisin. •
Inkubator.
• Lyophilizer. •
Primer:
27F:50 -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-30 .
1387R:50 GGGCGGWGTGTACAAGGC-30 [4].
27L: 50 -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-30 .
1492R:50 -TACGYTACCTTGTTACGACTT-30 [7].
27F:50 - GAGTTTGATCMTGGCTCAG-30 .
518R:50 WTTACCGCGGCTGG-30 [7].
• Thermocycler.
• Gel dok.
Metode Karakterisasi Flavobacterium pada Ikan 21
3 Metode
3.1 Isolasi • Kumpulkan sampel bakteri bercak keabu-abuan/kekuningan dari kepala,
Flavobacterium spp. insang, limpa, hati, dan ginjal ikan yang mengalami erosi kulit,
dari Ikan menggunakan swab steril.
• Streak segera pada media Shieh yang dilengkapi dengan tobra misin [8]
dan Cytophaga agar (CA) yang dilengkapi dengan neo misin dan
polimiksin B untuk menumbuhkan hanya bakteri terpilih dengan kebutuhan
nutrisi rendah [9]. • Media
berikut dapat digunakan untuk isolasi Flavobacteria:
1. Media shieh (pepton, 5 g; ragi, 0,5 g; natrium, 0,01 g; BaCl2(H2O)2,

0,1 g; K2HPO4, 0,1 g; KH2PO4, 0,05 g; MgSO4.7H2O, 0,3 g;
FeSO4.7H2O, 0,001 g; NaHCO3, 0,05 g; tobramycin, 0,5 ÿg; agar
(Dico), 10 g; air suling, 1000 mL) • Tambahkan semua bahan kimia
(kecuali tobramycin)
ke suling
air dan sesuaikan pH menjadi 7,2. •
Autoklaf selama 15 menit pada 121 C.
• Dinginkan dan tambahkan larutan tobramycin yang disaring
membran. •
Campur dan tuangkan ke cawan Petri dan simpan pada suhu 4 C.
2. Cytophaga agar (cryptone, 5 g; ragi, 5 g; sodium, 2 g; ekstrak daging
sapi, 2 g; agar, 9 g/mL; neomycin, 5 ÿg/mL; polymy cin, 10 U/mL;
air suling , 1000 mL) • Tambahkan semua
reagen dan atur pH menjadi 7,2–7,4. • Autoklaf pada 121 C
selama 15 menit.
• Dinginkan media dan tuang ke cawan Petri dan simpan di

4 C.
• Inkubasi cawan pada suhu 25 C selama 48 dan 72 jam. Periksa

pigmentasi kuning pada pelat yang diinokulasi dan lakukan
pewarnaan Gram untuk identifikasi primer.
4 Identifikasi
4.1 Perhitungan Teknis • Inokulasi sampel bakteri dalam 1000 ÿL air steril dan
membuat seri pengenceran hingga 103 .
4.1.1 Jumlah
Hitung Bakteri • Sebarkan merata di piring dan inkubasi pada suhu 25 C pada suhu kamar.
22 Yamini Gopi dkk.
• Hitung koloni bakteri dengan menggunakan spidol. •

Lakukan perhitungan dengan pengenceran CFU/mL ¼ N piring
pengenceran [10].
4.1.2 Mikroskopi • Isolasi area yang terkena dan ambil bagian setebal 4 ÿm dan warnai
dengan hematoksilin dan eosin (H&E) dan Giemsa, lalu lihat di bawah
mikroskop cahaya [11].
4.2 Pewarnaan Gram • Lakukan pewarnaan Gram untuk membedakan spesies bakteri. •
Buat apusan pada slide dari koloni bakteri. • Keringkan di udara
dan tambahkan kristal violet ke apusan dan simpan di ruangan
suhu selama 5 menit.
• Bilas kaca objek dengan air keran yang mengalir untuk menghilangkan kelebihan kristal
ungu.
• Tambahkan pewarna yodium Gram dan simpan pada suhu kamar selama
2 menit dan cuci dengan air
ledeng. • Untuk menghilangkan pewarnaan kristal violet yang berlebihan,
tambahkan dekolorizer pada apusan selama 30 detik dan cuci
dengan air ledeng. • Terakhir tambahkan safranin ke apusan selama 1
menit dan cuci dengan air kran dan amati di bawah mikroskop
(pembesaran, 100 ). • Bakteri Gram-positif mempertahankan warna kristal
violet karena lapisan peptidoglikan yang tebal, dan bakteri Gram-negatif
akan berwarna pink atau merah karena lapisan peptidoglikan yang tipis [12].
4.3 Uji Motilitas • Lakukan uji motilitas menggunakan slide dudukan

basah. • Menumbuhkan biakan bakteri dalam kaldu nutrisi.
1. Kaldu nutrisi (agar nutrisi, 14 g; air suling, 1000 mL) • Tambahkan agar
nutrisi ke dalam air suling dan pertahankan pH 6,8.
• Autoklaf pada 121 C selama 15 menit.

• Dinginkan dan simpan dalam suhu 4 C.
• Setelah 24 jam pertumbuhan biakan bakteri dalam kaldu nutrisi,

ambil 15-20 µL biakan bakteri pada slide. • Tutup
biakan dengan kaca penutup. • Lihat di
bawah mikroskop fase kontras (pembesaran,
40 ) [1].
4.4 Uji Motilitas Meluncur • Lakukan uji motilitas meluncur dengan metode hanging drop slide. • Ambil
setetes biakan bakteri 48 jam dari kaldu nutrisi dan tempatkan di kaca penutup
yang bersih.
• Tutupi kaca penutup dengan slide depresi yang bersih, sehingga
kecekungan lensa ditempatkan ke bawah.
• Putar slide depresi dan letakkan di bawah mikroskop (pembesaran, 40 ) [1].
4.5 Uji Biokimia 1. Tes katalase (slide kaca, hidrogen peroksida 30%)
• Ambil kaca objek yang bersih dan olesi biakan bakteri
di atasnya.
• Tambahkan 30% hidrogen peroksida ke dalam sel bakteri. •

Indikasi gelembung menghasilkan reaksi positif [1].
2. Tes pigmentasi flexirubin (kaca slide, 20% KOH)
• Ambil kaca objek yang bersih dan olesi biakan bakteri
di atasnya.
• Tambahkan 20% KOH di atasnya dan segera amati warnanya. • Hasil

positif berwarna ungu kemerahan atau coklat
warna [1].
3. Uji oksidase (tetramethyl-p-phenylenediamine 1%, kertas saring, botol

pelindung cahaya, air suling) • Siapkan 1%
tetramethyl-p-phenylenediamine dalam air suling dan tutupi dengan botol
pelindung cahaya dan simpan dalam suhu 4 C.
• Ambil kertas saring dan olesi biakan bakteri di atasnya dan tambahkan
reagen oksidase (tetramethyl-p-phenylenedia mine) ke dalam biakan
bakteri. • Amati warna dalam waktu
10 detik.
• Hasil positif menunjukkan warna ungu [13]

4. Penyerapan Congo red (100 mg Congo red, 100 mL distilasi
air) •
Timbang 100 mg Congo red dan tambahkan ke dalam 100 mL suling
air.
• Aduk rata dan simpan dalam suhu ruangan. •

Tambahkan beberapa tetes larutan Congo red ke koloni biakan bakteri yang
tumbuh di agar cytophaga (CA).
• Setelah 2 menit bilas dengan air.
• Amati warnanya.
• Hasil positif menunjukkan warna merah.

24 Yamini Gopi dkk.
5. DNase (19,5 g agar uji DNase, 1000 mL air suling) • Cawan petri.
• 1% HCl.
• Tambahkan 19,5 g agar uji DNase ke dalam 1000 mL air suling. • Autoklaf
selama 15 menit pada suhu 121 C.
• Aduk rata dan tuangkan ke cawan Petri. • Oleskan

biakan bakteri pada cawan dan inkubasi selama 72 jam pada suhu 24 C.
• Untuk mengendapkan DNA, plat dibanjiri dengan HCl 1%. • Amati reaksinya.
• Hasil positif menunjukkan zona bening di sekitar bakteri

beruntun [1].
6. Uji gelatinase (1 g pepton, 0,25 g ekstrak ragi, 3,75 g timah gela, 1 g NaCl
(0,4%), 3,75 g agar, 250 mL air suling) • Tambahkan seluruh reagen ke
dalam air suling dan autoklaf selama 15 menit pada 121 C .
• Tuangkan ke cawan Petri dan simpan pada suhu 4

C. • Inokulasikan biakan bakteri pada cawan gelatin. • Inkubasi
selama 48 jam.
• Hasil positif menunjukkan zona cerah atau berawan di sekitar

pertumbuhan bakteri [1].
4.6 API 20E • Strip plastik memiliki 20 tabung mikro yang berisi media diferensial terdehidrasi.
Komersial
Kit Identifikasi • Isi dirots dengan air.
• Ambil biakan bakteri dari koloni dan buat menjadi 5 mL dengan air steril dan
homogenkan biakan. • Dengan menggunakan pipet
transfer steril, isi setiap tabung mikro. • Tutup ketiga sumur (CIT,
VP, dan GEL) dengan lebih banyak bakteri
suspensi, sampai bagian atas sumur.
• Isi kelima sumur (ADH, LDC, ODC, H2S, dan URE) dengan mineral oil untuk
mencegah masuknya oksigen.
• Tutup dan inkubasi selama 18 sampai 24 jam pada suhu 37 C.
• Amati warnanya.
• Tambahkan 1 tetes reagen TDA ke sumur TDA dan amati warnanya. •

Tambahkan 1 tetes reagen Kovac ke sumur IND dan amati
warna.
• Tambahkan 1 tetes masing-masing reagen VP 1 dan VP 2 ke sumur VP dan tunggu

selama 10 menit dan amati warnanya.
• Catat hasilnya di kertas grafik dan hitung tujuh

digit nomor profil.
• Lihat database yang sesuai untuk mengidentifikasi spesies [9].
5 Identifikasi Molekul
5.1 Ekstraksi DNA • Inokulasi biakan bakteri dalam kaldu Shieh dengan tobramycin
dan inkubasi selama 48 hingga 72 jam pada suhu 25 C.
• Ambil 1,5 mL biakan bakteri dan sentrifus selama 2 menit (ulangi proses
tersebut sampai terbentuk pelet). • Buang
supernatan. • Cuci sel dengan
buffer TE 567 ÿL (10 mM Tris–HCl, pH 8, EDTA 1 mm).
• Tambahkan 30 ÿL 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) dan 3 ÿL 20 mg/mL

proteinase K.
• Inkubasi pada suhu 37 C selama 1 jam.
• Setelah inkubasi tambahkan 100 ÿL 5 M NaCl (campur rata) dan

tambahkan 80 ÿL heksadesil trimetil amonium bromida (reagen CTAB).
• Vortex untuk mencampur dan menginkubasi selama 10 menit pada 65 C.
• Tambahkan volume yang sama dari kloroform/isoamil alkohol (24:1) v/v

dan vortex perlahan selama
20 detik. • Centrifuge selama 5 menit pada
10.000 rpm. • Pindahkan cairan kental supernatan ke tabung sentrifus
mikro baru dan tambahkan volume yang sama dari fenol/kloroform/
isoamil alkohol (25:24:2) v/v dan sentrifugasi selama 5 menit pada
10.000 rpm. •
Pindahkan supernatan ke tabung baru dan tambahkan 400 ÿL isopropanol
dingin dan sentrifugasi selama 5 menit pada 6500 rpm. • Gunakan
etanol 70% untuk pencucian akhir dan keringkan selama 5 menit pada suhu
kamar.
• Buang supernatan dan keringkan pelet dengan menggunakan lyophilizer
dan simpan atau larutkan kembali dalam 100 ÿL buffer TE dan simpan di
20 C [14].
5.2 Reaksi • Siapkan campuran PCR untuk 20 ÿL yang mengandung: 110 ng DNA, 0,5
Rantai Polimerase (PCR) ÿL 10 mM dNTPs, 0,6 ÿL 1,25 mM MgCl2, 2 ÿL larutan buffer 10, 1 ÿL
setiap primer (10 pmol/ÿL), 5 U Taq polimerase, dan air Milli-Q. •
Lakukan amplifikasi dengan ketentuan sebagai berikut: denaturasi awal
pada suhu 94 C selama 2 menit diikuti dengan denaturasi pada
26 Yamini Gopi dkk.
94 C selama 30 detik, primary annealing pada 56 C selama 30 detik, extension

pada 72 C selama 1 menit, dan final extension pada 72 C selama 5 menit [15].
• Siapkan gel agarosa 1,5% untuk menganalisis amplikon PCR dari 16 s rRNA dan
tambahkan 5 ÿg/mL etidium bromida (EtBr) sebagai pewarna pewarna selama 1
jam dan divisualisasikan di bawah UV transiluminator.
• Kira-kira panjang pita akan menjadi 1500 bp.
5.3 Produk • Ambil microfuge dan tambahkan 25 ÿL etanol 95% dan 1 ÿL natrium asetat 3 M dan
Pemurnian Sebelumnya sesuaikan pH menjadi 4,6. • Tambahkan seluruh
Pengurutan produk PCR dan letakkan di atas es selama 10–20 menit. • Sentrifuge pada 13.000
rpm selama 30 menit pada suhu kamar dan buang supernatannya.
• Ke dalam tabung, tambahkan 125 ÿL etanol 70% dan sentrifugasi

5 menit pada 13.000 rpm.
• Buang supernatan dan keringkan pelet. • Kirim produk
kering ke fasilitas pengurutan [10].
5.4 Pengurutan • Metode pengurutan sanger menghasilkan urutan pembacaan.
5.5 Analisis • Gunakan perangkat lunak MEGA versi 4.0 untuk menganalisis hubungan filogenetik.
Filogenetik • Ekspor urutan
nukleotida bakteri dan sejajarkan

LEDAKAN.
• Kemudian ambil urutan yang disejajarkan menggunakan penggabungan lingkungan

di perangkat lunak MEGA.
• Identifikasi filogeni spesies menggunakan jarak-p [4].
Terima kasih
Pekerjaan ini didukung oleh hibah Kementerian Ilmu Bumi (MoES) (MoES/36/OOIS/
53/2016), Pemerintah. India, dan Institut Sains dan Teknologi Sathyabama.
Referensi
1. De Aquicultura C (2008) Isolasi dan 64(1):13–25. https://doi.org/10.1556/004.

karakterisasi Flavobacterium columnare 2016.002
(Bernardet et al. 2002) dari empat spesies 3. Declercq AM, Haesebrouck F, Van Den
ikan tropis di Brazil. Braz J Biol 68(2):409– Broeck W, Bossier P, Decostere A (2013)
414 2. Tim P. (2016) Isolasi dan karakterisasi Penyakit columnaris pada ikan: ulasan dengan
flavobakteri dari spesies ikan air tawar liar penekanan pada interaksi inang-bakteri. Vet
dan budidaya di hungaria. Acta Dokter Hewan Hung Res 44:1–17
4. Starliper CE (2011) Penyakit ikan air dingin 10. Buller NB (2014) Bakteri dan jamur dari ikan
yang disebabkan oleh bakteri Flavobacterium dan hewan air lainnya: manual identifikasi
psychro philum. J Adv Res 2(2):97–108. praktis. CABI, Wallingford, Oxfordshire 11.
https://doi. org/10.1016/ Tien NT,
j.jare.2010.04.001 5. Good C, Davidson J, Wiens Dung TT, Tuan NA, Crumlish M (2012) Identifikasi
GD, Welch TJ, Summerfelt S (2015) pertama infeksi Flavobacterium columnare
Komunikasi Singkat Flavobacterium pada budidaya ikan lele air tawar
branchiophilum and F. succinicans berasosiasi Pangasianodon hypophthalmus.
dengan penyakit insang bakteri pada rainbow Dis Aquat Organ 100:83–88. https://doi. org/
trout Oncorhynchus mykiss ( Walbaum) dalam 10.3354/dao02478
sistem akuakultur resirkulasi air. J Fish Dis 12. Becerra SC, Roy DC, Sanchez CJ, Christy
2011:409–413. https:// RJ, Burmeister DM (2016) Teknik pewarnaan
doi.org/10.1111/jfd.12249 6. Loch TP, Faisal M yang dioptimalkan untuk mendeteksi bakteri
(2019) Infeksi flavobac terial yang muncul Gram positif dan Gram negatif di dalam jaringan.
pada ikan: ulasan. J Adv Res 6(3): 283–300. BMC Res Notes 9(1):1–10. https://doi.org/
https://doi.org/10.1016/j.jare. 2014.10.009 10.1186/s13104-016-1902-0
7. Sung JY et al (2018) Utilitas kultur konvensional 13. Al-Dhabaan FA (2019) Identifikasi morfologi,
dan MALDI-TOF MS untuk identifikasi biokimia dan molekuler bakteri biodegradasi
komunitas mikroba dalam cairan lavage petro leum hidrokarbon yang diisolasi dari
veolar bronkoal dibandingkan dengan sistem tanah tercemar minyak di Dhahran, Arab
sekuensing GS junior next generation. Ann Saudi. Saudi J Biol Sci 26(6): 1247–1252.
Lab Med 38(2):110–118 https://doi.org/10.1016/j.sjbs. 2018.05.029
8. Decostere A, Haesebrouck F, Devriese LA
(1997) Media Shieh yang dilengkapi dengan 14. Andreou LV (2013) Persiapan DNA genomik
tobramycin untuk isolasi selektif Flavobac dari bakteri. Metode Enzymol 529: 143–151.
terium columnare (Flexibacter columnaris) https://doi.org/10.1016/B978-0-
dari ikan yang sakit. Mikrobiol J Clin 35(1): 12-418687-3.00011-2
322–324. https://doi.org/10.1128/jcm.35. 15. Sebastião FA, Pilarski F, Lemos MVF (2010)
1.322-324.1997 Isolasi dan karakterisasi molekuler strain
9. Altun S, Diler O¨ , Ekici S (2008) Isolasi dari Flavobacterium columnare dari ikan di Brazil.
Flavobacterium columnare dari budidaya Adv J Microbiol Res 2 (Agustus):22–29
ikan trout hujan (Oncorhynchus mykiss) di Turki.
Turki J Fish Aquat Sci 169:165–169
Bab 4
Isolasi dan Identifikasi Spesies Citrobacter

Abstrak
Isolasi dan identifikasi bakteri patogen merupakan bagian penting dari manajemen kesehatan perairan.
Mengidentifikasi bakteri patogen yang tepat pada tingkat spesies adalah kunci untuk menyiapkan tindakan
pencegahan dan pengelolaan penyakit. Efek patogen Citrobacter sp. termasuk nekrosis ekor, perdarahan,
kemerahan pada tubuh, dan lesi di usus. Mereka adalah patogen fakultatif yang menginfeksi ikan liar dan
budidaya, kura-kura, mamalia air, dan manusia. Ini merupakan ancaman penting bagi industri akuakultur, yang
menyebabkan kematian massal ikan budidaya, sehingga mengakibatkan kerugian ekonomi. Bab ini membahas
berbagai protokol untuk isolasi dan identifikasi mereka.
Kata kunci Citrobacter, API 20E, Uji PCR, Patogen fakultatif, C. freundii, C. braakii
1. Perkenalan
Genus Citrobacter termasuk dalam famili Enterobacteriaceae dan

terdiri dari kurang lebih 13 spesies [1]. Citrobacter adalah bakteri
gram negatif, anaerobik yang menyebabkan kerusakan parah pada
usus dan hepatopankreas pada ikan budidaya, sehingga menyebabkan
kematian massal. Mereka adalah patogen oportunistik di berbagai
ikan, kura-kura, dan manusia [2]. C. freundii dan C. braakii merupakan
agen infeksius yang paling banyak diantara spesies lain dari genus
Citrobacter, yang menyebabkan kerugian ekonomi yang besar bagi
industri akuakultur [3]. Sato dkk. adalah orang pertama yang
mengisolasi dan menggambarkan patogenisitas C. freundii pada ikan
sakit (Mola mola) [4]. Identifikasi strain patogen yang menginfeksi ikan
penting untuk pengendalian dan pencegahan kerugian ekonomi besar
dalam akuakultur. Bab ini membahas protokol untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi berbagai teknik identifikasi yang digunakan untuk
spesies Citrobacter dari ikan yang terinfeksi.
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_4,
29
2 Bahan

Citrobacter dari • Jarum.
Ikan Terinfeksi • Kit pembedahan.
Inkubator.

2.3 Identifikasi • Bahan kimia halus reaksi PCR sesuai protokol standar. • PCR primer
Molekul untuk 16S rRNA, Forward primer: UFF2: 5- 0 -GTTGATCATGGCTCAG-30 dan
Reverse primer: URF2: 50 -GGTTCACTTGTTACGACTT-30 .
3 Metode
3.1 Pengambilan Sampel Ikan • Kumpulkan ikan dengan tanda klinis lesu dan anoreksia, perdarahan dan
hiperemia di mulut, warna kulit gelap, dan eksoftalmia bilateral.
• Sterilkan peralatan, seperti jarum, dengan menyemprotnya dengan alkohol

70% dan kemudian memaparkannya langsung ke api. • Sterilkan
cawan Petri dengan autoklaf selama 10–15 menit pada suhu 121 C dan tekanan
1 atm. • Bedah hati, limpa, dan
ginjal dari ikan setelah dibersihkan
kulit mereka dengan etil alkohol 75% [5].
3.2 Isolasi • Homogenkan organ yang dibedah dengan 2 mL PBS dan sentrifus pada 500
Citrobacter rpm selama 5 menit. • Buang
supernatan dan cuci pelet tiga kali
dengan PBS.
• Terakhir, suspensikan pelet dengan 1 mL PBS steril.

Isolasi dan Identifikasi Spesies Citrobacter 31
3.3 Identifikasi dari • Batang Gram-negatif lurus, muncul sendiri-sendiri dan berpasangan. •
Bakteri Citrobacter Biasanya, motil menggunakan flagela peritrichous. •
Koloni biakan murni tidak tembus cahaya, berdiameter 2–4 mm, halus, dan
agak cembung serta berwarna keabu-abuan dengan permukaan cerah
pada pelat TSA.
• Pada cawan agar darah, koloni bakteri yang diisolasi berwarna merah muda
ungu dan berdiameter sekitar 4 mm.
• Koloni agar XLD berwarna kuning dengan canter kuning intensif dan zona
presipitasi kuning di sekitarnya.
• Selain itu, bakteri bersifat motil, fermentatif O/F, sitokrom oksidase negatif,
dan katalase positif. • Berdasarkan ciri fenotipik, bakteri
tersebut diidentifikasi
sebagai Enterobacteriaceae.
• Kit tes cepat API 20E (bioMe´rieux) dan VITEK II (bioMe´r ieux, Prancis)
selanjutnya mengidentifikasi bakteri tersebut sebagai Citrobacter braa kii
dengan probabilitas masing-masing 99,9% dan 90% [ 3, 6].
3.4 • API20E adalah kit identifikasi komersial cepat yang membentuk sistem
Identifikasi Cepat identifikasi untuk Enterobacteriaceae dan batang Gram-negatif non-rewel
lainnya.
Menggunakan Kit API20E Komersial
• Ini adalah satu set 21 tes biokimia yang terdiri dari dehidrasi
mikrotubulus substrat.
• Setelah inokulasi suspensi bakteri dalam mikrotubulus, perubahan warna

dari reaksi substrat dicatat dan nilai numerik diberikan kepada bakteri,
sesuai panduan pabrik. • Kemudian dengan menggunakan angka tujuh
digit, spesies tersebut diidentifikasi [7].
4 Identifikasi Molekuler Citrobacter sp.
4.1 Isolasi DNA Gunakan metode perlakuan panas dan kit komersial untuk mengisolasi DNA
bakteri. Ini adalah metode yang sederhana, hemat biaya, dan efisien untuk
ekstraksi DNA bakteri.
1. Gunakan biakan bakteri patogen semalaman untuk ekstraksi

DNA genom.
2. Inokulasi biakan dalam tabung reaksi yang berisi 1 mL air suling steril dan
simpan dalam penangas air mendidih selama 10 menit.
3. Sentrifuge pada 1000 rpm selama 5 menit. Kumpulkan supernatan tanpa
pelet yang mengganggu.
4. Analisis PCR dilakukan untuk supernatan yang terkumpul.
5. Periksa konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer atau
nanodrop.
4.2 16S rRNA • Isolasi DNA dari pelat bakteri atau langsung dari organ ikan yang terinfeksi. •
Pengurutan Siapkan campuran
PCR untuk 50 ÿL yang terdiri dari 100 ng DNA genomik, 1 U Taq DNA
polimerase, 5 ÿL buffer 10 PCR, 1 ÿL 50 mM MgCl2, 1 ÿL 10 mM dNTPs,
dan 1 ÿL 10 pmol masing-masing primer. • Atur siklus PCR sebagai berikut:
denaturasi awal selama 2
menit pada suhu 95 C, denaturasi selama 30 detik pada suhu 95 C (35 siklus),
annealing pada suhu 52C selama 45 detik, dan ekstensi selama 1,30 menit
pada suhu 72 C, dan ekstensi akhir pada suhu 72 C selama 7 menit.
• Visualisasikan produk PCR menggunakan gel agarosa (1,8%) dan pewarnaan

etidium bromida.
• Sequencing produk PCR selanjutnya dilakukan dengan menggunakan Illumina

sequencer atau ABI 3730xl capillary sequencer dan dianalisis menggunakan
NCBI -BLAST untuk konfirmasi spesies [8].
5 Karakterisasi Biokimia (Tabel 1)
Tabel
1 Karakterisasi biokimia Citrobacter sp.
Karakteristik C. braakii C. freundii C. gillenii C. werkmanii
Karakteristik fisiologis
Pewarnaan gram
Membentuk tongkat tongkat tongkat tongkat
Motilitas + + + +
Karakteristik biokimia
Katalase + + + +
oksidase + + + +
Glukosa (Hugh dan Leifson) + + +
Sitrat (Simmon) + + Nd
H2S + +
pertumbuhan KCN + + +
metil merah +
Voges–Proskauer + + + Nd
(lanjutan)
Tabel
1 (lanjutan)

Nitrat reduktase Nd Nd Nd Nd
Gelatinase + + + +
Urease Nd
lisin dekarboksilase + + + Nd
dekarboksilase ornitin + + Nd
Fenilalanin deaminase +
ONPG Nd Nd Nd Nd
Indole + + Nd Nd
Esculin Nd
Glukonat + + Nd
tartrat + Nd
Glukosa (gas) + +
Asam dari
Adonitol + +/ Nd
Sorbitol + Nd
manitol + Nd
Dulcitol + + + Nd
Arabitol Nd Nd Nd Nd
Glukosa
Laktosa +
Sukrosa Nd
Selobiosa + Nd
Melibiosa + + Nd
Raffinose Nd
Xilosa Nd
Kerentanan antibiotik [6]
Ampisilin R R R R
Cephalothin R R S Nd
Gentamisin R R R S
Penisilin R R R R
(lanjutan)
Tabel
1 (lanjutan)
Tetrasiklin S S S S
Neomisin S S S M
Karbenisilin R R S Nd
Oksasilin S S S R
Kloramfenikol S S S S
Nitrofurantoin S S S S
Cefuroxime S S S Nd
Cefotaxime S S S Nd
Ciprofloxacin R R R S
Klindamisin R R R R
Eritromisin R R R M
Streptomisin R R R Nd
Imipenem S S S S
kanamisin R R R S
Piperasilin S S S R
Polimiksin B R R R S
Rifampisin R R R S
Trimetoprim-sulfametoksazol S S S Nd
+ menunjukkan hasil positif, menunjukkan hasil negatif, +/ tidak dapat ditentukan, Nd tidak ditentukan, R resisten terhadap
antibiotik, S rentan terhadap antibiotik, resistensi medium M, NA tidak tersedia
Terima kasih
Pekerjaan ini didukung oleh hibah Kementerian Ilmu Bumi
(MoES) (MoES/36/OOIS/53/2016), Pemerintah. India, dan
Institut Sains dan Teknologi Sathyabama.
Referensi
1. Anderson MT, Mitchell LA, Zhao L, Mobley HLT infeksi freundii pada ikan pari budidaya air tawar,
(2018) kebugaran Citrobacter freundii selama Potamotrygon motoro. Akuakultur 492:35–39 3.
infeksi aliran darah. Sci Rep 8:11792 2. Altun S, Duman M, Buyukekiz A, Ozyigit M, Karatas¸
Sun HY, Cao XH, Jiang YF, Ni LY, Mo ZQ, Qin Qw, Steinum S, Turgay E (2013) Isolasi Citrobacter
Li YW, Dan XM (2018) Wabah penyakit baru braakii dari rainbow trout (Oncor hynchus
yang terkait dengan Citrobacter mykiss). Isr J Aquac 65:915–922.
4. Sato N, Yamane N, Kawamura T (1982) Infeksi (2015) Aktivitas antimikroba Invivo dan Invitro
sistemik Citrobacter freundii pada ikan mola mola Azadirachta indica (Lin) terhadap Citrobacter
matahari di akuarium Matsushima. Bull Jpn Soc freundii yang diisolasi dari Tilapia (Oreochromis
Sci Fish 48:1551–1557 5. Altun mossambicus) yang terinfeksi secara alami.
S, Duman M, Buyukekiz AG dkk (2013) Akuakultur 437: 252–255. 631471
Isolasi Citrobacter braakii dari ikan rainbow trout 7. Topik Popovic N, Coz-Rakovac R, Strunjak
(Oncorhynchus mykiss). Jurusan Penyakit Hewan Perovic I (2007) Tes fenotip komersial (API 20E)
Perairan, Fakultas Kedokteran Hewan, Jurusan dalam diagnosis bakteri ikan: review.
Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Uludag Veterinárnÿ´medicÿńa 52:49–
Jurusan Penyakit Ikan, Fakultas F 53 8. Dashti AA, Jadaon MM, Abdulsamad AM,
Dashti H (2009) Perlakuan panas bakteri: metode
6. Thanigaivel S, Vijayakumar S, Gopinath S, sederhana ekstraksi DNA untuk teknik molekuler.
Mukherjee A, Chandrasekaran N, Thomas J Kuwait Med J 2:117–122
Bab 5
Isolasi dan Identifikasi Anemia Salmon Menular
Virus dari Udang
Haimanti Mondal, John Thomas, Natrajan Chandrasekaran,
and Amitava Mukherjee
Abstrak
Virus anemia salmon menular (ISAV) adalah virus RNA tersegmentasi, milik keluarga Orthomyxovir idae. Virion ini
menyebabkan anemia salmon yang menular (ISA) pada salmon Atlantik, Salmo salar. Ini adalah penyakit virus menular
yang ditularkan melalui air yang disebabkan oleh Salmon isavirus. Mereka sebagian besar mempengaruhi budidaya ikan di
Chili, Kanada, Skotlandia, dan Norwegia, menyebabkan kerugian besar dalam budidaya ikan salmon. Virus tersebut telah
dilaporkan bertahan hidup di air laut yang merupakan risiko utama bagi industri pertanian akuakultur. Penularan virus ini
sebagian besar menyebar melalui kontak dengan ikan yang terinfeksi atau kotorannya, atau dengan orang yang
menanganinya. Tidak ada vaksin atau pengobatan yang efektif saat ini untuk ISAV.
Kata kunci ISAV, ISA, Isavirus, Tersegmentasi, Salmonid, Akuakultur
1. Perkenalan
ISAV adalah virus ssRNA yang diselimuti yang dilaporkan terkait

erat dengan virus influenza [1]. Anemia salmon menular adalah
agen etiologi ISAV. Mereka ditempatkan di dalam kingdom
Orthornavirae, filum Negarnaviricota, kelas Insthoviricetes, ordo
Articulavirales, famili Orthomyxoviridae, dan genus Isavirus. Genom
terdiri dari segmen-segmen RNA beruntai tunggal (ssRNA) delapan-
ve sense, yang mengkode sekitar sepuluh protein [2].
Aamelfot dkk. [3] melaporkan sebuah studi tentang infeksi
mukosa ISAV pada salmon Atlantik. Mereka menunjukkan replikasi
awal di berbagai permukaan mukosa termasuk insang, sirip dada,
saluran GI, dan kulit, yang merupakan titik masuk virus. Strategi
pengobatan dan pencegahan hanya efektif sebagian. Demikian pula,
Gervais et al. [1] melakukan studi tentang respons inang terhadap
ISAV menggunakan sekuensing RNA sel tunggal dalam garis sel salmon Atlantik
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_5,
37
38 Haimanti Mondal dkk.
Mereka mengungkapkan potensi interaksi host-virus pada tingkat sel

yang dapat dieksplorasi untuk meningkatkan resistensi salmon
Atlantik terhadap ISAV.
2 Bahan
• Lini sel udang. •

Sampel jaringan—hepatopankreas, insang, hati, dan jantung. •
Media kultur sel udang (SCCM) (22 asam amino, 6 vita min, 4 gula,
kolesterol, serum janin sapi (FBS), 3 antibiotik, fenol merah,
dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, pH 6,8–7,2). •
Gentamisin (50 ÿg/mL). • tabung
Eppendorf.
• tabung PCR.
• reagen TRIzol.
• Kloroform.
• Isopropanol. •
70% etil alkohol.
• air DEPC.
• Pasangan primer (maju dan mundur).
• kit sintesis cDNA. •
Heksamer acak (Promega). •
Homogenizer. •
Spektrofotometer NanoDrop. •
Transiluminator UV.
• Sentrifugasi.
• Mikroskop.
3 Metode
3.1 Pembedahan • Membedah organ seperti hati, hepatopankreas, insang, dan jantung
Berbagai Organ udang menggunakan pisau bedah.
dari Udang yang
Terinfeksi Virus
Infectious Salmon Anemia [4]
Isolasi dan Identifikasi Infeksi Virus Anemia Salmon dari Udang 39
3.2 Isolasi dari • Homogenkan masing-masing sampel dengan menggunakan

Salmon yang Menular
lumpang dan alu. • Sentrifuge homogenat pada 2–5 C pada 2000–4000 rpm selama
Virus Anemia dari 15 menit.
Garis Sel
• Kumpulkan supernatan dan obati dengan antibiotik gentamisin (50 ÿg/mL)
3.2.1 Persiapan selama 4 jam pada suhu 15 C atau semalaman pada suhu 4–8C.
Sampel
3.2.2 Inokulasi pada • Ambil sel udang untuk isolasi primer. • Tumbuhkan
Garis sel
dalam media SCCM yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (FBS) dan 2%
(v/v) L-glutamin (200 mM) dalam konsentrasi standar.
• Inkubasi pada suhu 20 C.
• Inokulasikan 100 ÿL/sumur homogenat jaringan yang diencerkan 1:50 dari

lapisan sel sel udang monolayer di piring sumur.
3.3 Reverse • Keluarkan sepotong hepatopankreas dan jantung dari udang menggunakan
Transcriptase pisau bedah steril dan homogenkan dengan 200 ÿL buffer NTE.
Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) [5] • Sentrifuge sampel pada 12.000 rpm selama 10 menit. •
3.3.1 Ekstraksi RNA Tambahkan 250 ÿL homogenat jaringan dengan 600 ÿL reagen TRIzol. • Inkubasi
selama 5 menit dalam tabung Eppendorf 1,5 mL. • Tambahkan
200 ÿL kloroform dan vortex dengan benar. • Simpan dalam
es selama 15 menit atau pada suhu 20 C selama 5 menit. •
Centrifuge pada 12.000 rpm, pada 4 C selama 20 menit. •
Kumpulkan fase berair dengan hati-hati tanpa menyentuh
interfase. •
Tambahkan 400 ÿL isopropanol dingin ke dalam fase berair. • Centrifuge
pada 12.000 rpm, pada 4 C selama 15 menit. • Buang
supernatan dan cuci pelet dengan 200 ÿL
etanol 70% dingin.
• Centrifuge pada 12.000 rpm, pada 4 C selama 10 menit. •

Buang supernatan. • Tangguhkan
pelet dengan 40 ÿL air yang diberi perlakuan DEPC dan simpan
pada 20 C.
• Ukur kemurnian dan konsentrasi RNA yang diekstraksi menggunakan

spektrofotometer NanoDrop.
3.3.2 Sintesis cDNA • Ambil 4 ÿL RNA dari 25 ÿL volume total. • Tambahkan 2 ÿL

primer oligodt.
• Buat volume total menjadi 20 ÿL dengan air kelas biologi molekuler.
• Denaturasi pada suhu 25 C selama 5 menit dan annealing pada suhu 42 C selama
60 menit, dilanjutkan dengan ekstensi pada suhu 70 C selama 5 menit (satu siklus).
3.3.3 Pengujian RT-PCR [6] • Rancang primer PCR, forward primer (FP) (50 -CTACACAG CAGGATGCAGATGT
-30 ) dan reverse primer (RP) (5- 0 -CAGGATGCCGGAAGTCGAT-30 ) untuk
ISAV. • Lakukan amplifikasi dengan 40 siklus—denaturasi
pada 94 C selama 30 detik, anil pada 61 C selama 45 detik, ekstensi pada 72 C selama
90 detik, dan ekstensi akhir pada 72 C selama 10 menit.
• Jalankan elektroforesis pada gel agarosa 2%. •

Visualisasikan di bawah transiluminator UV pada 304 nm.
Referensi
1. Gervais O, Barria A, Papadopoulou A, Gratacap 4. Olesen NJ, Cuenca A, Iburg TM, Vendramin N
RL, Hillestad B, Tinch AE, Martin SAM, Robledo (2019) Metode diagnostik untuk pengawasan
D, Houston RD (2021) Menjelajahi resistensi dan konfirmasi infeksi dengan Infectious Salmon
genetik terhadap virus anemia salmon menular Anemia Virus (ISAV) yang dihapus HPR.
pada salmon Atlantik dengan asosiasi genome- Laboratorium Referensi Uni Eropa untuk Penyakit
wide dan RNA pengurutan. Genomik BMC 22: Ikan dan Crustacea. Institut Nasional
345 Sumber Daya Perairan, Universitas Teknik
2. Cárdenas M, Michelson S, Pe'rez DR, Montoya Denmark
M, Toledo J, Vásquez-Martÿńez Y, Martin MC-S 5. Kibenge FSB, Gárate ON, Johnson G, Arriagada
(2022) Infektivitas virus anemia salmon menular R, Kibenge MJT, Wadowska D (2001) Isolasi dan
ditentukan oleh banyak segmen dengan identifikasi virus anemia salmon menular (ISAV)
kontribusi penting dari seg ment 5. Virus 14:631 dari salmon Coho di Chili. Dis Aquat Org 45:9–18
3. Aamelfot M, McBeath A, Christiansen DH, 6. Cunningham CO, Snow M (2000) Analisis genetik
Matejusova I, Falk K (2015) Infectious salmon dari Infectious Salmon Anemia Virus (ISAV) dari
anemia virus (ISAV) infeksi mukosa pada Skotlandia. Dis Aquat Org 41(1):1–8
salmon Atlantik. Dokter Hewan Res 46:120
Bab 6
Isolasi dan Identifikasi Betanodavirus dari Udang

Amitava Mukherjee, dan Natarajan Amaresan
Abstrak
Nervous necrosis virus (NNV) atau Betanodavirus adalah virus RNA beruntai tunggal (ssRNA) positif.
Itu milik keluarga Nodaviridae. Ini adalah patogen air yang telah dilaporkan berbahaya. Mereka
bertanggung jawab menyebabkan wabah penyakit di berbagai jenis remaja air tawar dan laut serta
larva udang di seluruh dunia. Virion ini mematikan mempengaruhi sekitar 120 spesies ikan juga di
seluruh dunia. Mereka dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti suhu, beban biologis atau UV. Mereka
didistribusikan secara luas dalam kisaran suhu yang bervariasi di lingkungan perairan.
Kata kunci Betanodavirus, Nodaviridae, Berbahaya, Wabah, Beban biologis
1. Perkenalan
Betanodavirus adalah virus ssRNA positif yang tidak berselubung

dengan kapsid ikosahedral yang berdiameter antara 25 hingga 34
nm. Itu milik keluarga Nodaviridae. Sejak dekade terakhir, budidaya
ikan sangat terpengaruh oleh virus ini [1]. Penyakit ini menyebabkan
kematian 100%. Ini terutama mempengaruhi tahap remaja dan larva
ikan air tawar dan laut. Infeksi Betanodavirus pertama kali dilaporkan
di Australia pada barramundi, Lates calcarifer [1].
Baru-baru ini, [2] melakukan penelitian terhadap sampel benur
ikan kerapu gentian mutiara yang diimpor dari Thailand. Analisis PCR
menunjukkan bahwa infeksi memberikan hasil positif untuk NNV.
Demikian pula, [3] melaporkan studi perbandingan pada viabilitas
virus NNV di air laut salinitas tinggi dan rendah pada temperatur
yang berbeda dalam medium kultur. Mereka mengungkapkan bahwa
strain NNV setelah terpapar oksigen dan UV di akuarium
mempercepat partikel infektif yang tidak aktif. Mereka menunjukkan
bahwa dengan peningkatan suhu inkubasi, terjadi penurunan kelangsungan hidup
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_6,
41
2 Bahan
• Sampel jaringan—hepatopankreas, insang, hati, dan usus. • Lini sel udang.

• Media kultur sel
udang (SCCM) (22 asam amino, 6 vita min, 4 gula, kolesterol, Fetal Bovine
Serum (FBS), 3 anti biotik, fenol merah, dinatrium hidrogen fosfat, kalium
dihidrogen fosfat, pH 6,8–7,2).
• Filter membran (ukuran 0,22 ÿm). •

tabung Eppendorf. •
Tabung PCR.
• Homogenizer. •
Natrium klorida (NaCl). • Kloroform.
70% etil alkohol. • reagen
TRIzol.
• air DEPC.
• Pasangan primer (maju dan mundur). • Kit

mini mudah RNA (Qiagen). • kit
sintesis cDNA. • Heksamer
acak (Promega). • Spektrofotometer
NanoDrop. • Transiluminator UV.
• Pendingin centrifuge.
3 Metode
3.1 Pembedahan • Membedah berbagai organ seperti hati, hepatopankreas, insang, dan
Berbagai Organ dari usus udang menggunakan pisau bedah steril.
Udang
3.2 Isolasi • Homogenkan sampel menggunakan homogenizer dalam 5 mL SCCM

Betanodavirus media tanpa FBS.
Menggunakan • Sentrifuge jaringan yang telah dihomogenisasi pada 10.000 rpm pada suhu 4 C selama
Garis Sel Udang [4–6] 20 menit.
• Saring suspensi melalui filter membran ukuran 0,22 ÿm. • Tumbuhkan sel
udang dalam media SCCM yang dilengkapi dengan
5% FB.
Isolasi dan Identifikasi Betanodavirus dari Udang 43
• Inokulasi monolayer garis sel udang dengan 500 ÿL filtrat yang terkumpul
dan inkubasi pada suhu 27 C selama 1 jam.
• Lakukan ekstraksi RNA dan RT-qPCR.
3.2.1 Ekstraksi RNA • Homogenkan 20 mg hepatopankreas dan insang dengan NTE

penyangga.
• Centrifuge pada 10.000 rpm selama 5 menit.

• Kumpulkan 150 ÿL supernatan dan tambahkan 600 ÿL TRIzol
reagen dan inkubasi selama 5
menit. • Tambahkan 200 ÿL kloroform dan
vorteks. • Simpan dalam es selama 15 menit atau pada
suhu 20 C selama 5 menit. • Centrifuge pada 12.000
rpm, pada 4 C selama 20 menit. • Kumpulkan fase berair dengan hati-hati tanpa menyen
interfase. •
Tambahkan 400 ÿL isopropanol dingin ke dalam fase berair. •
Centrifuge pada 12.000 rpm, pada 4 C selama 15 menit.
• Buang supernatan dan cuci pelet dengan 200 ÿL
etanol 70% dingin.
• Centrifuge pada 12.000 rpm, pada 4 C selama 10

menit. • Buang supernatan. •
Tangguhkan pelet dengan 25 ÿL air yang diberi perlakuan DEPC dan simpan
pada 20 C.

3.2.2 Sintesis cDNA • Ambil 4 ÿL RNA dari 25 ÿL volume total. • Tambahkan 2

ÿL primer oligodt. • Buat volume
total menjadi 20 ÿL dengan air kelas biologi molekuler.
• Denaturasi pada suhu 25 C selama 5 menit dan annealing pada suhu 42 C selama 60
menit, dilanjutkan dengan ekstensi pada suhu 70 C selama 5 menit.
3.3 RT-PCR [2, 7] • Merancang set primer untuk amplifikasi genomik RNA. • Gunakan
primer maju, F (50 -CTT-CCT-GCC-TGA-TCC-AAC TG-30 ), dan primer
balik, R (50 -GTT-CTG-CTT-TCC-CAC CAT-TTG-30 ).
• Lakukan reaksi dalam volume total 25 ÿL—masing-masing primer (200

nM), template RNA (500 ng), dan 1 ÿL SuperScript III RT/Platinum Taq
Mix (Invitrogen).
• Lakukan amplifikasi untuk reverse transcription—pra-denaturasi pada

50 C selama 30 menit dan denaturasi pada 94 C selama 2 menit,
amplifikasi dengan 30 siklus—denaturasi pada 94 C selama 30 detik,
annealing pada 60 C selama 30 detik, ekstensi pada 72 C selama 3
menit/1,5 menit, dan ekstensi akhir pada 72 C
selama 5 menit. • Jalankan amplikon RT-PCR pada elektroforesis gel
agarosa. • Visualisasikan di bawah transiluminator UV.
Referensi
1. Shetty M, Maiti B, Santhosh KS, Venugopal 4. Yamashita Y, Fujita Y, Kawakami H, Nakai T

MN, Karunasagar I (2012) Betanodavirus ikan (2005) Kemanjuran vaksin virus yang tidak
laut dan air tawar: distribusi, organisasi aktif terhadap nekrosis saraf virus (VNN). Fish
genomik, diagnosis dan tindakan pengendalian. Pathol 40:15–21
Indian J Virol 23(2):114–123 2. 5. Hick P, Tweedie A, Whittington R (2010)
Jungi SV, Sangsuriya P, Taengphu S, Phiwsaiya Persiapan jaringan ikan untuk deteksi optimal
K, Sonthi M, Nuangsaeng B, Salin KR, Senapin betanodavirus. Akuakultur 310:20–26
S, Dong HT (2022) Deteksi virus nekrosis saraf 6. Chen X, Qi J, He L, Luo H, Lin J, Qiu F, Wang
genotipe RGNNV di kerapu gentian mutiara Q, Zheng L (2022) Isolasi dan identifikasi
(Epinephelus lanceolatus ÿ E. fuscoguttatus ÿ) strain baru virus nekrosis saraf dari perut kuda
benih yang diimpor ke Thailand. Akuakultur laut Hippocampus abdo minalis. Virol J 19:109
561:738659 3. Vázquez-Salgado 7. Nishi S, Yamashita
L, Olveira JG, Bandÿń H, Kawato Y, Nakai T (2016)
I (2022) Modulasi viabilitas virus nekrosis Isolasi kultur sel Piscine Nodavirus
saraf oleh salinitas air dan suhu. J Fish Dis (Betanodavirus) dalam air laut pemeliharaan
45(4):561–568 ikan. Mikrobiol Lingkungan Appl 82(8):2537–2544
Bab 7
Isolasi dan Identifikasi Hemorrhagic Septicemia

Virus dari Udang
Amitava Mukherjee, dan Natarajan Amaresan
Abstrak
Viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) adalah virus RNA beruntai tunggal (ssRNA) berselubung -ve sense.
Mereka milik keluarga rhabdovirus yang bertanggung jawab atas kematian ikan yang sangat besar di seluruh
dunia. Ini menyebabkan septikemia hemoragik virus (VHS), penyakit ikan patogen yang mematikan, menyerang
lebih dari 50 spesies ikan laut dan air tawar di seluruh dunia. Kematian VHSV bervariasi berdasarkan berbagai
faktor fisiologis dan lingkungan seperti stres, suhu, air, kondisi pemeliharaan, spesies ikan, umur ikan, strain
virus, dan sebagainya. Penularan infeksi ini terutama terjadi secara horizontal melalui air yang terkontaminasi
dengan mengeluarkan virus langsung dari ikan yang terinfeksi.
Kata Kunci Rhabdovirus, VHSV, VHS, Pemeliharaan, Penularan, Patogen
1. Perkenalan
VHSV adalah rhabdovirus berbentuk peluru atau batang yang

terdiri dari 11-12 kb genom RNA, yang mengkode enam protein
dalam urutan 3ÿ-Asn-Pro-Met-Gly-Val-Leu-5ÿ [1] . Itu milik ordo
Mono negavirales dan ditempatkan di keluarga Rhabdoviridae,
dan genus Novirhabdovirus [2]. Mereka memasuki sel inang
melalui endositosis atau fusi. Ini mengikat fibronektin, glikoprotein
melalui reseptor integ rin dalam matriks ekstraseluler. Awalnya
diisolasi pada tahun 1962 di Denmark dari trout pelangi, Oncorhynchus mykiss
Cieslak dkk. [3] melakukan penelitian berdasarkan filogeni
VHSV di akuakultur Eropa. Mereka melaporkan bahwa kehidupan
ikan akuakultur paling berharga di Eropa, trout pelangi,
Oncorhynchus mykiss, terancam oleh VHSV. Demikian pula,
penelitian lain dilakukan oleh Baillon et al. [1] pada penanda VHSV
pada trout pelangi, Oncorhynchus mykiss. Mereka menunjukkan ini
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_7,
45
penanda sangat penting dalam memprediksi fenotipe in vivo dari beberapa

isolat virus dan juga dalam meningkatkan metode profilaksis seperti
mengembangkan vaksin aman yang dilemahkan hidup.
2 Bahan
• Hemolimf, sampel jaringan—hepatopankreas, insang, dan

jantung.
• tabung Eppendorf. •
Tabung PCR.
• Media kultur sel udang (SCCM) (22 asam amino, 6 vita min, 4 gula,
kolesterol, serum janin sapi (FBS), 3 antibiotik, fenol merah, dinatrium
hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, pH 6,8–7,2).
• Lini sel udang. •

Gentamisin (1 mg/mL). •
Natrium klorida (NaCl). •
Isopropanol. •
Kloroform.
• 70% etil alkohol. •

reagen TRIzol.
• air DEPC.
• Pasangan primer (maju dan mundur). •

Kit mini mudah RNA (Qiagen). • kit
sintesis cDNA. •
Heksamer acak (Promega). •
Homogenizer. •
Spektrofotometer NanoDrop. •
Transiluminator UV.
• Sentrifugasi.
3 Metode
3.1 Pembedahan • Bedah organ seperti hepatopankreas, insang, dan jantung udang
Organ dari menggunakan pisau bedah steril.
Hemoragik
Virus Septikemia [4]
Isolasi dan Identifikasi Hemorrhagic Septicemia Virus dari Udang 47
3.2 Isolasi dari • Homogenkan sampel jaringan secara menyeluruh menggunakan homogenizer.
Hemoragik • Centrifuge
Virus Septicemia Menggunakan pada 2–5 °C pada 2000–4000 rpm selama 15 menit. • Kumpulkan
Saluran seluler
supernatan dan obati dengan gentamisin (1 mg/mL)
selama 4 jam pada suhu 15 °C atau semalaman pada suhu 4 °C.
3.3 Inokulasi dari • Inokulasikan supernatan ke dalam satu lapisan udang yang menyatu
Monolayer Sel [5–7] saluran seluler.
• Kultur dalam medium kultur sel udang (SCCM) dengan air laut isosmotik yang
mengandung salinitas 27% ditambah dengan streptomy cin (100 mg/L),
penisilin (100 IU/mL), kloramfenikol (0,06 mg/mL), dan N-feniltiourea (0,2 mM).
• Atur osmolaritas menjadi 720 ± 10 mOsm/kg. • Inkubasi

lapisan tunggal yang telah diinokulasi pada suhu 25 °C selama 7 hari.
4 Identifikasi Virus Hemorrhagic Septicemia
4.1 Waktu Nyata • Homogenkan 20 mg hepatopankreas dan insang dengan NTE

Rantai Polimerase penyangga.
Reaksi (RT-PCR) • Centrifuge pada 10.000 rpm selama 5 menit. •

Deteksi
Kumpulkan 150 ÿL supernatan dan tambahkan 600 ÿL reagen TRIzol dan
4.1.1 Ekstraksi RNA inkubasi selama 5 menit. • Tambahkan
200 ÿL kloroform dan vorteks. • Simpan dalam es
selama 15 menit atau -20 °C selama 5 menit. • Centrifuge pada
12.000 rpm, pada 4 °C selama 20 menit. • Kumpulkan fase
berair dengan hati-hati tanpa menyentuh
interfase. •
Tambahkan 400 ÿL isopropanol dingin ke dalam fase berair. • Centrifuge
pada 12.000 rpm, pada 4 °C selama 15 menit. • Buang
supernatan dan cuci pelet dengan 200 ÿL
etanol 70% dingin.
• Centrifuge pada 12.000 rpm, pada 4 °C selama 10 menit.

• Buang supernatan. • Tangguhkan
pelet dengan 25 ÿL air yang diberi perlakuan DEPC dan simpan
pada -20 °C.

4.1.2 Sintesis cDNA [8] • Ambil 4 ÿL RNA dari 25 ÿL volume total. • Tambahkan 2 ÿL
primer oligodt. • Buat volume total
menjadi 20 ÿL dengan tingkat biologi molekuler

air.
• Denaturasi pada suhu 25 °C selama 5 menit dan annealing pada suhu 42 °C selama
60 menit, dilanjutkan dengan ekstensi pada suhu 70 °C selama 5 menit (satu siklus).
4.1.3 RT-PCR [9, 10] • Rancang pasangan primer, forward primer (FP) (5ÿ-AAA-CTC GCA-GGA-TGT-
GTG-CGT-CC-3ÿ) dan reverse primer (RP) (5ÿ-TCT-GCG-ATC-TCA -GTC-AGG-
ATG-AA-3ÿ) t melakukan RT-PCR. • Lakukan reaksi dalam volume total 25 ÿL—Hai
masing-masing primer
(200 nM), template RNA (500 ng), dan 1 ÿL SuperScript III RT/Platinum Taq Mix
(Invitrogen).
• Lakukan amplifikasi dengan 40 siklus—denaturasi pada 94 °C selama 30 detik,

annealing pada 60 °C selama 30 detik, dan ekstensi pada 72 °C selama 45 detik
diikuti tahap ekstensi akhir 72 °C selama 10 menit. • Jalankan amplikon RT-
PCR pada elektroforesis gel agarosa. • Visualisasikan di bawah transiluminator

UV.
Referensi
1. Baillon L, Me'rour E, Cabon J, Louboutin L, 6. Ahmadivand S, Soltani M, Mardani K, Shokrpoor

Vigouroux E, Alencar ALF, Cuenca A, Blanchard Rahmati-Holasoo S,H, Mokhtari A, Hasanzadeh R
Y, Olesen NJ, Panzarin V, Morin T, Bre'mont M, (2016) Isolasi dan identifikasi virus hemorrhagic
Biacchesi S (2020) Hae viral penanda virulensi septic mia virus (VHSV) dari budidaya ikan trout
morrhagic Septicemia virus (VHSV) pada ikan pelangi (Oncorhynchus mykiss) di Iran. Acta
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Mikrobiol Trop 156: 30–36
Depan 11:574231 2. Dietzgen RG,
Kondo H, Goodin MM, Kurath G, Vasilakis N (2017) 7. Zhang W, Li Z, Xiang Y, Jia P, Liu W, Yi M, Jia K
Keluarga Rhab doviridae: virus RNA indera (2019) Isolasi dan identifikasi virus haemorrhagic
negatif mono dan bipartit dengan beragam septicemia virus (VHSV) isolat dari bass
organisasi genom dan asal evolusi umum. Virus largemouth liar Micropterus sal moides di Cina.
Res 227:158–170 J Fish Dis 00:1–10 8. Duesund H,
Nylund S, Watanabe K, Ottem KF, Nylund A (2010)
3. Cieslak M, Mikkelsen SS, Skall HF, Baud M, Karakterisasi virus VHS genotipe III yang diisolasi
Diserens N, Engelsma MY, Haenen OLM, dari ikan trout pelangi (Oncorhynchus mykiss) di
Mousakhani S, Panzarin V, Wahli T, Olesen NJ, situs laut di pantai barat dari Norwegia. J Virol
Schu¨tze H (2016) Filogeni virus hemoragik 7:19 9. Williams K, Blake S, Sweeney
septikemia virus di akuakultur Eropa. PLoS One A, Singer JT, Nicholson BL (1999) Multiplex reverse
11(10):e0164475 4. OIE (2019) Manual tes trans scriptase PCR assay untuk deteksi
diagnostik untuk hewan air. Dalam: Viral simultan dari tiga virus ikan. Mikrobiol J Clin
haemorrhagic septi caemia. Organisasi Dunia 37(12): 4139–4141
untuk Kesehatan Hewan (OIE), Paris 5. Jayesh
P, Jose S, 10. OIE (2013) Manual tes diagnostik untuk hewan
Philip R, Singh ISB (2013) Media novel untuk air, edisi ke-6. Organisasi Dunia untuk Kesehatan
pengembangan sistem kultur sel in vitro dari Hewan (OIE), Paris. http://www. oie.int/
Penaeus monodon. internationalstandard-setting/aquatic manual/
Sitoteknologi 65:307–322 access-online/
Bab 8
Isolasi dan Identifikasi Patogen dari Ikan : Tilapia

Virus Danau (TiLV)
SR Saranya, Vernita Priya, AT Manishkumar, and R. Sudhakaran
Abstrak
Budidaya nila sangat menguntungkan dan industri di India berkembang pesat. Cina adalah produsen tilapia
terbesar di dunia. Tilapines adalah ikan yang tahan penyakit dibandingkan dengan ikan lain, terutama jika
menyangkut banyak infeksi yang menargetkan ikan yang dibudidayakan secara intensif. Mereka masih dapat
terinfeksi parasit dan bakteri protozoa. Etiologi infeksius dan toksik harus dipertimbangkan dalam investigasi
wabah penyakit yang signifikan pada ikan. Protokol ini memberikan rincian virus danau tilapia, virus baru yang
muncul yang menyebabkan kematian pada spesies tilapia. Virus tilapine menjadi epidemi yang menyebar melalui
berbagai jalur di banyak negara. Oleh karena itu, perlu mengumpulkan pengetahuan tentang virus mematikan
ini untuk mencegah dan mengobati penyakit serta meminimalkan kerugian ekonomi negara.
Kata Kunci Tilapia, Budidaya, Virus, Dunia, Kematian
1. Perkenalan
Sejarah budidaya ikan dimulai 3000 tahun yang lalu bersamaan dengan
perkembangan virologi ikan. Budidaya ikan dimulai di Cina dengan ikan
cyprinid, dan banyak ikan dibudidayakan untuk makanan dan perdagangan
hias, termasuk ikan nila dari makam Mesir.
Infeksi virus pada ikan dimulai sejak tahun 1563, dengan viremia musim
semi ikan mas dan cacar ikan mas. Spesies Tilapia pertama kali
diidentifikasi di Afrika dan Timur Tengah. Beberapa dekade yang lalu, nila
menjadi spesies penting untuk pertumbuhan akuakultur, dengan panen di
seluruh dunia mencapai delapan juta metrik ton. Tilapia sekarang
merupakan spesies aqua terbesar kedua yang dibudidayakan setelah ikan
mas. Ini adalah peternak abadi yang mampu mentolerir kualitas air dan
polusi. Meskipun ada berbagai varietas nila yang dibudidayakan, spesies
yang paling dapat dibudidayakan adalah nila nila, nila Mozambik, dan nila
biru. Ikan nila menjadi terkenal sebagai “ayam air” oleh Badan
Pengembangan Perikanan Nasional pada tahun 2015 [1].
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_8,
49
50 SR Saranya dkk.
Ikan nila rentan terhadap berbagai penyakit, yang dapat dianggap

sebagai kerugian ekonomi yang besar bagi negara. Penyakit terjadi
setelah infeksi oleh berbagai patogen seperti virus, bakteri, jamur,
dan protozoa. Infeksi virus yang umum pada ikan nila termasuk
Betanodavirus, Iridovirus, dan virus mirip herpes. Baru-baru ini,
munculnya patogen virus baru yang disebut tilapia lake virus (TiLV)
menyebabkan kematian yang parah pada ikan budidaya dalam waktu
10 hari setelah infeksi [2].
Tilapia tilapinevirus (TiLV) merupakan penyakit lintas batas
spesies Tilapia yang pertama kali ditemukan di Israel diikuti oleh
negara lain yaitu, Bangladesh, Chinese Taipei, Kolombia, Mesir,
Ekuador, India, india, Malaysia, Meksiko, Peru, Filipina, Thailand ,
dll., dan juga muncul ke negara lain.
1.1 Virus Tilapia tilapinevirus (TiLV) adalah virus RNA single-stranded sense
Danau Tilapia negatif dari famili Amnoonviridae, genus Tilapinevirus, dan spesies
Tila pia tilapinevirus. Ukuran virus sekitar 60-100 nm. TiLV memiliki
sepuluh segmen dengan panjang total 10.323 kb dan tertutup dalam
nukleokapsid yang terikat membran [3]. Semua segmen berisi open
reading frame (ORF), tetapi segmen 1 memiliki urutan homologi yang
lemah dengan subunit PB1 virus influenza C (Bacharach et al. 2016).
Tidak ada segmen lain dari TiLV yang ditemukan homolog dengan
virus lain yang diketahui [4]; namun, sekuens komplementer yang
dikonservasi ditemukan konsisten dengan organisasi genom
orthomyxovirus [3].
Masa hidup virus di dalam inang berlangsung selama 7-10 hari.
Kisaran inang untuk virus ini terbatas pada spesies nila (Sarthoredon
dan Oreochromis spp. dan hibrida). Kohabitasi ikan yang terinfeksi
dengan spesies lain seperti karper dan belanak tidak rentan terhadap
virus ini. Namun, penelitian terbaru mengungkapkan bahwa virus
dapat ditularkan ke gurami raksasa melalui kohabitasi [5]. Partikel
virus TiLV sensitif terhadap pelarut organik seperti eter dan kloroform
[4]. Ikan nila yang terinfeksi TiLV ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1 Infeksi TiLV pada ikan nila [6]

Isolasi dan Identifikasi Patogen dari Ikan: Tilapia Lake Virus (TiLV) 51
2 Bahan
2.1 Pemeliharaan Ikan • Ikan.

dan Reinfeksi • Tangki ikan.
• Unit aerasi.
• Ikan nila. •
Serbuk sekam padi.
• Buffer NTE (50 mM Tris–HCl (pH 7,4); 100 mM NaCl; 0,1 mM
EDTA). • Jarum
suntik. •
Mortir dan alu. •
tabung Eppendorf.
2.2 Ekstraksi RNA • TRIzol atau RNA isoplus.

• Kloroform.
Etanol.
• tabung Eppendorf.
• Pendingin centrifuge.
• air bebas RNAse.
• NanoDrop.
2.3 cDNA dan RT • kit konversi cDNA.

PCR • Thermocycler.
• Taq polimerase.
• Air steril.
• dNTP.
• Primer.
• Agarosa.
• Tangki elektroforesis.
• Buffer TBE (basa Tris 90 mM; asam borat 90 mM; 2 mM
EDTA).
2.4 Diagnosis TiLV • Primer.

• sampel ikan TiLV. •
Thermocycler. •
Taq DNA Master Mix. •
Gel elektroforesis.
52 SR Saranya dkk.
• Sistem dokumentasi gel. •

Thermocycler waktu-nyata. •
SYBR Green DNA Master Mix.
• Probe ISH—berlabel DIG.
2.5 Pemeriksaan • formalin 10%.

Morfologi TiLV • Hematoksilin dan eosin. •
Mikroskop majemuk. • 2%
glutaraldehid.
• 1% osmium tetroksida
• Uranil asetat dan timbal sitrat. •

Mikroskop elektron transmisi.
3 Metode
3.1 Isolasi dari 1. Kumpulkan ikan tilapia dari danau yang terinfeksi di mana kematian massal
Tilapia tilapinevirus disaksikan atau dari tambak ikan untuk reinfeksi melalui injeksi intraperitoneal.
(TiLV)
2. Bedah ikan yang terinfeksi (n ¼ 5) segera dan sajikan dalam TRIzol pada
suhu 4 C untuk ekstraksi RNA.
3. Untuk reinfeksi, pertahankan ikan dalam kondisi laboratorium selama minimal

5 hari dan berikan pakan dua kali sehari untuk ikan.
4. Siapkan volume homogenat TiLV positif yang diperlukan dari ikan yang
terinfeksi dan disuntikkan ke ikan nila yang sehat secara intraperitoneal [7].
5. Pantau ikan yang disuntik setiap hari untuk perkembangan klinis

gejala setidaknya untuk jangka waktu 5-6 hari.
6. Setelah gejala berkembang, kumpulkan jaringan dari ikan mori bund stage
dan simpan dalam TRIzol.
3.2 Pembuatan 1. Siapkan homogenat dengan menghancurkan jaringan ikan dalam lesung
Homogenat TiLV dan alu dengan 1:10 (b/v) buffer NTE konsentrat dengan 10 mM HEPES
(pH 7,4–8,0).
2. Sentrifuge homogenat jaringan pada 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu
4 C dan saring supernatan melalui filter 0,22 ÿm.
3. Bekukan-cairkan sup homogenat bening tiga kali untuk mendapatkan bakteri
perincian.
4. Saring sup akhir untuk TiLV positif dengan RT-PCR dan gunakan untuk
infeksi ulang pada ikan nila yang sehat.
5. Simpan homogenat pada suhu 20 C untuk penggunaan selanjutnya.
3.3 Ekstraksi RNA 1. Membedah organ ikan yang terinfeksi TiLV seperti insang, otak, hati,
dan RT-PCR usus, otot, dan ginjal.
2. Timbang 50–100 mg jaringan ikan yang terinfeksi untuk RNA total
ekstraksi.
3. Ikuti petunjuk kit untuk ekstraksi RNA.
4. Ukur kemurnian dan konsentrasi RNA menggunakan

NanoDrop.
5. Gunakan RNA yang diisolasi untuk mensintesis cDNA menggunakan cDNA con
metode kit versi (transkripsi terbalik).
6. Lakukan PCR dengan cDNA hasil sintesis sebagai cetakan, primer
khusus untuk virus TiLV, dan Taq DNA polimerase.
7. Simpan cocktail di dalam thermal cycler dengan ketentuan sebagai
berikut: 95 C selama 30 detik, 56 C selama 30 detik, dan 72 C selama
30 detik dan elongasi akhir pada 72 C selama 10 menit.
8. Ulangi kondisi di atas selama 30–32 siklus.
9. Setelah proses PCR selesai, analisis sampel dengan elektroforesis gel
agarosa.
10. Visualisasikan hasil di bawah sistem dokumentasi Gel seperti yang
ditunjukkan dalam representasi diagram pada Gambar. 2.
3.4 Diagnosis TiLV Ikan nila yang terinfeksi TiLV diidentifikasi dengan berbagai metode diagnosis seperti
reverse transcriptase PCR, nested PCR dan semi-nested PCR, kuantitatif
real-time PCR [7, 8], metode RT-LAMP, dan hibridisasi in situ.
3.4.1 PCR Bersarang 1. Untuk melakukan nested PCR, rancang dua set primer untuk reaksi PCR
berturut-turut.
2. Rancang pasangan primer pertama untuk anil urutan di atas

pasangan primer kedua.
Gambar 2 Mekanisme reverse transcriptase PCR dan elektroforesis gel

54 SR Saranya dkk.
3. Menggunakan campuran reaksi hasil PCR pertama sebagai

template untuk reaksi PCR kedua yang meningkatkan sensitivitas
dan spesifisitas amplifikasi TiLV [9].
3.4.2 PCR semi-sarang 1. Untuk melakukan semi-nested PCR, dua reaksi PCR berturut-turut
dibutuhkan.
2. Lanjutkan dengan reaksi awal dengan primer eksternal dari wilayah
tertentu (dalam gen) TiLV untuk menghasilkan amplikon primer.
3. Lanjutkan dengan reaksi berturut-turut dengan primer maju atau

mundur awal yang digunakan dalam reaksi pertama dengan
primer internal lawan dalam wilayah yang sama.
4. Gunakan metode ini untuk sampel ikan TiLV segar dan diawetkan
[10].
5. Metode ini memberikan hasil yang lebih spesifik untuk deteksi
sampel TiLV positif [11].
6. Representasi diagram dari nested dan semi-nested PCR
ditunjukkan pada Gambar 3 [8].
3.4.3 Kuantitatif Nyata 1. PCR real-time dianggap sangat menguntungkan daripada metode
Waktu PCR untuk TiLV PCR lainnya karena spesifisitas dan sensitivitasnya [12].
Diagnosa 2. Gunakan metode ini untuk deteksi dan kuantifikasi DNA secara
simultan dengan mengukur reporter fluoresen.
PCR bersarang tradisional PCR asimetris seminested
Target Target
DNA DNA
Biomarker Biomarker
Amplikon ke-1
Transfer ke tabung PCR ke-2

Gabungan primer dalam & luar
dengan primer "Dalam" ke-2
Primer 1 temp selama

9 siklus dan primer 2
Target temp selama 25 siklus
DNA
Biomarker
Amplikon ke-2
Gambar. 3 Representasi diagram dari tes PCR bersarang dan PCR semi-bersarang untuk diagnosis spesifik
TiLV
Fase eksponensial Non

0,3
denaturasi fase dataran
tinggi
eksponensial
0,2
anil primer
nilai C1
0,1
Garis ambang batas
perpanjangan 0
0 10 20 30 40
Gambar 4 Mekanisme PCR real-time dengan pewarna SYBR Green
3. Saat DNA berikatan dengan pewarna, ia memancarkan sinyal cahaya di

titik eksitasi seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4.
4. Saat produk PCR meningkat, sinyal fluoresen meningkat yang direkam oleh
sistem untuk analisis hasil.
5. Terutama, metode ini cocok untuk deteksi virus dengan sifat kuantitatif,
skalabilitas, dan waktu yang cepat untuk menghasilkan.
6. Metode ini tidak memerlukan metode analisis elektroforesis gel

[13, 14].
3.4.4 RT-LAMP 1. Uji loop-mediated isothermal amplification (LAMP) digunakan untuk

mendeteksi RNA virus.
2. Dua pasang primer digunakan dalam pengujian ini, sepasang primer dalam
dan sepasang primer luar. Primer ini dirancang khusus untuk reaksi.
3. Untuk mengevaluasi kandungan virus, pendekatan serupa bergantung

pada kekeruhan sampel, yang meningkat seiring dengan peningkatan
jumlah materi genetik.
4. Untuk memperkuat dan mendeteksi hasil elektroforesis gel agarosa

metode digunakan.
5. RT-LAMP lebih sensitif daripada tes PCR real-time standar.
6. Hasil assay ini lebih spesifik dengan nil false positivity [15].
7. Untuk mendeteksi sampel TiLV-positif yang lebih spesifik, pengujian ini

digunakan dengan dua set primer berbeda yang spesifik untuk wilayah
tertentu di TiLV [16].
3.4.5 Di Lokasi Teknik hibridisasi in situ digunakan untuk deteksi dan pengenalan urutan asam
Hibridisasi nukleat yang akurat di dalam sel.
56 SR Saranya dkk.
Gambar 5 Tanda Klinis TiLV pada Ikan Nila [6]
1. Pasangan basa komplementer (hibridisasi) dengan segmen asam nukleat

(probe) yang terdeteksi berikatan dengan urutan asam nukleat secara
eksplisit di bagian jaringan.
2. Teknik hibridisasi in situ (ISH) memiliki tiga manfaat utama sensitivitas tinggi
dan lokalisasi dan kuantifikasi anatomi yang akurat [17].
3.5 Pemeriksaan Pemeriksaan awal TiLV melibatkan tanda-tanda klinis dengan pengamatan
Morfologi TiLV fenotipik. Jaringan ikan yang terinfeksi TiLV dapat diperiksa untuk perubahan
histopatologis dan mikroskop elektron transmisi (TEM).
3.5.1 Klinis Ikan yang sakit dengan TiLV memiliki perubahan morfologi seperti yang
Pengamatan ditunjukkan pada Gambar 5:
1. Perubahan mata
2. Erosi kulit yang mengakibatkan lesi dermal hemoragik (Eyngor et al., 2014)
3. Perubahan warna (penggelapan)

4. Perut kembung (akibat cairan atau pembesaran limpa dan organ lain)
5. Eksoftalmia [18]
6. Insang pucat [19]
7. Penonjolan sisik 8.
Perilaku abnormal [6]
9. Kehilangan nafsu makan dan lesu [20].
3.5.2 Histologi 1. Membedah organ ikan yang terinfeksi dan mengawetkan 10%
formalin selama 24-36 jam.
2. Secara singkat, keringkan spesimen, dan sematkan dalam parafin menjadi

potongan pada 5 ÿm.
3. Warnai bagian yang tipis dengan hematoksilin dan eosin (H&E).
4. Terakhir, periksa bagian yang ternoda di bawah mikroskop cahaya.
5. Perubahan patologis TiLV pada ikan meliputi hal-hal berikut: • Nekrosis hepatosit
• Adanya bahan lipoproteinaseosa
coklat (ceroid) di dalam hepatosit • Perut menunjukkan hilangnya kelenjar

lambung secara signifikan
[19 ]
3.5.3 Transmisi 1. Membedah jaringan dari ikan yang terinfeksi dan mengawetkannya dalam 2%
Mikroskop elektron glutaraldehida dalam buffer cacodylate.
2. Tambahkan 1% osmium tetroxide dan resin embedding untuk ultrathin

pembagian.
3. Warnai bagian tipis ini dengan uranil asetat dan timbal sitrat dan periksa dengan
mikroskop elektron transmisi (TEM).
4. Mikroskop elektron dapat memvisualisasikan hepatosit berinti banyak,

penampakan partikel mirip virus di dalam sitoplasma, dan pembengkakan
mitokondria serta hilangnya krista pada organ ikan yang terinfeksi TiLV [19].
Referensi
1. Elangovan P et al (2018) Kultur keramba ikan spesies ikan hingga infeksi tilapia lake virus
nila dengan memperhatikan nutrisi dan pakan. J (TiLV). Akuakultur 497:462. https://doi.org/
Aquac Trop 33:19. https://doi.org/10.32381/jat. 10.1016/j.aquaculture.2018.08.028 6.
2018.33.1-2.3 Saranya SR, Sudhakaran R (2020) Laporan
2. Jansen MD, Mohan CV (2017) Tilapia lake virus prevalensi infeksi virus danau nila pada ikan
(TiLV): tinjauan literatur. 2017 3. nila pia (Oreochromis niloticus). Biocatal Agric
Bacharach E et al (2016) Karakterisasi virus mirip Biotechnol 27:101665. https://doi. org/10.1016/
orthomyxo baru yang menyebabkan kematian j.bcab.2020.101665 7. Behera BK et
massal Tilapia. MBio 7:e00431. https://doi.org/ al (2018) Munculnya Virus Danau Tilapia terkait
10.1128/mBio.00431-16 4. Eyngor dengan kematian ikan nila Oreochromis niloticus
M et al (2014) Identifikasi virus RNA baru yang (Linnaeus 1758) yang dibudidayakan di India.
mematikan bagi nila. Mikrobiol J Clin 52: 4137. Akuakultur 484: 168. https://doi.org/10.1016/
https://doi.org/10.1128/JCM. 00827-14 5. j.aquaculture. 2017.11.025 8. Tsofack JEK et al
Jaemwimol (2017) Deteksi
P, Rawiwan P, Tattiyapong P, Saengnual P, virus tilapia lake pada sampel klinis dengan kultur
Kamlangdee A, Surachetpong W (2018) dan nested reverse transcription-PCR. Klinik J
Kerentanan air hangat yang penting
58 SR Saranya dkk.
Mikrobiol 55:759. https://doi.org/10.1128/ Bioteknologi 13:950. https://doi.org/10.

JCM.01808-16 1111/1751-7915.13586
9. Carr J, Williams DG, Hayden RT (2010) 16. Yin J et al (2019) Pengembangan uji
Deteksi molekuler dari beberapa virus amplifikasi termal iso (RT-LAMP) yang
pernapasan. Dalam: Diagnostik molekuler. dimediasi transkripsi balik sederhana dan
Elsevier/ Academic Press, cepat untuk deteksi sensitif virus danau
Amsterdam 10. Mushtaq Z, Qayoom U, Mir IN, Mir S (2018) tilapia. J Fish Dis 42:817. https://doi.org/
Tilapia lake virus: penyakit virus yang muncul 10.1111/jfd. 12983
pada industri nila. J Entomol Zool Stud 6(5): 17. Laurent-Huck FM, Felix JM (1991) Mengukur
141–144 ekspresi gen oksitosin dan vasopresin
11. Levin RE, Ekezie F-GC, Sun DW (2018) dengan hibridisasi in situ. Metode Neurosci
Teknik berbasis DNA: reaksi berantai 5, no. K:159–182. https://doi.org/ 10.1016/
polimerase (PCR). Dalam: Teknik modern B978-0-12-185259-7.50015-6 18. Dong
untuk otentikasi makanan, hal 527–616. HT, Ataguba GA, Khunrae P, Rattanarojpong T,
https://doi.org/ 10.1016/ Senapin S (2017) Bukti infeksi TiLV pada
B978-0-12-814264-6.00014-1 12. Waiyamitra P, hatcheri tilapia di Thailand dari 2012 hingga
Tattiyapong P, Sirikanchana K, Mongkolsuk 2017 mengungkapkan kemungkinan
S, Nicholson P, Surachetpong W (2018) penyebaran penyakit secara global.
Pengujian TaqMan RT-qPCR untuk deteksi Akuakultur. https://doi.org/10.1016/
tilapia lake virus (TiLV) pada ikan nila. j.aquaculture. 2017.06.035
19. Ferguson HW, Kabuusu R, Beltran S, Reyes
Akuakultur 497:184. https://doi.org/10.1016/j. akuakultur.2018.07.060
13. Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW E, Lince JA, del Pozo J (2014) Syncytial
(2005) RT-PCR real-time kuantitatif – hepatitis nila budidaya, Oreochromis niloticus
perspektif. J Mol Endokrinol 34:597. https:// (L.): laporan kasus. J Fish Dis 37:583. https://
doi.org/10.1677/jme.1.01755 doi. org/10.1111/jfd.12142
14. Mackay IM (2004) Real-time PCR di 20. Surachetpong W, Roy SRK, Nicholson P
laboratorium mikrobiologi. Clin Microbiol Infect (2020) Virus danau Tilapia: cerita sejauh ini.
10:190. https://d oi. org/ 10. 1 1 1 1/j. J Fish Dis 43:1115. https://doi.org/10.1111/
1198-743X.2004.00722.x jfd.13237
15. Huang WE et al (2020) RT-LAMP untuk
diagnosis cepat coronavirus SARS-CoV-2. Mikroba
Bab 9
Isolasi dan Identifikasi Patogen dari

Udang: IHHNV
VM Amrutha, R. Bharath, K. Karthikeyan, R. Vidya, and R. Sudhakaran
Abstrak
Akuakultur adalah sektor makanan yang berkembang pesat di seluruh dunia; makanan laut lebih sehat dan
membantu mengobati lebih banyak penyakit. Sayangnya, wabah penyakit virus akan mengakibatkan kerugian
ekonomi dan lebih banyak kerugian bagi hewan air. Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV)
adalah virus DNA beruntai tunggal yang tidak berselubung. Itu milik keluarga Parvoviridae yang umumnya terdeteksi
dalam budidaya udang penaeid, menginfeksi remaja dan pasca-larva udang air raksasa. Hal ini menyebabkan
sindrom runt-deformity yang ditandai dengan pertumbuhan terhambat, kelainan fisik, dan kelainan bentuk kutikula
antena, rostrum, serta area dada dan perut. Dalam penelitian ini, kami menjelaskan prosedur yang ada untuk
mengisolasi dan mengidentifikasi keberadaan IHHNV
Kata Kunci IHHNV, Ekstraksi DNA, Udang, Virus, PCR, Histopatologi
1. Perkenalan
Dalam beberapa tahun terakhir, industri akuakultur berkembang pesat.

Akuakultur, juga dikenal sebagai aquafarming, adalah pengaturan
budidaya buatan lengkap untuk pertumbuhan ikan, udang, tanaman
obat, dan organisme laut lainnya di darat, kebanyakan di tangki dan
kolam [1]. Budidaya darat didefinisikan sebagai budidaya yang terjadi
di dekat perairan laut yang ditangani oleh manusia, budidaya perairan
darat didefinisikan sebagai budidaya yang terjadi di perairan terbuka
dan pertumbuhan terjadi di lingkungan naturalistik [2], dan budidaya
lepas pantai didefinisikan sebagai budidaya yang terjadi di perairan
terbuka dan pertumbuhan terjadi di lingkungan alam [3, 4]. Beberapa
jenis akuakultur, seperti budidaya udang dan ikan, menambah
kerusakan sumber daya laut, seperti pembuangan limbah, spesies
eksotis, invasi patogen dalam spesies, dan permintaan manusia akan
minyak ikan sebagai obat, yang dapat menghabiskan stok [5] .
Akuakultur ekstensif ditandai dengan pemusnahan pemangsa dan
pengendalian saingan; Akuakultur semi-intensif ditandai dengan meningkatnya kete
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_9,
59
60 VM Amrutha dkk.
akuakultur ditandai dengan penyediaan semua kebutuhan nutrisi [6].
Akuakultur berkembang pesat di sektor pasokan makanan dan obat-

obatan; makanan laut lebih sehat dan juga dapat melawan penyakit seperti
penyakit kardiovaskular, kanker, dan penyakit Alzheimer dan banyak
penyakit lainnya [7, 8]. Dalam beberapa dekade mendatang, tidak hanya
hasil ikan yang meningkat tetapi juga keamanan dan keamanan pangan,
dan organisme air harus tersedia, terjangkau, dan dapat diakses oleh
orang-orang dari semua sektor [9, 10]. Flagela, ragi, bakteri, dan jamur
dapat melindungi ikan dari penyakit sekaligus memberikan nutrisi yang
mirip dengan tepung ikan [11, 12]. Mikroba patogen yang akan hidup
memberi makan ikan tahap larva akan lebih banyak terkena infeksi mikroba
dibandingkan ikan dewasa [13, 14].
IHHNV (virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik menular) adalah
patogen virus virus DNA beruntai tunggal yang tidak berselubung; itu milik
keluarga Parvoviridae yang mempengaruhi makhluk air seperti udang dan
kepiting. Karena virus ini merupakan ancaman konstan bagi organisme
akuatik, sangat penting untuk memahami rute infeksi dan jenis penularan
[15] dari virus ini. Dalam hal rentang inang dan virulensi, virus DNA memiliki
setidaknya tiga strain; strain ini memiliki tingkat kelangsungan hidup inang
yang lebih besar dan beban virus yang lebih rendah dalam pengaturan
akuakultur. IHHNV akan menyebar secara horizontal melalui kandungan
air dan kanibalisme, serta secara vertikal dari ibu ke janin [16]. Kehadiran
IHHNV di tambak udang banyak terlihat pada post-larva yang didatangkan
dari indukan liar. Tanda klinis mereka adalah mimbar kerdil yang tampak
terpelintir ke satu sisi dan tubuh yang bengkok; udang cacat ini mencapai
10-20% dari populasi [17]. IHHNV ini memiliki tingkat pertumbuhan sedang,
memiliki tingkat kelangsungan hidup yang buruk, dan lemah namun tidak
fatal. Virus ini ditemukan di negara-negara seperti India, Indonesia, Taiwan,
dll dan menginfeksi spesies seperti P. japonicus dan P. monodon. Virus ini
menyebabkan epizootik akut dan kematian yang sangat besar yang terlihat
pada juvenil dan pasca-larva udang penaeid; namun, pertumbuhan L.
vannamei berkurang dan ukuran udang menjadi kecil; oleh karena itu, tidak
ada kematian [18]. Jaringan ektodermal dan mesodermal yang terinfeksi
seperti insang, epitel kutikula, jaringan hematopoietik, saraf tali pusat,
organ limfoid, dan kelenjar antena disebarluaskan oleh krustasea dan
vektor seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1 [19, 20 ] .
2 Bahan
2.1 Campuran PCR Tris–HCl, KCl, Triton X, masing-masing dNTPS, MgCl2, primer, DNA yang
diekstraksi, dan Taq DNA polimerase.
2.2 Persiapan Gel 0,8% agarosa ditambahkan ke buffer TBE.

Agarosa
Isolasi dan Identifikasi Patogen dari Udang: IHHNV 61
Gambar 1 Retardasi pertumbuhan udang yang terinfeksi IHHNV [21]
2.3 Lampu PCR Templat, masing-masing primer, DNA polimerase, buffer reaksi, dNTP,
air suling hingga 50 ÿL, dilakukan dalam satu tabung reaksi.
2.4 Persiapan 10 mM Tris–HCl, 0,1 mol/L natrium asetat, 6 mol/L G.HCl, 0,5 M
EDTA.
G.HCl
Penyangga 2,5 TBE Basa trizma, asam borat, EDTA.

Tongkat homogenisasi, etanol, hematoxylin dan eosin-phlox ine,
media esensial minimum (MEM), serum janin sapi, glu taraldehyde,
natrium klorida, sukrosa, Eppendorf.
3 Ekstraksi IHHNV dari Udang Penaid
3.1 Ekstraksi DNA • Ekstraksi DNA dilakukan dari ekstraksi 100 mg otot udang
menggunakan metode guanidine hydrochloride (G.HCl) [22]. •
1000 ÿL G.HCl
dalam 100 mg homogenat jaringan. Inkubasi sampel selama 30 menit
pada suhu kamar. Centrifuge selama 5 menit pada 5000 rpm.
• Pindahkan larutan encer ke tabung mikrosentrifus baru dan etanol

dengan jumlah yang sama. Inkubasi sampel pada suhu kamar
selama 10 menit dan kemudian sentrifugasi sampel selama 15
menit pada
10.000 rpm. • Buang supernatan dan tambahkan etanol 95% 500 ÿL
ke pelet, dan sentrifus selama 10 menit pada 10.000
rpm. • Buang supernatan dan tambahkan 500 ÿL etanol 75% ke dalam
pelet dan kemudian sentrifugasi selama 10 menit pada
10.000 rpm. • Buang supernatan dan keringkan pelet dalam temperatur ruangan
alami dan tambahkan 50 ÿL air steril [23].
62 VM Amrutha dkk.
Tabel 1
primer PCR
Panjang Posisi
S.no Tipe Nama primer Urutan primer produk nukleotida
1a PCR 389F 50 -CGGAACACAACCCGACTTTTA-30 389 bp 1400–1788
389R 50 -GGCCAAGACCAAATACGAA-30 389 bp 1400–1788
1b Nyata IHHNV1608F 50 -TAC-TCC-GGA-CAC-CCA-ACC-A-30 – 1632–1664

waktu
PCR
IHHNV1688R 50 -GGC-TCT-GGC-AGC-AAA-GGT-AA – 1632–1664

30
– 1632–1664
Probe TaqMan 50 -ACC-AGA-CAT-AGA-GCT-ACA
ATC-CTC-GCC-TAT-TTG-30
1c Bersarang IHHNV648F 50 -GAACGGCTTTCGTATTTTGG-30 648 bp –

PCR
IHHNV648R 50 -AGCGTAGGACTTGCCGATTA-30 648 bp –
3.2 Reaksi Rantai • Campuran reaksi mengandung 10 mM Tris–HCl, 50 mM KCl, 0,1% Triton X,
Polimerase (PCR) 200 ÿM dari setiap dNTPS (dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP), 2 mM MgCl2,
Amplifikasi 0,3 ÿM primer (dirancang sesuai urutan yang mengandung infeksi IHHNV
seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1a) [24], 1 ÿL DNA yang diekstraksi, dan
0,625 U Taq DNA polimerase, dan volume akhir harus 50 ÿL.
• Amplifikasi PCR dilakukan: denaturasi selama 5 menit pada 94 C selama 35

siklus, anil pada 94 C selama 30 detik, ekstensi pada 55 C selama 30 detik,
dan ekstensi akhir pada 72 C selama 7 menit ditahan pada suhu 4 C
ditunjukkan pada Tabel 1a [25].
3.3 Pasca-PCR • Elektroforesis gel agarosa dilakukan untuk memvisualisasikan amplifikasi 1,6 kb
Analisis produk.
•
10 ÿL sampel PCR dianalisis pada 0,8% gel agarosa dicampur dengan 0,5
buffer Tris-Borate-EDTA (TBE) dan dicapai dengan etidium bromida.
• Masukkan penanda, kontrol positif, kontrol negatif, dan sampel dalam gel
agarosa; menjalankan elektroforesis gel. • DNA
bersifat negatif sehingga bergerak ke sisi positif saat elektroforesis dilakukan. •
Visualisasikan di
bawah sistem dokumentasi gel jika pita terlihat pada pasangan basa tertentu dan
kemudian sampel yang terinfeksi oleh IHHNV [26].
3.4 Perbandingan • Urutan nukleotida dan deduksi asam amino dari dugaan DNA IHHNV
Urutan dan Analisis dibandingkan dengan urutan IHHNV yang ada di National Center for
Filogenetik Biotechnology Information (NCBI) menggunakan pencarian BLAST,
menunjukkan bahwa urutan tersebut terletak di dalam wilayah pengkode
protein nonstruktural IHHNV [ 27].
• Clustal X untuk mengeksekusi multiple alignment sequences dan perangkat

lunak MEGA dapat membuat pohon filogenetik dengan kekikiran tertinggi
[28].
3.5 PCR Waktu Nyata • Real-time PCR adalah teknik yang digunakan untuk mengukur asam nukleat
seperti DNA dan RNA yang disajikan dalam sampel selama reaksi PCR, dan
juga disebut PCR kuantitatif (qPCR). • IHHNV dideteksi
menggunakan primer PCR, dan probe TaqMan untuk area spesifik dari urutan
genomik IHHNV yang mengkode protein nonstruktural dirancang seperti
yang ditunjukkan pada Tabel 1b [29]. • Urutan primer hulu dan hilir
dikembangkan dengan infeksi IHHNV secara berurutan, dan probe TaqMan
harus mengandung nukleotida dari 1632 hingga 1664 yang menghasilkan
dan memberi label dengan pewarna fluoresen. • 10 ng DNA template
ditambahkan ke 25 ÿL campuran
PCR dengan 0,3 M primer upstream dan downstream dan 0,15 M probe TaqMan
[30].
• AmpliTaq diaktifkan, dan denaturasi terjadi selama 10 menit pada suhu 95 C,

diikuti dengan anil respons 40 siklus selama 15 detik pada suhu 95 C dan
ekstensi selama 1 menit pada suhu 60 C. Sampel diuji dalam rangkap dua
dan hasilnya dianggap positif [31].
3.6 PCR bersarang Ini adalah modifikasi reaksi berantai polimerase yang mengurangi pengikatan
non spesifik pada produk karena amplifikasi situs pengikatan primer yang tidak
terduga.
• Primer sedang mempertimbangkan urutan terkait dengan protein nonstruktural;

Amplifikasi DNA dilakukan dengan pemanasan awal selama 3 menit pada
suhu 94 C dan denaturasi 40 siklus pada suhu 94 C selama 30 detik,
annealing pada suhu 54 C selama 45 detik, dan ekstensi pada suhu 72 C
selama 45 detik setelah amplifikasi dengan primer seperti pada Tabel 1c ;
fragmen diperkuat divisualisasikan dalam elektroforesis gel agarosa
diwarnai dengan ethi dium bromida [32].
• Jika IHHNV ditransfer secara vertikal melalui telur yang terkontaminasi, kita
dapat melakukan nested PCR dengan mengekstraksi DNA dari hemolimf
pada udang betina; sampel IHHNV-positif diidentifikasi melalui nested PCR
[33].
64 VM Amrutha dkk.
Meja 2
Reaksi LAMP
Primer Jenis Barisan (50 –30 ) a
IHHNV-F3 F3 CGACATCCGTGTACCAGA
IHHNV-B3 B3 AGAGCGTAGGACTTTCCG
IHHNV-FIP F2-F1c GTCCTTGGAGTACAAGAGTGTTTATGGATCCAATC

TTAGCTTGGATAATCATCGT
IHHNV-BIP B1c-B2 GAAAATCTCTTACCATCGGTGCAGGATCCGAAGGT

GTTTGAGTCTCCT
3.7 Reaksi LAMPU Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) adalah teknik tabung
tunggal untuk amplifikasi asam nukleat, dan merupakan metode alternatif
berbiaya rendah untuk mengidentifikasi penyakit tertentu. Ini juga
merupakan teknik amplifikasi isotermal yang dapat melakukan suhu
alternatif.
• Forward inner primer (FIP), backward inner primer (BIP), dan dua outer
primer dibuat khusus untuk teknik monoplex LAMP [34]. • Enam
urutan nukleotida
yang berbeda diamplifikasi menggunakan empat urutan target primer
yang berbeda pada suhu konstan 60-65 C [35].
• Untuk menentukan suhu, sampel diinkubasi pada berbagai suhu

selama 60 menit kemudian diterminasi pada suhu 80 C selama 5
menit dengan primer ditunjukkan pada Tabel 2, setelah itu DNA hasil
amplifikasi sebanyak 2 ÿL template, 2 ÿL masing-masing primer, 2 ÿL
DNA polimerase, 5 ÿL buffer reaksi, 2 ÿL dNTP, dan 17 ÿL air suling
untuk membuat 50 ÿL. Ini dilakukan dalam satu tabung reaksi yang
terpapar elektroforesis [36].
3.8 Isolasi Virus dengan Kultur sel dilakukan dengan membuang jaringan yang terinfeksi dari
Kultur Sel hewan yang terinfeksi dan selanjutnya dibiarkan tumbuh dalam kondisi
buatan yang menguntungkan.
• Dalam wadah kultur jaringan, satu lapis sel epithelioma papu losum
cyprinid dibiakkan dalam minimum essential medium (MEM) dengan
10% serum fetal bovine pada suhu 20 C [37]. • Jaringan
yang terinfeksi diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dalam sampel
0,5 mL yang dihasilkan dari jaringan udang yang terinfeksi.
• MEMSFBS ditambahkan ke media, dan wadah diinkubasi pada suhu
20 C dan diperiksa setiap hari. Sel-sel EPC yang tidak terinfeksi
dipertahankan sebagai kontrol [38].
• Virus mengendap dari supernatan pada suhu 4 C selama 90 menit dengan PEG
hingga konsentrasi akhir, sentrifus pada 3000 g selama 15 menit pada suhu
5 C, dan disuspensi ulang dalam buffer TNE.
• Sel yang terinfeksi dibekukan satu kali dan disentrifus pada 3000 g selama 15
menit pada suhu 5 C.
• Suspensi ini ditambahkan ke larutan sukrosa 60% pada 240.000 selama 30

menit pada suhu 5 C. Pita virus kebiruan pada tabung ini dikumpulkan dan
disimpan pada suhu 70 C [39].
3.9 Histopatologi Histopatologi adalah studi tentang penyakit jaringan dan memerlukan studi
jaringan di bawah mikroskop.
• Udang yang hampir mati dikumpulkan dari akuarium dan potongan melintang
dibuat di antara ujung posterior cephalothorax dan segmen perut pertama
cephalothorax tetap, yang disajikan dalam alkohol formalin asam asetat
(AFA) [40] . • Spesimen dipindahkan ke etanol 70% dan
disematkan dalam blok parafin setelah 24–48 jam. • Untuk pemeriksaan histologis,
potongan jaringan udang diwarnai
dengan hematoxylin dan eosin-phloxine [41].
3.10 Di Lokasi Hibridisasi in situ adalah teknik yang memungkinkan deteksi segmen asam nukleat
Hibridisasi spesifik dari irisan histologis dengan menggunakan untai komplementer asam
nukleat yang terikat molekul [42].
• Molekul reporter memungkinkan urutan nukleotida terlokalisasi dalam populasi

sel. Sepotong parafin setebal 4 m ditempatkan pada slide mikroskop
bermuatan positif dan dideparafinisasi dengan memanaskannya selama 45
menit pada 65 C [43].
• Hal ini kemudian direhidrasi dan mulai bereaksi dengan probe berlabel DIG,
menghasilkan endapan biru gelap sampai ungu, menunjukkan adanya infeksi
IHHNV [31].
3.11 Analisis TEM Mikroskop elektron transmisi (TEM) memberikan gambar yang sangat diperbesar
dengan menggunakan sinar partikel elektron yang melewati materi [44].
• Masing-masing organ, seperti jantung, otot, dan jaringan kreatik hepatopan,

difiksasi menggunakan glutaraldehid 6%, natrium klorida 1%, dan sukrosa
0,5%. • Jaringan yang terinfeksi
ditempatkan dalam 1 mL fiksatif selama 6 jam pada suhu 4 C, setelah itu diperiksa
dengan TEM [45].
66 VM Amrutha dkk.
Referensi
1. Yeh SP, Chen YN, Hsieh SL, Cheng W, Liu CH net/publikasi/311600252. Diakses
(2009) Respon kekebalan udang putih, Litopenaeus 25 November 2021
vannamei, setelah infeksi bersamaan dengan 12. Bentzon-Tilia M, Sonnenschein EC, Gram L (2016)
virus sindrom bintik putih dan virus nekrosis Memantau dan mengelola mikroba dalam
hipodermal dan hematopoietik menular. Immunol akuakultur – menuju industri yang berkelanjutan.
Kerang Ikan 26(4): 582–588. https://doi.org/ Mikroba Bioteknologi 9(5):576–584. https://doi.org/
10.1016/j.fsi. 2008.09.010 2. Hoang MN, Nguyen 10.1111/1751-7915.12392 13. Caruso
PN, Bossier
G (2014) Pengaruh kegiatan akuakultur pada
AMVEM, Bossier P (2021) Pengaruh polikultur udang- kumpulan mikroba. https://doi. org/
ikan terhadap parameter imun, ketahanan 10.4172/2332-2632.1000e107 14.
penyakit udang putih dan prevalensi Vibrio spp. Seibert CH, Pinto AR (2012) Tantangan dalam
Aqua Res. https://doi.org/10. budidaya udang karena penyakit virus: distribusi
dan biologi dari lima virus utama penaeid dan
1111/ARE.15666 3. intervensi untuk menghindari kejadian dan
Rico A et al (2013) Penggunaan obat-obatan hewan, penyebaran virus. Braz J Mikrobiol 43(3): 857–864
aditif pakan dan probiotik dalam empat spesies
akuakultur utama yang diperdagangkan secara 15. Macÿás-Rodrÿ´guez NA et al (2014) Prevalensi
internasional yang dibudidayakan di Asia. patogen virus WSSV dan IHHNV pada organisme
Akuakultur 412–413: 231–243. https://doi.org/ liar di Pantai Pasifik Meksiko. J Invertebr Pathol
10.1016/J.AQUA CULTURE.2013.07.028
116(1):8–12. https://doi. org/10.1016/
4. Naylor RL et al (2000) Pengaruh akuakultur J.JIP.2013.11.002 16. Doyle RW
terhadap pasokan ikan dunia. Alam 405(6790): (2005) Pemuliaan udang untuk ketahanan penyakit:
1017–1024. https://doi.org/10.1038/ 35016500 tantangan dan peluang untuk perbaikan [Online].
Tersedia https:// www.researchgate.net/publication/
5. Loh PC, Lu Y, Brock JA (1990) Pertumbuhan virus 265990 674. Diakses 28 Nov 2021 17. Infeksi
udang penaeid hipodermal menular dan virus IHHNV dari udang liar
nekrosis hematopoietik dalam garis sel ikan. Kepulauan Andaman dan Nicobar, India di JSTOR.
Metode J Virol 28(3):273–280. https:// doi.org/ https://www.jstor.org/stable/26494 852. Diakses
10.1016/0166-0934(90)90120-5 6. Bostock J
30 Nov 2021 18. Gunalan B, Soundarapandian P,
et al (2010) Akuakultur: status dan tren global. Anand T, Kotiya AS, Simon
Philos Trans R Soc B Biol Sci 365(1554):2897–
NT (2014) Penyakit terjadi saat sistem budidaya
2912. https://doi.org/10. udang vannamei Litopenaeus di geografis yang
1098/RSTB.2010.0170
berbeda wilayah India. Int J Aquac 4(0):24–28.
7. Owens L et al (1992) Infectious hypodermal and https://doi. org/10.5376/ija.2014.04.0004 19.
haematopoietic necrosis virus (IHHNV) pada Dewangan NK et al (2017) Insidensi infeksi simul
udang penaeid hibrida dari Australia tropis. taneous hypodermal and
Dis Aquat Org 14:219–228 8. haematopoietic necrosis virus (IHHNV) dan white
Finegold C (2009) Pentingnya perikanan dan spot syndrome virus (WSSV) pada Litope naeus
akuakultur bagi pembangunan. Ksla 484 [Online]. vannamei. Akuakultur 471:1–7. https://doi.org/
Tersedia https://digitalarchive. worldfishcenter.org/ 10.1016/J.AQUACUL TURE.2017.01.002
handle/20.500.1234 8/1445. Diakses 25 Nov 2021
9. Subasinghe RP. Prospek pengembangan

akuakultur: isu utama, peluang dan tantangan 1 20. Cavalli LS et al (2013) Kemunculan alami virus
10. sindrom bintik putih dan virus nekrosis hipodermal
Akuakultur: tantangan dan janji | belajar sains di dan hematopoietik Infectious pada kepiting
scitable. https://www.nature.com/scitable/ Neohelice granulata. J Invertebr Pathol 114(1):86–
knowledge/library/aquaculture challenge-and- 88. https://doi.org/10.1016/J.
promise-23690921/. Diakses 26 Nov 2021 JIP.2013.06.002
21. Seri edukasi Infectious Hypodermal and
11. Marchini, A, Ferrario J, Occhipinti A (2016) Haematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) [Online].
Kepentingan relatif akuakultur DAN pelayaran Tersedia www.genics.com. Diakses 14 Nov 2022
sebagai vektor introduksi spesies asing laut: kasus
olbia (sardinia) 22. Escobedo-Bonilla CM, Rangel JLI (2014)
[On line]. Tersedia https://www.researchgate. Kerentanan terhadap inokulum infeksius
hypodermal and haematopoietic necrosis virus 79–85. https : // doi . org / 1 0 . 3 3 5 4 /

(IHHNV) pada tiga batch udang whiteleg DAO044079
Litopenaeus vannamei (Boone, 1931). Zookeys 32. Non-structural Protein 1 (NS1) Gene
457(457):355. https://doi.org/10.3897/ 33. Motte E et al (2003) Pencegahan penularan
ZOOKEYS.457.6715
vertikal IHHNV pada udang vaname Lito
23. Pramanick D, Forstová J, Pivec L (1976) 4 M penaeus vannamei. Akuakultur 219(1–4): 57–
guanidine hidroklorida diterapkan pada isolasi 70. https://doi.org/10.1016/S0044-
DNA dari sumber yang berbeda. FEBS Lett 8486(02)00631-2
62(1):81–84. https://doi.org/10.1016/ 34. He L, Xu HS (2011) Pengembangan metode
0014-5793(76)80021-X multiple plex loop-mediated isothermal
24. Yang B, Song XL, Huang J, Shi CY, Liu L amplification (mLAMP) untuk deteksi simultan
(2007) Bukti adanya virus nekrosis hipodermal warna putih virus spot syndrome dan virus
dan hematopoietik menular pada udang nekrosis hipodermal dan hematopoietik
penaeid yang dibudidayakan di Cina. Dokter menular pada udang penaeid. Akuakultur
Hewan Mikrobiol 120(1–2):63–70. https:// 311(1–4):94–99. https://doi.org/10.1016/
doi.org/ 10.1016/ J.AQUACULTURE.2010.11.051
J.VETMIC.2006.10.011 25. Tang KFJ, Poulos BT, 35. Kiatpathomchai W, Jaroenram W, Arunrut N,
Wang J, Redman RM, Shih HH, Lightner DV Jitrapakdee S, Flegel TW (2008) Deteksi virus
(2003) Variasi geografis antara virus nekrosis sindrom Shrimp Taura dengan transkripsi
hipodermal dan hematopoietik menular terbalik amplifikasi isotermal yang dimediasi
(IHHNV ) isolat dan karakteristik infeksinya. loop dikombinasikan dengan dipstick aliran
Dis Aquat Org 53(2):91–99. https://doi.org/ lateral. Metode J Virol 153(2):214–217. https://
10.3354/ DAO053091 doi.org/ 10.1016/
26. Nunan LM, Poulos BT, Lightner DV (2000) J.JVIROMET.2008.06.025 36. Sun ZF, Hu CQ, Ren CH, Shen Q
Penggunaan polymerase chain reaction untuk Deteksi sensitif dan cepat dari virus nekrosis
deteksi virus nekrosis hypodermal dan hipodermal dan hematopoietik menular
hematopoietik infeksius pada udang penaeid. (IHHNV) pada udang dengan amplifikasi
Mar Biotechnol 2(4):319–328. https://doi.org/ termal iso yang dimediasi loop. Metode J Virol
10.1007/S101260000003 131(1):41–46. https://doi.org/10.1016/J.
27. Lee C et al (2021) Deteksi virus nekrosis JVIROMET.2005.07.011
hipodermal dan hematopoietik yang menular 37. Skrining pendahuluan untuk reseptor protein
(IHHNV, Decapod penstylhamaparvovirus 1) kapsid virus hipodermal dan hematopoietik
pada komoditas udang karang capit merah nekrosis yang menular dari protein membran
(Cherax quad ricarinatus) yang diimpor ke insang Litopenaeus vannamei. J Fish Sci
Korea Selatan. J Mar Sci Eng 9(8):856. https:// China 2015 ÿ06ÿ. https://en.cnki.com.cn/
doi.org/10.3390/JMSE9080856 Article_en/ CJFDTotal-ZSCK201506009.htm.
28. Seta¨la¨ O, Lehtiniemi M, Coppock R, Cole M Diakses 30 Nov 2021
(2018) Mikroplastik dalam jaring makanan 38. Hou L, Wu H, Xu L, Yang F (2009) Ekspresi
laut. Dalam: Kontaminasi mikroplastik di dan perakitan sendiri partikel mirip virus dari
lingkungan perairan: masalah urgensi virus nekrosis hipodermal dan hematopoietik
lingkungan yang muncul. yang menular pada Escherichia coli. Arch Virol
Elsevier, pp 339–363 29. Deteksi IHHNV pada 154(4): 547–553. https://doi.org/10.1007/
udang dengan hibridisasi dot blot dengan S00705-009-0336-6
probe DNA berlabel digoxigenin dengan PCR. 39. Lu Y, Cesar E, Nadala B, Brock JA, Loh PC
J Fish Sci China 2004ÿ02ÿ. https: // dan _ id / (1991) Isolat virus baru dari udang penaeid
n. cnk saya. c om. cn /A r ti cle CJFDTotal- yang terinfeksi hypodermal dan hematopoietic
ZSCK200402002.htm. Diakses 29 Nov 29 2021 necrosis virus (IHHNV). Metode J Virol 31(2–
30. Dhar AK, Roux MM, Klimpel KR (2001) 3):189–195. https://doi.org/
Deteksi dan kuantifikasi virus nekrosis 10.1016/0166-0934(91)90157-U
hipodermal dan hematopoietik infeksius dan 40. Mari J, Bonami JR, Lightner D (1993) Kloning
virus white spot pada udang menggunakan parsial genom hipodermis menular dan virus
PCR kuantitatif waktu nyata dan kimia hijau nekrosis hematopoietik, patogen parvovirus
SYBR. Mikrobiol J Clin 39(8):2835. https:// yang tidak biasa untuk udang penaeid;
doi.org/ 10.1128/ diagnosis penyakit menggunakan pemeriksaan
JCM.39.8.2835-2845.2001 31. Tang KFJ, Lightner khusus. J Gen Virol 74(12):2637–2643. https://
DV (2001) Deteksi dan kuantifikasi virus doi.org/10.1099/0022-1317-74-12- 2637/CITE/
nekrosis hipodermal dan hematopoietik REFWORKS
menular pada udang penaeid dengan real-time PCR. Dis Aquat Org 44(2):
68 VM Amrutha dkk.
41. Vanpatten KA, Nunan LM, Lightner DV (2004) 73(2):103–111. https://doi.org/10.3354/

Burung laut sebagai vektor potensial virus DAO073103
udang penaeid dan pengembangan model 44. Zhu YP, Li C, Wan XY, Yang Q, Xie GS,
laboratorium surro gate dengan memanfaatkan Huang J (2019) Pengiriman DNA plasmid ke
ayam domestik. Akuakultur 241(1–4):31–46. hemosit udang oleh partikel nano virus
https://doi.org/10.1016/J.AQUACULTURE.2004. nekrosis hipodermal dan hematopoietik
08.012 menular (IHHNV) yang diekspresikan dari
42. Hsieh CY et al (2006) Infectious hypodermal sistem sel serangga baculovirus. J Invertebr
and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) Pathol 166:107231. https://doi.org/10.1016/
infeksi pada udang galah, Macro brachium J.JIP.2019.107231 45. Chayaburakul K, Lightner
rosenbergii. Akuakultur 258(1–4): 73–79. DV, Sriurairattana S, Nelson KT,
https://doi.org/10.1016/J.AQUA Withyachumnarnkul B (2005) Respon berbeda
CULTURE.2006.04.007 terhadap infeksi virus nekrosis hipodermal
43. Teng PH et al (2006) Deteksi virus nekrosis dan hematopoietik (IHHNV) di Penaeus
hipodermal dan hematopoietik infeksius monodon dan P. vannamei. Dis Aquat Org
(IHHNV) pada Litopenaeus vannamei dengan 67(3):191–200. https://doi.org/ 10.3354/DAO067191
uji amplifikasi ramifi cation. Dis Aquat Org
Bab 10
Isolasi dan Identifikasi Ichthyophonus hoferi dari

Ikan

Abstrak
Ichthyophonus hoferi adalah patogen ikan yang umum ditemukan pada ikan air tawar dan laut. I. hoferi
menyebabkan infeksi sistemik granulomatosa, yang disebut ichthyophoniasis. Ada banyak bukti yang
tercatat dari infeksi ini yang mengakibatkan kematian massal lebih dari 80 spesies air tawar dan laut,
yang menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar. Parasit ini telah dilaporkan menghasilkan infeksi
pada berbagai spesies teleost laut, air tawar, dan muara, mengadaptasi berbagai faktor lingkungan.
Kata kunci Ichthyophonus hoferi, Sistemik, Ichthyophoniasis, Granulomatosa, Parasit
1. Perkenalan
Ichthyophonus hoferi adalah protista bersel tunggal yang memiliki

stadium amoeboid dan hifa. Dinding sel terdiri dari kitin. Itu milik kelas
Ichthyosporea, ordo Ichthyophonida, dan genus Ichthyo phonus [1, 2].
Pada tahun 1893, von Hofer pertama kali mengidentifikasi parasit ini dari
budidaya sungai dan trout coklat di Jerman. Belakangan, pada tahun
1911, berdasarkan sifat I. hoferi, ia dinamai dan dideskripsikan sebagai
jamur oleh Plehn dan Mulsow. Pada akhirnya, itu diklasifikasikan di
bawah Mesomyce tozoea [3, 4].
Zadeh dkk. [4] melakukan penelitian pada air tawar yang terinfeksi
secara alami. Mereka mendeteksi Ichthyophonus hoferi dari dua ikan
hias: black tetra, Gymnocorymbus ternetzi, dan tiger barb, Puntigrus
tetrazona. Kocan [5] melaporkan studi tentang siklus hidup transmisi I.
hoferi. Mereka mengungkapkan bahwa itu masih merupakan patogen
ikan yang penting baik pada ikan budidaya maupun ikan liar.
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_10,
69
2 Bahan
• Sampel jaringan, ginjal, hati, usus, dan limpa. • Cawan

petri. • Kantong
autoklaf. • Minimum
essential medium (MEM) Eagle. • Agar dekstrosa
(SDA) Sabouraud. • Noda Giemsa.
• Media trypticase soy agar (TSA). •

Media telur dorset. • 10%
formalin alami buffer fosfat. • Pewarnaan
hematoksilin-eosin atau asam-Schiff periodik. •
Perangkat tisu DNeasy (Qiagen).
• Asam etilendiamintetraasetat (EDTA). •
Penyangga NaCl–Tris–EDTA (NTE).
• buffer ekstraksi DNA.
• Tris–HCl.
• Etanol absolut.
• 70% etanol.
• Primer PCR. •
Jarum bedah. •
Mikroskop kamera Sa-Iran. •
Sentrifugasi. •
Konsentrator Vac Kecepatan.
• Elektroforesis. •
Transiluminator UV.
3 Metode
3.1 Isolasi • Ambil sampel jaringan. •
Ichthyophonus Homogenkan sampel dalam buffer NTE. •
hoferi [4]
Kultur pada MEM yang dilengkapi dengan serum janin sapi (FBS) 10%,
3.1.1 Kultur Jaringan streptomisin (100 mg/mL), dan penisilin (100 IU/mL).
• Inkubasi biakan pada suhu 25 °C dan periksa setiap hari.
• Siapkan apusan tisu kering setelah 2 minggu dan warnai dengan
pewarna Giemsa.
Isolasi dan Identifikasi Ichthyophonus hoferi dari Ikan 71
3.1.2 Pemeriksaan • Kumpulkan sampel dari berbagai organ—limpa, ginjal,

Mikologi dan dan hati.
Bakteriologi
• Budidayakan pada media trypticase soy agar (TSA) pada suhu 32 °C selama
48 jam.
Bakteriologis
Penyelidikan
• Pindahkan koloni ke media telur Dorset. • Inkubasi pada
suhu 25 °C selama 14 hari.
Pemeriksaan Mikologi • Ambil sampel dari beberapa organ dalam seperti hati, usus, limpa, dan ginjal
dengan menggunakan jarum bedah steril.
• Inokulasi ke media SDA dan MEM-10 dengan 1% janin sapi
serum.
• Inkubasikan pelat dan tabung pada suhu kamar selama 15 hari.
3.2 Identifikasi dari • Mengidentifikasi isolat dengan mengamati karakter morfologi meliputi spora
Ichthyophonus hoferi berinti banyak, pertumbuhan hifa dengan preparat pewarnaan, dan
pemeriksaan mikroskopis sediaan basah.
3.2.1 Pemeriksaan
Mikroskopis
3.3 Reaksi Rantai • Homogenkan 50 mg sampel jaringan dalam 100 ÿL ekstrak DNA
penyangga tion.
Polimerase (PCR)
Deteksi • Larutkan jaringan atau pelet yang telah dihomogenisasi dalam buffer ekstraksi
3.3.1 Ekstraksi DNA selama 10 menit pada suhu kamar. •
Centrifuge pada 5000 rpm selama 5 menit pada 4 °C.
• Pindahkan 600 µL supernatan ke dalam tabung lain. •
Tambahkan dua volume etanol 100% untuk mengendapkan DNA. •
Campur sampel dengan benar.
• Sentrifuge pada 12.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 °C untuk mendapatkan DNA
pelet.
• Tuang supernatan dan cuci pelet dengan etanol 70%. • Keringkan etanol
menggunakan konsentrator Speed Vac. • Larutkan DNA
dalam air suling atau buffer Tris-EDTA (TE) dalam jumlah yang sesuai. • Simpan
pada suhu 4 °C atau -20 °C.
3.3.2 Pengujian PCR [6] • Rancang primer PCR—primer maju, Ich7f (5ÿ-GCT -CTT-AAT-TGA-GTG-TCT-
AC-3ÿ), dan primer mundur, Ich6r (5ÿ-CAT-AAG-GTG-CTA-ATG -GTG-
TC-3ÿ). • Siapkan reaksi dalam volume 25 µL yang
mengandung 1X buffer PCR, 0,2 mM dNTP, 2,5 Mm MgCl2, 25 pmol setiap
primer, 2 µL template DNA, dan 0,025 U/µL DNA Taq polimerase.
• Lakukan reaksi selama 35 siklus—denaturasi awal pada 95 °C selama 3

menit, denaturasi pada 94 °C selama 30 detik, annealing pada 60 °C
selama 45 detik, dan ekstensi pada 72 °C selama 60 detik, diikuti dengan
akhir ekstensi pada 72 ° C selama 7 menit.
• Jalankan elektroforesis dengan produk PCR menggunakan agarosa. •

Visualisasikan di bawah transiluminator UV.
Referensi
1. Torruella G, Mendoza A, Grau-Bove´ X, Anto´ 4. Zadeh MJ, Peyghan R, Manavi SE (2014)
M, Chaplin MA, Campo J, Eme L, Pe´rez Cordo Deteksi Ichthyophonus hoferi pada ikan hias
ń G, Whipps CM (2015) filogenomik air tawar yang terinfeksi secara alami. J Aquac
mengungkapkan evolusi konvergen gaya hidup Res Dev 5:289
pada kerabat dekat hewan dan jamur. Curr Biol 5. Kocan RM (2018) Model penularan patogen
25(18): 2404–2410 ikan Ichthyophonus: sintesis pengamatan
2. Grau-Bove´ X, Torruella G, Donachie S, Suga lapangan dan studi empiris. Can J Fish Aquat
H, Leonard G, Richards TA, Ruiz-Trillo I (2017) Sci 76:636–642 6.
Dinamika inovasi genomik pada nenek moyang Whipps CM, Burton T, Watral VG, St-Hilaire S,
hewan unisel lular. eLife 6:e26036 3. Kent ML (2006) Menilai keakuratan uji reaksi
Kocan RM (2013) Usulan perubahan nomenklatur berantai polimerase untuk ichthyophonus hoferi
Ichthyophonus sp. tahapan kehidupan dan di Sungai Yukon Chinook salmon Oncor
struktur. J Parasitol 99:906–909 hynchus tshawytscha. Dis Auat Org 68:141–147
Bab 11
Isolasi dan Identifikasi Branchiomyces demigrans dari

Ikan

Abstrak
Selama lebih dari dua dekade terakhir, akuakultur telah menjadi salah satu kegiatan yang paling berkembang di seluruh dunia.
Branchiomyces demigrans adalah salah satu patogen jamur perusak yang umum, mengancam beberapa ikan air tawar dan
menyebabkan kematian, menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar. Diameter hifa B. demigrans biasanya berkisar
antara 13–14 ÿm hingga 22–28 ÿm di ujung hifa. Ketebalan dinding 0,5–0,7 ÿm dan diameter spora sekitar 12–17 ÿm. Mereka
ditemukan pada ikan dengan pH rendah, 5,8-6,5, oksigen terlarut rendah, dan sedikit stres.
Kata kunci Branchiomyces demigrans, Hifa, Oksigen terlarut, Stres
1. Perkenalan
B. demigrans adalah salah satu spesies jamur yang menyebabkan

branchiomycosis, menginfeksi pike utara, bass mulut besar, bass
bergaris, dan tench. Branchiomycosis adalah penyakit jamur yang
umum terjadi pada ikan, terutama pada ikan mas yang terjadi hampir
di seluruh dunia. Kadang-kadang, penyakit patogen ini menyebabkan
busuk insang, menyebabkan kematian yang tinggi pada populasi besar
ikan air tawar. B. demigrans mempengaruhi seluruh wilayah insang.
Hifa menembus dinding pembuluh darah ke dalam lumen dan filamen
insang, menyebar di permukaan [1].
Khalil dkk. [2] melaporkan sebuah studi tentang infeksi
Branchiomyces demi grans pada ikan mas, Cyprinus carpio L., dan ikan
nila, Oreochromis niloticus, di berbagai daerah di Mesir, menekankan
pada faktor stres lingkungan. Mereka mengungkapkan diameter hifa
dan spora yang tidak bersekat. Mereka menggambarkan karakteristik
jamur lain dan infeksi branchiomycosis yang disebabkan oleh B.
demigrans.
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_11,
73
2 Bahan
• Kapas.
• 70% etil alkohol. •

Cawan petri. •
Kantong autoklaf. •
Noda biru laktofenol. •
Media Sabouraud's Dextrose Agar (SDA) (ekstrak ragi, 5 g; air
suling, 1 L).
• Antibiotik—sikloheksimida (0,5 g), gentamisin (0,65 mL dari 40 mg/
mL), kapsul kloramfenikol (1 250 mg).
• 10% formalin alami buffer fosfat. • Pewarnaan
eosin dan hematoxylin. • Asam
etilendiamintetraasetat (EDTA). • Penyangga
NaCl–Tris–EDTA (NTE). • buffer
ekstraksi DNA.
• Tris–HCl.
• Etanol mutlak.
• Primer PCR. •
Kloroform.
• Lemak Parafin.
• Mikroskop cahaya.
• Elektroforesis. •
Transiluminator UV.
3 Metode
3.1 Isolasi • Disinfeksi sampel jaringan ikan dengan kapas dan basahi dengan
Branchiomyces etanol 70%.
demigrans [3–5] • Homogenkan sampel dengan buffer NTE. •
Kultur sampel pada media SDA yang dilengkapi dengan siklo
heksimida, gentamisin, dan kloramfenikol.
• Inkubasi cawan pada suhu 28 C selama 7 hari.
• Subkultur koloni pada suhu 38 C selama 5 hari. •
Warnai dengan kapas biru laktofenol untuk memeriksa pertumbuhan jamur
pada kaca objek yang bersih.
• Amati bentuk, warna, tekstur, pertumbuhan jamur pada koloni,
konidium, dan spora, serta ukur diameter hifa.
Isolasi dan Identifikasi Branchiomyces demigrans dari Ikan 75
3.2 Identifikasi dari • Pasang slide di bawah mikroskop cahaya. • Periksa

Branchiomyces insang secara langsung. • Amati
demigran [6] karakteristik spora Branchiomyces
3.2.1 Pemeriksaan demigran.
Mikologi
3.2.2 Pemeriksaan • Perbaiki spesimen dalam formalin alami buffer fosfat 10%.
Histopatologi selama 24 jam.
• Cuci dengan air keran yang mengalir. •

Dehidrasi melalui etanol. • Bersihkan
dengan kloroform dan sematkan dalam lilin parafin pada suhu 60 C. • Ambil
5µm bagian jaringan. Pewarnaan dengan eosin dan hematoks
noda ylin.
3.2.3 Morfometri • Ukur panjang dan lebar lamella dengan menggunakan skala mikro
Insang meter.
• Perkirakan jumlah unit pembentuk koloni/gram berat (CFU/g) spesies jamur.
3.2.4 Molekul • Homogenkan 50 mg sampel jaringan dalam 100 ÿL ekstrak DNA

Deteksi Menggunakan penyangga tion.
Rantai Polimerase
• Larutkan jaringan atau pelet yang telah dihomogenisasi dalam buffer ekstraksi
Reaksi (PCR)
selama 10 menit pada suhu kamar. •
Ekstraksi DNA Sentrifuge pada 5000 rpm selama 5 menit pada suhu
4 C. • Pindahkan 600 ÿL supernatan ke tabung lain. •
Tambahkan dua volume etanol 100% untuk mengendapkan DNA. • Campur
sampel dengan benar. • Centrifuge
pada 12.000 rpm selama 20 menit pada 4 C untuk mendapatkan DNA
pelet.
• Tuang supernatan dan cuci pelet dengan etanol 70%. • Keringkan etanol
menggunakan konsentrator Speed Vac. • Larutkan DNA
dalam air suling atau buffer Tris-EDTA (TE) dalam jumlah yang sesuai. • Simpan
pada suhu 4 C atau 20 C.
Uji PCR • Lakukan tes PCR untuk mendeteksi DNA dalam sampel. • Rancang
dua primer universal, IST1 (50 -TCC-GTA-GGT-GAA CCT-GCG-G-30 ) dan
ISP4 (50 -TCC-TCC-GCT-TAT-TGA TAT-GC-30 ), untuk amplifikasi jamur .
• Lakukan reaksi selama 35 siklus—denaturasi awal pada 95 C selama 3

menit, denaturasi pada 95 C selama 30 detik, annealing pada 68 C
selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72 C selama 30 detik, diikuti
pemanjangan akhir pada 72 C selama 5 menit.
• Jalankan elektroforesis dengan produk PCR menggunakan agarosa 2%.
• Visualisasikan di bawah transiluminator UV.
Referensi
1. Mahboub HH, Shaheen AA (2019) Identifikasi gariepinus) di kota metropolitan Ilorin. Harran U¨
mikologi dan histopatologi patogen ikan potensial niv Vet Fak Derg 8(2):186–
pada tilapa Nil. Akuakultur 530: 735849. https:// 190 4. Ibrahim KS (2011) Isolasi dan studi patologi
doi.org/10.1016/j.aquacul ture.2020.735849 Branchiomycosis dari kolam komersial ikan mas
(Cyprinus carpio), di Kegubernuran Duhok/Irak.
2. Khalil RH, Saad TT, Selema TAM, Latif HMR (2015) Iraqi J Vet Med 35(1):1–9 5. Alfisyahrin F, Prayitno
Infeksi Branchiomyces demigrans pada ikan mas SB, Sarjito
(Cyprinus carpio L.) yang dipelihara di peternakan (2019) Prevalensi dan identifikasi penyakit jamur
dan ikan nila, (Oreochromis niloticus) di tempat pada juvenil Ikan Lele (Clarias gariepinus) di
yang berbeda di Mesir, dengan penekanan khusus Pesisir Kendal Jawa Tengah. IOP Conf Ser Earth
pada peran faktor stres lingkungan. Int J Innov Environ Sci 246:012048
Stud Aquat Biol Fish 1(1):15–23 3.
Adeshina I, Amoka PP, Tiamiyu LO, Abubakar M, 6. Bouhy ZM, Shaheen AA, Hassanin ME, Mah boub
Adesanmi O (2019) Formasi alami dan efek HH (2014) Branchiomycosis pada ikan nila
patologis Spesies Branchiomyces pada ikan lele (Oreochromis niloticus) di Kegubernuran Behiera
Afrika yang dibudidayakan ( Clarias dengan uji coba untuk pengobatan. Zag Vet J 42(3):29–42
Bab 12
Isolasi dan Identifikasi Parasit Microsporidian,

Enterocytozoon hepatopenaei Infeksi Udang Penaeid
K. Karthikeyan, VM Amrutha, SR Saranya, and R. Sudhakaran
Abstrak
Dalam budidaya udang, infeksi parasit mikrosporidian Enterocytozoon hepatopenaei telah menjadi penyakit
terkenal dengan kebutuhan kritis untuk menarik perhatian sektor ini. Baru-baru ini, ada kesulitan ekonomi yang
cukup besar dalam industri budidaya udang. Diagnosis dini dan karantina adalah praktik yang paling diinginkan
dan saat ini karena tidak memiliki perawatan yang memadai atau protokol profilaksis untuk infeksi. Dalam beberapa
hari terakhir, berbagai pendekatan diagnosis berbasis molekuler telah dilaporkan. Dalam penelitian ini, kami
menjelaskan teknik berbasis molekuler untuk mendiagnosis infeksi EHP pada budidaya udang.
Kata kunci EHP, Udang, Real-time PCR, Pewarnaan, Mikroskop, Diagnosis
1. Perkenalan
Akuakultur adalah sektor makanan yang paling cepat berkembang di dunia,

dengan negara-negara di seluruh dunia membudidayakan udang dan udang.
Di Asia, genus Penaeus sebagian besar digunakan untuk pertanian. Penaeus
monodon mudah dijinakkan dalam budidaya. Kemudian, P. vannamei
menjadi dekat dengan produsen udang di seluruh dunia karena dapat
bertahan dalam keadaan patogen dan bertahan hidup, luar biasa. White
spot disease (WSD) merupakan patogen serius dalam sejarah budidaya
udang, namun spesies ini dapat menghindari epidemi [1].
Sebuah laporan statistik dari Otoritas Pengembangan Ekspor Produk
Kelautan (MPEDA) mengamati pertumbuhan yang luar biasa dalam ekspor
udang global setelah diperkenalkannya spesies asing ini [2]. Budidaya dan
ekspor udang telah meningkat pesat di India.
Kegiatan ini seringkali dipengaruhi secara negatif oleh faktor-faktor seperti
manajemen yang tidak tepat, tekanan lingkungan, dan penyakit yang
berbeda. Berbagai patogen, seperti protozoa, jamur, bakteri, dan virus, dari
lingkungan alami menyebabkan wabah penyakit yang signifikan.
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_12,
77
78 K. Karthikeyan dkk.
Di tambak L. vannamei di berbagai bagian India, penyakit yang disebabkan oleh

parasit mikrosporidian baru, Enterocytozoon hepatope naei (EHP), telah diamati,
menurut [3]. Parasit ini ditemukan bertanggung jawab atas kerugian ekonomi yang
signifikan dalam bisnis budidaya udang dengan memperlambat pertumbuhan udang
di kolam budidaya, dan kerugian tersebut terus berlanjut hingga saat ini [4]. Parasit ini
ditemukan dan dikarakterisasi pada tahun 2009 [3], diikuti dengan peningkatan
kejadian penyakit mikrosporidian di sejumlah negara [5] [6].
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1 Isolasi dari • Hati-hati membedah udang yang terinfeksi EHP dan mengambil hepa toppancreas
Spora Microsporidian tanpa mengganggu bagian perut untuk menghindari kontaminasi mikroba. Untuk
dari Udang ekstraksi spora dari kotoran: Kumpulkan kotoran udang yang terinfeksi EHP. •
Hepatopankreas dan Menggunakan 500 µL dimetil eter, homogenkan hepa topancreas
Masalah Tinja [7] udang dan bahan feces dan vortex campuran selama 1 menit.
• Disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm, kemudian dituang

supernatan, dan pelet disimpan.
• Untuk mencuci pelet, tambahkan 500 ÿL air suling steril dan sentrifus seperti
dijelaskan di atas. Ulangi proses pencucian dua kali lagi.
• Kumpulkan pelet yang mengandung sebagian spora EHP murni dan simpan pada
-80 °C.
2.2 Identifikasi: Ekstraksi DNA total dari jaringan udang EHP menggunakan metode fenol kloroform
Metode Molekuler standar:
2.2.1 Ekstraksi DNA • Timbang 100 mg jaringan udang yang diduga EHP dan tambahkan 500 ÿL buffer
lisis (50 mM Tris–HCl pH 9, 0,1 M EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 2% SDS).
• Homogenkan seluruhnya dan tambahkan 5 ug enzim proteinase K

dan inkubasi pada suhu 55°C selama 30 menit.
• Selanjutnya, tambahkan fenol/kloroform/isoa myl alkohol dengan volume yang

sama (25:24:1) dan sentrifus pada 16.000 × g selama 5 menit. • Kumpulkan
lapisan air dan pindahkan ke dalam mikro segar 1,5 mL

tabung sentrifuse.
• Tambahkan etanol 100% sedingin es dengan volume yang sama dan inkubasi pada
-80°C/-20°C selama 1 jam dan sentrifus pada 16.000 × g selama 15 menit pada
suhu 4 °C.
• Tambahkan 500 ÿL etanol 70% dan sentrifus pada 16.000 × g selama 5 menit dan
tuang supernatan dan keringkan pelet.
Isolasi dan Identifikasi EHP pada Udang 79
• Resuspensi pelet DNA dalam air steril dan simpan pada -20 °C untuk
analisis lebih lanjut.
Reaksi Rantai Polimerase Konvensional: [6, 8].
2.3 Amplifikasi Genom • Tambahkan 2 ÿL buffer MgCl2 10×15 mM ke dalam tabung PCR 0,2 mL.
yang Ditargetkan EHP
• Tambahkan 0,5 sampai 2,5 U Taq DNA polimerase (sesuai rekomendasi
Akan Dilakukan di
manufaktur). • 200
Sepeda Termal.
Standar Konvensional ÿM dari masing-masing empat nukleotida (200 ÿM dNTP). • 50–200
Reaksi PCR 20 ÿL ÿM dari setiap primer maju dan mundur. • Tambahkan 10–
(Karthikeyan et al. 100 ng DNA genom total. • Buat volume hingga
[10], FTA) 20 ÿL dengan penambahan PCR steril
air.
• Kondisi thermal cycler adalah sebagai berikut: denaturasi awal pada 95

°C selama 3–5 menit, 35 siklus denaturasi selanjutnya pada 95 °C
selama 10–60 detik, anil pada 50–65 °C selama 5–60 detik, perpanjangan
pada 68–72 °C selama 20–120 detik, dan satu siklus ekstensi akhir
pada 68–72 °C selama 3–10 menit.
• Visualisasikan produk PCR yang diamplifikasi dengan menjalankan

elektroforesis gel agarosa dan periksa di bawah transiluminasi UV.
2.4 Reaksi Rantai Estimasi DNA genom EHP target kuantifikasi absolut berdasarkan
Polimerase konsentrasi DNA EHP yang diketahui:
Kuantitatif [9, 10]
• Tambahkan 12,5 ÿL campuran master 2× SYBR Green I (pilihan
pengguna) (Taq HS DNA polimerase, campuran dNTP, Mg2+, RNaseH,
dan SYBR Green I), masing-masing 50–200 pmol primer maju dan
mundur. •
Tambahkan DNA genom dari 10 hingga 100 ng dan 1 ÿL plasmid EHP
yang diencerkan
secara serial. • Kondisi termal adalah denaturasi awal pada 95 °C selama
3 menit, 40 siklus denaturasi pada 95 °C selama 5 detik, dan anil/
ekstensi pada 60 °C selama 30 detik (ikuti instruksi pembuatan). •
Untuk analisis kuantitatif, interpretasikan hasil menurut kurva standar
(salinan plasmid yang diketahui) dengan sampel yang tidak diketahui;
untuk pengujian deteksi, interpretasikan dengan nilai ambang batas siklus.
2.5 Identifikasi: • Perbaiki sampel hepatopankreas udang yang terinfeksi EHP dalam 10%
Pemeriksaan formalin.
Mikroskopi
• Siapkan bagian berukuran 3–5 um menggunakan mikrotom dan bersihkan
bagian tersebut dengan air suling.
2.5.1 Pewarnaan
Hematoksilin dan Eosin [8] • Benamkan bagian ke dalam stoples yang berisi hematoxylin untuk kopling
10 detik
• Hilangkan noda berlebih dengan membiarkan slide di tap yang sedang berjalan
air.
80 K. Karthikeyan dkk.
• Bilas bagian tersebut dengan alkohol asam 0,3% hingga latar belakang menjadi
tidak berwarna.
• Bilas slide dengan air keran yang mengalir. •
Celupkan bagian tersebut ke dalam tabung kopling yang berisi eosin selama 30
detik. • Bilas slide dengan air keran yang mengalir.
• Dehidrasi bagian tersebut dengan menggunakan cairan pembersih alkohol (50,
70, 80, 95, dan 100%). • Bilas
dengan xylene selama tiga sampai lima kali. • Tutup
bagian tersebut menggunakan kaca penutup dengan pemasangan yang sesuai
sedang.
2.5.2 Trikrom yang Dimodifikasi • Siapkan apusan spora EHP murni pada slide kaca dan biarkan
Noda [11] kering.
• Tambahkan setetes methanol absolute pada apusan dan biarkan
5 menit.
• Tempatkan slide kaca dalam noda trichrome yang disaring selama 90

menit. • Bilas sisa noda menggunakan alkohol asam tidak lebih dari 10 detik. •
Tempatkan slide kaca pada etanol 95% dan 100% masing-masing selama 10
menit. • Tempatkan slide kaca pada xylene selama 10
menit. • Pasang dengan kaca penutup dengan media pemasangan yang
sesuai. • Periksa spora EHP di bawah perendaman minyak.
2.5.3 Neon • Tempatkan sepotong kecil hepatopankreas di atas slide berlapis poli-lisin 0,01%.
Pewarnaan: Pewarnaan
Kitin [12]
• Tambahkan 50 ÿL paraformaldehyde 4% dan 50% Triton (49:1; v/v) dan inkubasi
selama 25 menit pada suhu kamar.
• Cuci kaca objek dengan salin buffer fosfat (pH 7,0) selama tiga
waktu.
• Tambahkan 50 ÿL Fluorescent Brightener 28 (pengenceran 1:1000; Sigma, USA)

dan inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar.
Ulangi langkah pencucian.
• Amati spora EHP di bawah mikroskop fluoresen.
2.5.4 Noda Putih • Kumpulkan sampel feses/hepatopankreas udang yang terinfeksi EHP dan
Calcofluor [13] homogenkan dengan saline buffer fosfat menggunakan stik plastik homo
genized. • Siapkan
apusan sebagian kecil dari homogenat pada slide kaca. • Tambahkan setetes
campuran Calcofluor white stain dan Evans blue stain dan inkubasi selama 5 menit.
• Amati spora EHP di bawah mikroskop fluoresen.

Isolasi dan Identifikasi EHP pada Udang 81
2.5.5 Transmisi • Tempatkan setetes spora murni pada grid 200 mm berlapis
Mikroskop Elektron (TEM)
karbon. • Tambahkan setetes asam fosfotungstat segar 2% dan
[11]
biarkan mengering di bawah
hot plate (45 °C). • Amati detail ultrastruktural spora EHP di
bawah mikroskop elektron transmisi.
Referensi
1. Thimadee S et al (2016) Kajian ancaman penyakit 2592–2595. https://doi.org/10.1128/jcm.

saat ini untuk udang penaeid yang dibudidayakan di 33.10.2592-2595.1995
Asia. Akuakultur 452:69–87. https://doi. org/10.1016/ 8. Biju N et al (2016) Prevalensi tinggi enter ocytozoon
j.aquaculture.2015.10.028 2. Karthikeyan K, hepatopenaei pada udang penaeus monodon dan
Sharma A, Mekata T, Itami T, Sudhakaran R (2017) litopenaeus vannamei yang diambil sampelnya dari
Amplifikasi isotermal bermeditasi loop waktu nyata tambak dengan pertumbuhan lambat di India. Dis
yang cepat dan sensitif untuk mendeteksi Aquat Org 120(3):225–230. https://doi.org/10. 3354/
Enterocytozoon hepatope naei udang. Akuakultur dao03036 9.
481 (September):119–123. https://doi.org/10. 1016/ Sudhakaran R et al (2009) Metode non-enzimatik
j.aquaculture.2017.08.036 3. Tourtip S et al (2009) sederhana untuk preparasi DNA white spot syndrome
Enterocytozoon hepa topenaei sp. virus (WSSV) dari hemolimf Marsupenaeus japonicus
november (Microsporida: Enterocyto zoonidae), parasit menggunakan kartu matriks FTA. J Fish Dis 32(7):
udang windu Penaeus monodon (Decapoda: 611–617. ht tps://doi.org/10.1111/j.
Penaeidae): struktur halus dan hubungan filogenetik. 1365-2761.2009.01042.x
10. Karthikeyan K, Saranya R, Bharath R, Vidya R, Itami

J Invertebr Pathol 102(1):21–29. https://doi. org/ T, Sudhakaran R (2020) Metode berbasis kertas
10.1016/j.jip.2009.06.004 4. Newman saring sederhana untuk mengangkut dan menyimpan
SG (2015) Microsporidian berdampak pada produksi DNA hepatopenaei Enterocytozoon dari jaringan
udang. Advokat Glob Aquac Maret/April Litopenaeus vannamei yang terinfeksi. J Inver tebr
(September):33–35 Pathol 169(Desember 2019):107305. https://doi.org/
5. Tang KFJ, Pantoja CR, Redman RM, Han JE, Tran 10.1016/j.jip.2019.107305 11. Karthikeyan K,
LH, Lightner DV (2015) Pengembangan uji hibridisasi Sudhakaran R (Mar. 2019)
in situ dan PCR untuk mendeteksi Enterocytozoon Eksperimen transmisi horizontal Enter ocytozoon
hepatopenaei (EHP), parasit mikrosporidian yang hepatopenaei pada post-larva udang vaname
menginfeksi udang penaeid. J Invertebr Pathol Litopenaeus vannamei. J Fish Dis 42(3):397–404.
130:37– 41. https://doi.org/10.1016/j.jip.2015. 06.009 https://doi.org/10.
1111/JFD.12945
12. Wang L et al (2020) Metode qpcr dan pewarnaan
6. Kesavan K, Mani R, Toshiaki I, Sudhakaran R (2017) terpadu untuk deteksi dan kuantifikasi enterocytozoon
Laporan cepat prevalensi parasit microsporidian hepatopenaei pada udang litope naeus vannamei.
udang Enterocytozoon hepa topenaei di India. Mikroorganisme 8(9):1–11. https://doiorg/1 0 . 3 3 9
Aquac Res 48(7): 3980–3984. https://doi.org/10.1111/ .
0 / mikroorganisme8091366
are. 13078
13. Gao W et al (2020) Metode pewarnaan ganda
7. Bukhari Z, Smith HV (1995) Pengaruh tiga teknik menggunakan calcofluor white dan acridine orange
konsentrasi pada viabilitas ookista Cryp tosporidium untuk membedakan stadium hidup Enterocytozoon
parvum yang diperoleh dari kotoran sapi. Mikrobiol hepatopenaei (EHP) pada bagian hepatopancreatic.
J Clin 33(10): Akuakultur 528:735628. https://doi. org/10.1016/
j.aquaculture.2020.735628
Bagian II
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada

Akuakultur
Bab 13
Metode Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik

dari Ikan
Mahalakshmi S. Patil, Raghu Ram Achar , dan Ann Catherine Archer
Abstrak
Industri akuakultur yang berkembang sering dihadapkan pada tantangan peningkatan produksi yang
menyebabkan beberapa penyakit bakteri dan virus pada ikan. Antibiotik dan bahan kimia biasanya digunakan
untuk mencegah dan mengendalikan penyakit. Namun, penggunaan antibiotik yang tidak hati-hati telah
menyebabkan ancaman serius penyebaran resistensi antibiotik pada ikan yang mengakibatkan transfer gen
resistensi dari patogen ke mikroflora lainnya. Untuk memenuhi peningkatan permintaan industri makanan dan
menjaga kesehatan manusia, ikan, dan lingkungan, probiotik dianggap sebagai alternatif yang lebih aman dan
ramah lingkungan. Karena spesies ikan laut dan air tawar berbagi hubungan yang rumit dengan lingkungannya,
mikrobiota ikan berbeda dari satu spesies ke spesies lainnya dan karenanya membutuhkan strain probiotik yang
kuat untuk menargetkan spesies tertentu dan patogen penyakit. Mengisolasi bakteri probiotik dari lingkungan
inang sangat ideal karena mereka memiliki kemampuan untuk beradaptasi dan berkoloni di inang dan
memberikan efek menguntungkan. Bab ini menguraikan metode untuk isolasi mikroorganisme probiotik potensial
dan teknik yang digunakan untuk identifikasi mereka.
Kata kunci Probiotik, Bakteri probiotik, Bakteri asam laktat, Akuakultur, Fingerprinting, RAPD,
pengurutan gen 16S rRNA
1. Perkenalan
1.1 Probiotik dan Probiotik didefinisikan sebagai "mikroorganisme hidup bila

Bakteri Probiotik dikonsumsi dalam jumlah yang cukup memberikan manfaat
kesehatan pada inang" [1]. Istilah "probiotik" yang berarti "seumur
hidup" berasal dari kata Yunani "pro" dan "bios." Konsep probiotik
pertama kali dikemukakan oleh E'lie Metchnikoff ketika dia
mengamati bahwa konsumsi susu fermentasi mengurangi
mikroorganisme pembusuk dan meningkatkan kesehatan dan
kesejahteraan. Saat ini, probiotik digunakan sebagai profilaksis,
terapeutik, dan suplemen pertumbuhan baik untuk kesehatan
manusia maupun hewan [2]. Probiotik memiliki efek menguntungkan
melalui berbagai mekanisme termasuk eksklusi kompetitif patogen,
penghambatan patogen, produksi enzim, modulasi sistem kekebalan tubuh dan
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_13,
85
86 Mahalakshmi S. Patil dkk.
pencernaan [3, 4]. Mikroorganisme probiotik yang dipelajari secara umum

termasuk bakteri asam laktat (BAL), Bacillus spp., dan bahkan beberapa
spesies ragi. LAB adalah bakteri yang paling banyak dipelajari sebagai
probiotik karena sejarah penggunaannya yang panjang dalam makanan
fermentasi dan keamanannya [5]. BAL juga secara alami ada di saluran
pencernaan manusia, hewan, dan ikan. Menjadi penghuni usus komensal,
LAB memiliki kemampuan untuk mentolerir kondisi asam dan empedu
usus, mengurangi pH dengan produksi asam laktat, dan mencegah
kolonisasi patogen [6].
1.2 Kebutuhan Akuakultur adalah industri yang berkembang pesat terutama di negara
Probiotik pada Perikanan berkembang karena meningkatnya populasi, permintaan akan sumber
protein yang sehat, dan penurunan ikan di sumber pedalaman [3, 7].
Dengan industri yang diarahkan untuk memenuhi kebutuhan kerawanan
pangan dan malnutrisi yang terus meningkat, beban budidaya ikan
menyebabkan peningkatan kerentanan penyakit dan pembusukan hasil
tangkapan. Sementara metode peternakan yang sehat dapat mengurangi
beban penyakit, agen biokontrol lainnya seperti bahan kimia dan antibiotik
digunakan untuk pencegahan dan pengendalian penyakit [8]. Namun,
penggunaan bahan kimia dan antibiotik berpotensi menimbulkan risiko
kesehatan bagi konsumen dan lingkungan karena dapat terakumulasi
dalam ikan, tetap sebagai residu dalam jaringan, dan yang lebih penting
menyebabkan masalah resistensi antibiotik [9-11] . Karena gen resisten
antibiotik dapat ditransfer secara horizontal ke bakteri lain, penting untuk
mengadopsi langkah-langkah untuk mengekang penyebaran resistensi
dan menjaga kesehatan ikan, manusia, dan lingkungan [12]. Probiotik
sedang diselidiki secara ekstensif sebagai alternatif yang aman dan ramah
lingkungan untuk meningkatkan produksi, memperpanjang umur simpan,
dan mengurangi masalah penyakit di sektor akuakultur [13-16].
1.3 Isolasi dari Di masa lalu, probiotik untuk akuakultur terutama berasal dan diadaptasi
Probiotik dari manusia dan hewan darat tanpa mengetahui fakta bahwa fisiologi
spesies akuatik sangat berbeda dan hubungannya dengan lingkungan jauh
lebih rumit [17] . Untuk aplikasi akuakultur, probiotik umumnya diisolasi
dari mikrobiota baik mikrobiota asli maupun eksogen hewan air. Sementara
bakteri Gram-negatif seperti Vibrio dan Pseu domonas mendominasi flora
asli ikan laut, genera Aeromonas, Bacteroides, Fusobacterium, dan
Eubacterium terdapat pada spesies air tawar. LAB ditemukan subdominan
pada ikan [18]. Dengan demikian, bakteri probiotik yang diisolasi dari ikan
inang cenderung beradaptasi dan lebih baik daripada rekan terestrial
mereka. Juga, efek probiotik spesifik untuk strain. Oleh karena itu,
penyaringan yang ketat terhadap isolat asli sangat penting untuk memilih
isolat potensial untuk aplikasi probiotik. Skrining awal menggunakan
metode in vitro sangat ideal untuk mengisolasi dan mengidentifikasi strain
potensial meskipun tes lebih lanjut diperlukan untuk membuktikan efek
menguntungkannya.
Selain LAB dan Bacillus, genera bakteri lainnya termasuk

Metode Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan 87
Aeromonas, Arthrobacter, Clostridium, Bifidobacterium, Paeniba

cillus, Pseudomonas, Roseobacter, Rhodosporidium,
Streptomyces, dan Vibrio, mikroalga, dan ragi juga digunakan
sebagai probiotik untuk budidaya aqua. Metode yang digunakan
untuk isolasi bakteri probiotik diuraikan dalam bab ini. Karena
isolasi selalu disertai dengan identifikasi isolat, metode
identifikasi juga dijelaskan.
2 Bahan
2.1 Media
Bahan-bahan gram/liter
Komposisi
Protease pepton 10.000
2.1.1 Lactobacillus
bakteriologi pepton 10.000
deMan, Rogosa, dan
Agar Sharpe (MRS): Bubuk ekstrak ragi 5.000
Dekstrosa (Glukosa) 20.000
Polisorbat 80 (Tween 80) 1.000
Amonium sitrat 2.000
Natrium asetat 5.000
Magnesium sulfat 0,100
Mangan sulfat 0,050
Dipotassium hidrogen fosfat 2.000
Agar 12.000
pH akhir (pada 25 °C) 6,5 ± 0,2
2.1.2 Agar Kedelai Triptik

tripton 17.000
Pepton kedelai 3.000
Natrium klorida 5.000
Dekstrosa (glukosa) 2.500
Dipotassium hidrogen fosfat 2.500
Agar 15.000
pH akhir (pada 25 °C) 7,3 ± 0,2

2.1.3 Agar Nutrisi Bahan-bahan gram/liter
Pepton 5.000
HM pepton B# 1.500
Ekstrak ragi 1.500
Agar 15.000
pH akhir (pada 25 °C) 7,4 ± 0,2
2.1.4 Kaldu Miller Luria

Bertani
tripton 10.000
Ekstrak ragi 5.000
pH akhir (pada 25 °C) 7,5 ± 0,2
2.1.5 Zobell Marine Agar

Pepton 5.000
Ekstrak ragi 1.000
Ferri sitrat 0,100
Magnesium klorida 8.800
Sodium sulfat 3.240
Kalsium klorida 1.800
Potasium klorida 0,550
Natrium bikarbonat 0,160
Potasium klorida 0,080
Stronsium klorida 0,034
Asam borat 0,022
Natrium silikat 0,004
natrium fluorat 0,0024
Amonium nitrat 0,0016
Dinatrium fosfat 0,008
Agar 15.000
pH akhir (pada 25 °C) 7,6 ± 0,2

2.2 Bahan Kimia Halus Saline (0,85%), larutan penyangga fosfat (PBS pH—7,4), air pepton
(1%), gliserol, etanol (70%), air ultra murni, klorida (10%), minyak
cengkeh, etil alkohol, 2-fenoksietanol, etil p-aminobenzoat, trikain
metana sulfonat, ungu bromokresol, natrium klorida (NaCl), benzalkonium
klorida (0,1%), hidrogen peroksida, kristal violet, yodium Gram,
dekolorisasi Gram, safranin.
2.3 Reagen Tris–EDTA buffer (TE buffer), lisozim, proteinase K, sodium dodecyl
Biologi Molekuler sulfate (SDS), Tris-saturated phenol, chloroform, sodium acetate,
absolute ethanol, agarose, tris-acetic acid-EDTA (TAE) buffer, ethidium
bromide, Pewarna pemuatan gel 6×, tangga DNA 10 Kb,
Buffer PCR, MgCl2, dNTP, Taq DNA polimerase, bebas nuklease
air.
3 Metodologi
3.1 1. Panen ikan dari air tawar (sungai, sungai, kolam, dan danau) dan
Pengumpulan Sampel air laut (lautan dan laut) oleh nelayan profesional melalui jaring,
pengerukan, jaring pukat, jaring hanyut, harpun, perangkap
keranjang, kail dan umpan, jaring celup , dan jaring pukat [19, 20].
• Sampel ikan
meliputi spesies air tawar dan air laut, yaitu, spesies Tilapia
(spesies ikan yang paling banyak dibudidayakan kedua di
dunia), ikan teri (kering dan asin), kerapu dan loach, sampel
ikan kerang (udang, udang, crap, conch), belanak , karper, white
bream, goby, rainbow trout, Sheedal, bass laut, paree merah,
nightcrawler Afrika, Budu (ikan fermentasi), Channa striata,
Puntius berserabut, Oreochromis mossambicus, Rasbora
daniconius, Ballan wrasse, seabream putih, ikan Peter, Eropa
conger, ikan kalajengking merah, belanak abu-abu, ikan air
tawar zebra, gurnard sirip panjang, ikan impian, hiu kucing
berbintik kecil, triggerfish, cuckoo wrasse, carp rohu, Labeo
rohita, belanak hasil tangkapan liar (Mugil cephalus, Chelon
ramada, Chelon labrosus, Chelon saliens ), ikan barramundi,
Scorpis violacea, Barbonymus
gonionotus, Girella diolah
Ikan yang dipanen mela terlebih
nichthys, danuntuk
dahulu Cyprinus carpio. 2.
menghilangkan kontaminasi
permukaan dengan salah satu dari dua metode yang disebutkan di
bawah ini: Metode 1
Kumpulkan ikan dari air tawar dan air laut dan sub 1. semprotkan
ke permukaan (tubuh) cuci dengan benzalkonium klorida (0,1% selama
1 menit), diikuti dengan anestesi menggunakan etil-p-ami nobenzoat
(0,04 g), minyak cengkeh, dan etil alkohol yang diencerkan dalam air
(untuk mengurangi konsentrasi) atau dengan mencelupkannya ke
dalam tricaine methanesulfonate/pukulan tajam pada kepala ikan
dan dilakukan isolasi [21-23].
Metode 2
1. Perkenalkan ikan ke dalam aklimatisasi dalam ruangan dengan

pemeliharaan rutin dan pakan nabati atau diet basal (komposisi—tepung
ikan, bungkil kedelai, jagung giling, bunga gandum, minyak sayur, minyak
ikan cod, dikalsium fosfat, gluten, tepung jagung, canola oil, carboxymethyl
cellu loose, ÿ-starch, mineral mix, vitamin mix) dalam bentuk pelet dua
kali sehari dan terus diamati.
2. Sebelum diisolasi, lakukan periode kelaparan selama 48 jam dan bunuh

baik dengan menyuntikkan atau mencelupkannya ke dalam pelarut
organik yang disebutkan di atas [24, 25].
3.2 Isolasi 1. Mengorbankan ikan dan membedah secara aseptis dengan gunting/pinset
steril bagian-bagian yang dibutuhkan seperti perut, hati, ginjal, insang, kulit,
3.2.1 Pengenceran Seri dan
gonad, dan usus. Homogenkan dalam saline steril/buffer PBS (pH 7,4)/1%
Pelapisan (Gbr. 1) [26–29]
air pepton. Yang jelas, usus ikan (usus) lebih disukai untuk isolasi.
2. Siapkan tabung reaksi yang berisi 9 mL air salin/PBS/pepton dengan sumbat

kapas dan autoklaf pada suhu 121 °C selama 20 menit.
3. Tambahkan 1 mL sampel yang telah dihomogenisasi ke dalam tabung pertama
berlabel 10-1. Aduk rata dan pindahkan 1 mL aliquot dari tabung pertama ke
tabung kedua berlabel 10-2 .
Gambar 1 Metode pengenceran serial dan pelapisan untuk isolasi bakteri probiotik
4. Ulangi pengenceran secara berurutan ke tabung-tabung berikutnya sampai 10-7 atau

10-9 atau sesuai keinginan.
5. Tambahkan 0,1 mL alikuot dari salah satu pengenceran yang diinginkan

dan tuang cawan pada agar MRS/TSA/NA/LB/ZMA. Media agar dipilih
berdasarkan spesies yang ingin diisolasi.
6. Media agar dapat dilengkapi dengan indikator seperti bro mocresol
ungu atau natrium klorida (1–2%). Bromocresol pur ple digunakan
untuk menunjukkan koloni BAL. Natrium klorida ditambahkan ke
sampel ikan laut untuk meniru kondisi air laut.
7. Inkubasi cawan petri pada suhu 25–30 °C selama 24–72 jam dan amati
pertumbuhan koloni, serta hitung satuan pembentuk koloni
menggunakan rumus berikut:
Jumlah total: koloni × faktor pengenceran
CFU=ML=
Volume sampel berlapis
Pengamatan: Temukan koloni dengan karakteristik koloni yang

berbeda dapat dipilih, dipetik, dan dikultur dalam media cair pilihan
untuk karakterisasi lebih lanjut.
Pelat yang mengandung bromokresol ungu akan menunjukkan
pewarnaan kuning di sekitar koloni karena produksi asam yang
mengindikasikan BAL.
3.2.2 Pemurnian dari 1. Kultur yang ditumbuhkan semalaman dalam kaldu digoreskan ke piring
Isolat agar MRS/TSA/NA/LB untuk mendapatkan kultur murni yang terisolasi.
2. Pilih satu koloni dari lempeng bergaris dan biakan yang sesuai
kaldu.
3. Siapkan stok gliserol dengan menambahkan biakan murni dengan 40% gliserol dengan
perbandingan 1:1 dalam tabung Eppendorf dan simpan pada suhu -20 °C.
3.3 Identifikasi 1. Pewarnaan Gram: Lakukan pewarnaan Gram untuk mengetahui

Awal apakah isolat tersebut Gram positif atau Gram negatif. (a)
Tes [30] Secara singkat, olesi satu ose kultur pada kaca objek yang bersih dan
fiksasi panas. Genangi apusan dengan pewarna kristal violet
primer dan
diamkan selama 1 menit. (b) Cuci dengan air ledeng. Tambahkan
yodium Gram selama 1 menit diikuti dekolorisasi selama 30
detik. Terakhir, warnai
dengan safranin (counterstain) selama 45 detik. (c) Cuci noda dengan
air, keringkan slide, dan
amati di bawah mikroskop. (d) Sel yang tampak berwarna biru atau
ungu adalah Gram positif, sedangkan sel yang
berwarna merah muda adalah Gram negatif. (e) Morfologi sel (cocci/bacilli/streptoco
cobacillus, dll.) dicatat.
2. Uji katalase : Uji katalase dilakukan untuk menguji kemampuan isolat dalam memecah
hidrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase.
(a) Tambahkan beberapa tetes hidrogen peroksida (H2O2) ke dalam ose penuh
biakan pada slide kaca yang bersih.
(b) Pelepasan buih menunjukkan reaksi katalase-positif, sementara tidak ada buih
yang merupakan katalase-negatif.
Catatan: BAL merupakan organisme Gram-positif dan katalase-negatif,

sedangkan Bacillus spp. adalah Gram-positif dan katalase positif.
3.4 Karakterisasi Isolat bakteri ditumbuhkan pada kondisi fisiologis yang berbeda seperti suhu, pH, dan
Fenotipik konsentrasi garam serta adanya gula yang berbeda untuk identifikasi awal isolat hingga
[31–34] tingkat genera dan spesies.
3.4.1 Pertumbuhan Bakteri 1. Siapkan kaldu MRS/TS/LB segar dalam tabung reaksi (5 mL) dengan sumbat kapas
Isolat di Berbeda dan sterilkan.
Suhu 2. Inokulasikan 1% biakan yang ditumbuhkan dalam semalam ke dalam tabung reaksi
dan tempatkan pada suhu yang berbeda selama 24–48 jam untuk mengamati
pertumbuhannya.
3. Pengamatan: Pertumbuhan direpresentasikan sebagai berikut:
1. +/- = menunjukkan tidak ada
pertumbuhan 2. + = menunjukkan
pertumbuhan 3. ++ = menunjukkan
pertumbuhan yang baik 4. +++ = menunjukkan pertumbuhan yang subur

(berlaku untuk semua tes fisiologis dan biokimia)
3.4.2 Pertumbuhan Isolat 1. Siapkan media MRS/TS/LB segar dan sesuaikan pH-nya
Bakteri pada pH Berbeda asam atau basa menggunakan pH meter.
2. Untuk kaldu dengan pH asam, sesuaikan kaldu dengan pH asam 2 dan 3 dengan
menambahkan HCl pekat, dan tangani dengan memakai sarung tangan, pelindung
mata, dan masker.
3. Untuk menyiapkan kaldu pH basa, encerkan pelet NaOH dalam air dan kemudian
tambahkan pelarut encer tetes demi tetes untuk membawa kaldu ke pH basa 7 dan
9.
4. Inokulasikan 1% biakan yang tumbuh semalaman dalam kaldu pH (asam atau basa)
dan inkubasi selama 24–48 jam pada suhu 25–30 °C dalam inkubator.
Catat hasilnya setelah itu.
3.4.3 Pertumbuhan Bakteri 1. Tambahkan MRS dengan konsentrasi garam yang berbeda dan
Isolasi di Garam Berbeda simpan untuk sterilisasi.
Konsentrasi 2. Subkultur isolat dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam.
3. Inokulasikan 50 ÿL biakan dalam tabung reaksi steril yang berisi kaldu dengan
penambahan NaCl pada konsentrasi yang berbeda (dapat berkisar antara
4% dan 6,5% tergantung pada organisme yang diinginkan) dan inkubasi
selama 24 jam pada suhu 25–30 °C dalam inkubator dan hasilnya harus
dicatat.
3.4.4 Gula Tes ini terutama dilakukan untuk isolat BAL karena menunjukkan pemanfaatan
Tes Fermentasi gula yang bervariasi tergantung pada kemampuan fermentasinya.
1. Tambahkan kaldu MRS dengan gula yang berbeda (1%) dan indikator fenol
merah. Tempatkan tabung Durham dalam posisi terbalik di tabung reaksi
dan sterilkan.
2. Inokulasikan 1% biakan yang tumbuh semalaman ke dalam kaldu steril dan

inkubasi selama 24–48 jam pada suhu 25–30 °C.
3. Pengamatan: Isolat dibedakan menjadi homofermentatif (produksi asam—
perubahan warna dari merah menjadi kuning) atau heterofermentatif
(produksi asam dan gas—perubahan warna dari merah menjadi kuning dan
pembentukan gelembung gas dalam tabung Durham).
4. Hasil dari semua pengujian akan ditabulasikan seperti pada Tabel 1.
3.5 Molekul Tes fisiologis dan biokimia membantu dalam identifikasi tentatif isolat. Namun,
Identifikasi identifikasi mereka yang akurat pada tingkat spesies memerlukan penggunaan
teknik molekuler. DNA diisolasi dari kultur murni isolat bakteri yang selanjutnya
digunakan sebagai template untuk identifikasi selanjutnya dengan metode PCR
(polymerase chain reaction).
3.5.1 Total DNA Metode fenol/kloroform dalam praktiknya untuk mengekstraksi DNA genomik dari
Isolasi [35] suspensi bakteri.
1. Centrifuge kultur semalaman (1 mL) pada 8000 rpm selama

10 menit pada 4 °C.
2. Pemisahan pelet dan supernatan ditemukan setelah sentrifugasi.
3. Buang supernatan dan suspensikan pelet dengan menambahkan 500 ÿL

buffer 1× TE dan 30 ÿL lisozim, direkomendasikan untuk dicampur secara
menyeluruh, dan inkubasi dalam penangas air selama 1 jam pada suhu 37 °C.
Tabel 1
Tes fisiologis isolat
Sl. TIDAK Isolat Suhu (°C) pH Konsentrasi garam Tes fermentasi
01 Isolasi-1
02 Isolasi-2
03 Isolasi-3
4. Tambahkan 15 ÿL proteinase K dan SDS (20%) secara perlahan untuk mendapatkan

larutan bening dan inkubasi dalam penangas air selama 30 menit pada suhu 55 °C.
5. Tambahkan tris-saturated phenol (250 ÿL) dan centrifuge pada 8000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4 °C.
6. Amati pemisahan fasa pada langkah ini dan kumpulkan fasa air bagian atas
dengan hati-hati tanpa menyeret sedimen.
7. Setelah pemisahan fasa, campurkan kloroform (400 ÿL) ke fasa air bagian atas
dan sentrifus pada 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C.
8. Kumpulkan fase berair dengan hati-hati dan campurkan dengan 15 ÿL natrium

asetat (3 M) di samping 400 ÿL alkohol absolut dingin dan inkubasi untuk
pengendapan DNA.
9. Semalam inkubasi sampel DNA pada suhu 4 °C dan sentrifugasi

hari berikutnya dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 °C.
10. Buang supernatan dan cuci pelet dengan menambahkan alkohol absolut 70%
(50 ÿL) dan sentrifus pada 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 °C.
11. Dapatkan pelet dan keringkan udara selama 5–10 menit pada suhu 30–37 °C,
suspensikan pelet dalam 50 ÿL air bebas nuklease atau buffer TE dan simpan
pada -20 °C.
12. Kualitas DNA diperiksa dengan elektroforesis gel agarosa.
3.5.2 Elektroforesis 1. Larutkan 0,8% agarosa dalam Tris-acetic acid (TAE buffer) dan homogenkan
Gel Agarosa dalam oven microwave, dan biarkan dingin pada suhu 50 °C.
2. Tuang agarosa ke dalam nampan pengecoran, tutup dengan pita perekat,

dan tempatkan sisir untuk membuat sumur.
3. Tempatkan nampan pengecoran ke tangki elektroforesis yang berisi 1×

penyangga TAE.
4. Masukkan sampel DNA (4 ÿL) dengan 2 ÿL 6× gel loading (tracking) dye.
5. Jalankan gel pada 80 V hingga pewarna pelacak mencapai tiga perempat

gel.
6. Noda gel dengan merendam dalam wadah yang berisi larutan etidium bromida.
7. Visualisasikan pita dalam transiluminator UV.
8. Pita yang diamati di bawah sumur gel menunjukkan adanya DNA. Pita tebal
dan utuh menunjukkan kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh.
9. Dokumentasikan hasil dalam sistem dokumentasi gel atau dengan mengambil

gambar di bawah sinar UV.
3.5.3 Acak Amplified RAPD adalah teknik berbasis PCR yang digunakan untuk membedakan antara
Polymorphic DNA spesies dan strain. Ini umumnya digunakan sebagai alat sidik jari dalam
(RAPD PCR) identifikasi isolat. Primer universal seperti M13 dapat digunakan untuk RAPD
PCR [36].
1. Siapkan campuran reaksi PCR (25 µL) yang terdiri dari 50 ng/µL DNA
sebagai cetakan, masing-masing 10 pmol primer maju dan mundur, 10×
buffer PCR, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, dan 0,5 U Taq DNA
polimerase .
2. Tambahkan campuran reaksi ke dalam tabung PCR 0,2 mL, aduk rata, dan
memutar sampel dalam mikrosentrifus.
3. Tempatkan tabung dalam thermal cycler dan atur program sebagai berikut:
denaturasi awal pada 95 °C selama 5 menit diikuti dengan 35–40 siklus
denaturasi pada 95 °C selama 1 menit, anil pada suhu yang sesuai
(diputuskan berdasarkan pada primer yang dipilih) selama 1 menit, dan
ekstensi pada 72 °C selama 2 menit, diikuti ekstensi akhir pada 72 °C
selama 10 menit.
4. Amati hasil amplifikasi dengan elektroforesis gel agarosa menggunakan
gel agarosa 1,8%. Jalankan sampel bersama tangga DNA 10 Kb.
Dokumentasikan hasilnya.
5. Amati keberadaan beberapa pita di setiap jalur dan bandingkan antara

isolat untuk pola pita yang sama atau berbeda (Gbr. 2a).
3.5.4 Gen 16S rRNA Sekuensing gen 16S rRNA dalam praktiknya untuk mengidentifikasi bakteri
Pengurutan [37] tak dikenal pada tingkat spesies dan tingkat genus dan membedakan antara
spesies bakteri yang terkait erat. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan
menggunakan primer universal: 27F dan 1492R.
Gambar 2 Agarose gel image RAPD PCR dari isolat LAB (a). Jalur 1 adalah tangga DNA, dan Jalur 2–9 adalah
pola pita (sidik jari) yang diperoleh dari sampel DNA yang diamplifikasi dari isolat BAL. (b) PCR gen 16s rRNA dari
isolat BAL. Ukuran amplikon adalah 1500 bp sesuai dengan tangga DNA (Data tidak dipublikasikan dari Ann
Catherine Archer)
1. Siapkan campuran reaksi PCR seperti yang disebutkan dalam

Subpos 3.5.3 dengan primer 16S. Masukkan sampel ke dalam
thermal cycler dengan program yang sama seperti yang disebutkan
dalam Subpos 3.5.3. Suhu anil ditetapkan berdasarkan pilihan primer.
2. Jalankan produk yang diamplifikasi pada gel agarosa 1% pada 80 V
dan visualisasikan pita yang sesuai dengan ukuran produk amplikon
yang diharapkan (Gbr. 2b).
3. Keluarkan band dan kirimkan untuk diurutkan. Subjek urutan
pencarian BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Hit identitas 98-100% dipertimbangkan untuk identifikasi spesies.
Terima kasih
Para penulis ingin mengucapkan terima kasih yang tulus kepada
otoritas di JSS Academy of Higher Education & Research, Mysuru,
untuk memberikan dukungan dan fasilitas yang diperlukan. ACA
berterima kasih kepada DBT Wellcome Trust India Alliance atas hibah
Early Career Fellowship (IA/E/20/1/505689). MSP mengakui dukungan
Pemerintah Karnataka. untuk beasiswa OBC (OBC-10/PhD/
CR-04/2021-22).
Referensi
1. FAO/WHO (2001) Laporan konsultasi ahli bersama bacilli: suplemen menarik untuk budidaya aqua.
FAO/-WHO tentang evaluasi kesehatan dan sifat J Appl Microbiol 129(1):116–136 7. Bostock
gizi probiotik dalam makanan termasuk susu J, McAndrew B, Richards R, Jauncey K, Telfer T,
bubuk dengan bakteri asam laktat hidup. Co'rdoba, Lorenzen K, Little D, Ross L, Handisyde N,
Argentina 2. Kesarcodi-Watson A, Gatward I, Corner R (2010) Akuakultur: status dan
Kaspar H, Lategan MJ, Gibson L (2008) Probiotik tren global.
dalam akuakultur: kebutuhan, prinsip dan Philos Trans R Soc B 365(1554):2897–2912 8.
mekanisme tindakan dan proses penyaringan. Abdel-Latif HM, Dawood MA, Menanteau Ledouble
Akuakultur 274(1):1–14 3. El-Saadony MT, S, El-Matbouli M (2020) Sifat dan konsekuensi
Alagawany M, Patra AK, Kar I, Tiwari R, Dawood MA, koinfeksi pada tilapia: Tinjauan. J Fish Dis
Dhama K, Abdel-Latif HM (2021) Fungsi probiotik 43(6):651–664 9. Dadar M, Dhama
dalam akuakultur: gambaran umum . Fish Shellfish K, Vakharia VN, Hoseinifar SH, Karthik K, Tiwari R,
Immunol 117:36–52 4. Archer AC, Halami PM Khandia R, Munjal A, Salgado-Miranda C, Joshi
(2015) Atribut probiotik SK (2017) Kemajuan dalam akuakultur vaksin
Lactobacillus fermentum diisolasi dari kotoran terhadap patogen ikan: status global dan tren saat
manusia dan produk susu. Appl Micro biol ini. Rev Fish Sci Aquac 25(3):184–217 10. Assefa
Biotechnol 99(19):8113–8123 5. Archer AC, A, Abunna F (2018)
Muthukumar SP, Halami PM (2015) Pemeliharaan kesehatan ikan dalam akuakultur:
Potensi anti-inflamasi Lactobacillus spp. pada edema tinjauan pendekatan epidemiologis untuk
kaki yang diinduksi karagenan pada tikus Wistar. pencegahan dan pengendalian penyakit menular
Int J Biol Macromol 81:530–537 ikan. Dokter Hewan Int 2018: 5432497
11. Pe'rez-Sa'nchez T, Mora-Sa'nchez B, Balca'zar JL

6. Ringø E, Van Doan H, Lee SH, Soltani M, (2018) Pendekatan biologis untuk pengendalian
Hoseinifar SH, Harikrishnan R, Song SK (2020) penyakit dalam akuakultur: keuntungan,
Probiotik, bakteri asam laktat dan keterbatasan dan tantangan. Tren Mikrobiol 26(11):896–903
12. Santos L, Ramos F (2018) Resistensi 22. Valderrama B, Ruiz JJ, Gutie´rrez MS, Alveal
antimikroba dalam akuakultur: Pengetahuan K, Caruffo M, Oliva M, Flores H, Silva A,
terkini dan alternatif untuk mengatasi Toro M, Reyes-Jara A, Navarrete P (2021)
masalah tersebut. Agen Mikrobiota Ragi yang Dapat Dibudidayakan
Antimikroba Int J 52(2):135–143 13. Amoah K, dari Spesies Ikan Laut Genypterus chilensis
Huang QC, Tan BP, Zhang S, Chi SY, Yang dan Seriolella violacea. J Fungi
QH, Liu HY, Dong XH (2019) Suplemen (Basel) 7(7):515 23. Sharifuzzaman SM, Rahman
makanan probiotik Bacillus coa gulans ATCC H, Austin DA, Austin B (2018) Properti
7050, meningkatkan kinerja pertumbuhan, Probiotik Kocuria SM1 dan Rhodococcus
morfologi usus, flora mikro, respon imun, SM2 Diisolasi dari Usus Ikan. Probiotik
dan konfrontasi penyakit udang vaname Antimikrob Protein
Pasifik, Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish 10(3):534–542 24. Abomughaid MM (2020)
Immunol 87:796–808 14. Azad MAK, Islam SS, Isolasi dan Identifikasi Beberapa Bakteri
Sithi IN, Ghosh AK, Banu GR, Bir J, Huq KA Probiotik dan Peran Potensialnya dalam
(2019) Pengaruh probiotik terhadap Meningkatkan Respon Kekebalan dan
kompetensi imun udang galah Macrobrachium rosenbergii.
Ketahanan Ikan Nila (Oreo chromis niloticus)
Aquacult Res 50(2):644– Dibandingkan dengan Komersial Produk
657 15. Balca´zar JL, Vendrell D, de Blas I, Ruiz komersial. Int J Mikrobiol 2020: 8865456
Zarzuela I, Muzquiz JL, Girones O (2008) 25. AlKalbani NS, Turner MS, Ayyash MM (2019)
Karakterisasi sifat probiotik bakteri asam Isolasi, identifikasi, dan karakterisasi
laktat yang diisolasi dari biota mikro usus probiotik potensial dari bakteri asam laktat
ikan. Akuakultur 278(1-4):188–191 16. yang diisolasi dan investigasi in vitro aktivitas
Araujo C, Munoz-Atienza E, Poeta P, Igrejas G, sitotoksisitas, antioksidan, dan antidiabetes
Hernandez PE, Herranz C, Cintas LM (2016) pada sosis fermentasi. Fakta Sel Mikroba
Karakterisasi strain Pediococcus acidilactici 18(1):188 26.
yang diisolasi dari rainbow trout (Oncorhynchus do Vale Pereira G, da Cunha DG, Pedreira
mykiss ) pakan dan larva: keamanan, sidik Mourino JL, Rodiles A, Jaramillo-Torres A,
jari DNA, dan bakteriosinogenisitas. Merrifield DL (2017) Karakterisasi mikrobiota
Dis Aquat Organ 119(2):129–143 pada usus Arapaima gigas dan isolasi
17. Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Ver probiotik potensial bakteri. J Appl Microbiol
straete W (2000) Bakteri probiotik sebagai 123(5):1298–1311 27. Alonso
agens pengendali hayati dalam akuakultur. S, Carmen Castro M, Berdasco M, de la Banda
Mikro biol Mol Biol Rev IG, Moreno-Ventas X, de Rojas AH (2019)
64(4):655–671 18. Balca'zar JL, De Blas I, Ruiz- Isolasi dan Karakterisasi Parsial Bakteri
Zarzuela I, Cunningham D, Vendrell D, Asam Laktat dari Usus Mikrobiota Ikan Laut
Mu'zquiz JL (2006) Peran probiotik dalam akuakultur. Potensial Aplikasinya Sebagai Probiotik
Vet Microbiol 114(3-4):173– Dalam Budidaya Perairan. Probiotik Anti
186 19. Patel P, Patel B, Amaresan N, Joshi B, mikroba Protein 11(2):569–579
Shah R, Krishnamurthy R (2020) Isolasi dan 28. Wanka KM, Damerau T, Costas B, Krueger
karakterisasi Lactococcus garvieae dari usus A, Schulz C, Wuertz S (2018) Isolasi dan
ikan untuk fermentasi in vitro dengan karakterisasi probiotik asli untuk budidaya
karbohidrat dari limbah agroindustri. ikan. BMC Microbiol 18(1):119
Biotechnol Rep (Amst) 28: e00555 29. Samson JS, Choresca CH Jr, Quiazon KMA
20. Tanaka D, Ohnishi KI, Watanabe S, Suzuki (2020) Seleksi dan penyaringan bakteri dari
S (2021) Isolasi Micro bulbifer sp penghasil nightcrawler Afrika, Eudrilus eugeniae
selulase. dari usus blackfish teleost laut (Gir (Kinberg, 1867) sebagai probiotik potensial
ella melanichthys) dan karakterisasi enzim. J dalam akuakultur. World J Microbiol
Gen Appl Microbiol 67(2): 47–53
Biotechnol 36(1):16 30. El-Jeni R, El Bour M,
21. Makridis P, Kokou F, Bournakas C, Calo-Mata P, Bo¨hme K, Fernańdez-No IC,
Papandroulakis N, Sarropoulou E (2021) Barros-Vela´zquez J, Bouhaouala-Zahar B
Isolasi Phaeobacter sp. dari Larva Atlantik ( 2016) Profil probiotik in vitro novel
Bonito (Sarda sarda) di Satuan Mesocosmos, Enterococcus faecium dan Leuconostoc
dan Penggunaannya untuk Pemeliharaan mesenteroides dari ikan air tawar Tunisia.
Larva Kakap Putih Eropa (Dicentrarchus lab Can J Microbiol 62(1):60–71 31. Pang Sing T,
rax L.). Mikroorganisme 9(1):128 Julian R, Hatai K (2019) Identifikasi, profil
pertumbuhan dan sifat probiotik bakteri usus asli sagor
lele (Hexanemathys sagor). Biocontrol Sci 35. Mora D, Fortina MG, Parini C, Daffonchio D,
24(1):1–11 32. Manachini PL (2000) Subpopulasi genomik
Masduki F, Jasmin MY, Min CC, Karim M (2020) dalam spesies Pediococcus acidilactici
Karakterisasi Enterococcus hirae yang diisolasi terdeteksi oleh analisis pengetikan multilokus:
dari Usus Kakap (Lates Calcarifer) sebagai hubungan antara strain penghasil dan non-
Probiotik Potensial Baru terhadap Vibrio penghasil pediocin AcH/PA-1.
Patogen. Curr Microbiol 77(12):3962–3968 33. Mikrobiologi 146(8):2027–2038
Majumdar RK, 36. Schillinger U, Yousif NM, Sesar L, Franz CM
Gupta S (2020) Isolasi, identifikasi dan karakterisasi (2003) Penggunaan analisis khusus kelompok
Staphylococ cus sp. dari produk fermentasi dan RAPD-PCR untuk diferensiasi cepat strain
ikan etnik India. Lett Appl Microbiol 71(4):359– Lactobacil lus dari yogurt probiotik. Curr Micro
368 34. Mortezaei F, Royan M, Allaf Noveirian biol 47(6):453–456
H, Babakhani A, Alaie Kordghashlaghi H, Balca´- 37. Liu XF, Li Y, Li JR, Cai LY, Li XX, Chen JR, Lyu
zar JL (2020) Penilaian in vitro potensi SX (2015) Isolasi dan karakterisasi Bacillus
karakteristik probiotik Lacto coccus lactis asli spp. antagonis terhadap Vibrio parahae
dan isolat Weissella oryzae dari rainbow trout molyticus untuk digunakan sebagai probiotik dalam budidaya.
(Oncorhynchus mykiss Wal baum). J Appl World J Microbiol Biotechnol 31(5):795–803
Microbiol 129(4):1004–1019
Bab 14
Isolasi Bakteri Probiotik dari Usus Perairan

Hewan
S. Vidhya Hindu dan John Thomas
Abstrak
Bakteri probiotik usus memiliki dampak yang konstan dan dinamis pada usus dan sistem kekebalan
tubuh inang bila dikonsumsi dalam proporsi yang memadai. Ketika mikroorganisme probiotik disediakan
dalam makanan fungsional, mereka dapat memberikan manfaat kesehatan. Probiotik dapat memberikan
manfaat kesehatan seperti modulasi sistem kekebalan tubuh dan sifat antibakteri, antikanker, dan
antimutagenik. Bakteri probiotik dapat diisolasi dan dikarakterisasi dari usus hewan air. Dalam bab ini,
kami membahas prosedur isolasi, identifikasi, dan efek antagonis bakteri usus sebagai efek probiotik.
Kata kunci Bakteri probiotik, Antibiotik, Akuakultur, Mikrobiota usus, Hewan akuatik
1. Perkenalan
Akuakultur telah berkembang selama beberapa dekade, meskipun

wabah sejumlah penyakit telah mengakibatkan kerugian ekonomi [1].
Kontribusi akuakultur untuk produksi protein hewani telah meroket,
dan sekarang menyumbang sekitar setengah dari semua ikan dan
kerang yang dikonsumsi secara global, menjadikannya produsen
makanan utama [2]. Wabah penyakit, terutama penyakit virus dan
bakteri, berdampak besar pada bisnis akuakultur dalam beberapa tahun terakhir.
Obat kimia dan antibiotik sangat berbahaya, dan dapat menyebabkan
mikroorganisme patogen yang resisten terhadap antibiotik [3]. Untuk
menyebabkan penyakit, banyak bakteri patogen memerlukan
perlekatan pada lapisan mukosa saluran cerna manusia. Persaingan
untuk situs penempelan, sering dikenal sebagai "pengecualian
kompetitif," adalah cara kerja utama dalam bakteri probiotik. Faktor
yang diinginkan dalam pemilihan probiotik adalah kemampuan bakteri
untuk mengkolonisasi usus dan menempel pada permukaan epitel,
sehingga mengganggu perlekatan patogen [4].
Probiotik adalah mikroorganisme menguntungkan yang dianggap
sebagai alternatif yang efektif dan ramah lingkungan
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_14,
99
100 S. Vidhya Hindu dan John Thomas
antibiotik [5]. Probiotik dapat menjadi pilihan yang baik untuk

meningkatkan produktivitas akuakultur secara berkelanjutan dalam
jangka panjang. Untuk keuntungan yang diinginkan dari aplikasi
probiotik, sangat penting untuk memilih strain dan dosis yang tepat
untuk setiap spesies akuakultur [6]. Probiotik tics adalah bakteri
menguntungkan hidup yang dimasukkan ke dalam saluran trointestinal
gas melalui makanan atau air, meningkatkan keseimbangan mikroba
internal dan meningkatkan kesehatan secara keseluruhan [7]. Dalam
akuakultur, bakteri yang berasal dari usus hewan air dan darat secara
rutin digunakan sebagai probiotik [8]. Bakteriosin, hidrogen peroksida,
siderofor, lisozim, dan protease hanyalah beberapa zat yang diproduksi
oleh bakteri probiotik yang memiliki efek bakterisidal atau bakteriostatik
pada populasi mikroba lainnya [9-11].
2 Bahan
2.1 Pengumpulan • Hewan air.

Sampel • Aerasi.
• Tangki.
• Termometer.
• pena pH.
• Timbangan
timbangan. • Pakan komersial untuk hewan air.
2.2 Isolasi dari • Kotak pembedahan.

Bakteri usus • Tricaine methanesulfonate (MS-222). •
Saline steril normal (NaCl 0,85% b/v). • Aliran
udara berlapis.
• Mortir dan alu. • Agar
kedelai triptik. • L-
batang.
• Inkubator.
• Lemari es. •
Pipet.
2.3 Efek Antagonis • Bakteri patogen. •

Bakteri Isolasi Strain yang diisolasi dari usus.
• Cawan petri.
• Kalorimeter.
• Piring agar Mueller Hinton.
Isolasi Bakteri Probiotik dari Usus Hewan Perairan 101
• Tongkat penyeka.
• Pipet. •
Inkubator.
• Aliran udara berlapis.
• Inkubator.
• Lemari es.
2.4 Identifikasi dari • Lihat manual laboratorium mikrobiologi standar untuk memeriksa
Bakteri Probiotik karakteristik morfologi dan biokimia.
• Manual Bakteriologi Sistematis Bergey.
2.4.1 Morfologi dan
Biokimia
Karakteristik
2.4.2 Molekul • Analisis urutan RNA ribosom (rRNA) 16S.

Identifikasi
3 Metode
3.1 Kumpulan dari • Kumpulkan hewan air yang sehat seperti ikan dan udang hidup
Sampel kondisi.
• Pindahkan hewan yang dikumpulkan dalam kondisi hidup ke laboratorium.

• Aklimatisasi hewan percobaan dalam kondisi diangin-anginkan selama 15
hari pada suhu optimum sebelum percobaan. • Beri makan hewan
percobaan dua kali sehari dengan pakan komersial.
3.2 Isolasi dari • Matikan tiga hewan sehat dengan merendamnya dalam tricaine
Bakteri Usus [12] methanesulfonate (MS-222). •
Bedah usus hewan dalam kondisi aseptik dan cuci tiga kali dengan salin
normal (NaCl 0,85% b/v). • Homogenkan usus dalam
mortar dan alu yang telah disterilkan permukaannya menggunakan 5 mL
saline steril (NaCl 0,85% b/v). • Kumpulkan sampel
homogenat dan lakukan pengenceran serial
(sepuluh kali lipat) menggunakan larutan garam steril.
• Pindahkan 0,1 mL sampel yang telah diencerkan dari setiap pengenceran

ke cawan agar tryptic soya dan ratakan di atas cawan agar menggunakan
L-rod.
• Inkubasi cawan pada suhu 37 °C selama 48

jam. • Setelah 48 jam, amati koloni pada cawan dan simpan cawan
dalam lemari es pada suhu 4 °C sampai digunakan lebih lanjut.
102 S. Vidhya Hindu dan John Thomas
3.3 Efek • Siapkan piring agar Mueller Hinton. • Ambil

Antagonis Terisolasi bakteri patogen yang Anda minati. • Usapkan 100
Bakteri [12] µL strain patogen (108 CFU/mL) pada pelat agar Mueller Hinton.
• Buat lubang berdiameter 7 mm di atas permukaan agar. •

Siapkan supernatan bebas sel dengan cara mensentrifugasi strain terisolasi
yang berbeda pada 8000 rpm selama 10
menit. • Isi sumur dengan 50 ÿL supernatan bebas sel dari strain terisolasi
yang berbeda.
• Biarkan strain di dalam sumur terserap seluruhnya. • Kemudian

inkubasi cawan pada suhu 37 °C selama 48 jam dengan posisi terbalik. •
Setelah 48 jam, amati zona inhibisi dari strain isolat yang berbeda terhadap
bakteri patogen yang diusap di atas cawan agar.
• Pilih strain yang menunjukkan zona inhibisi yang kuat terhadap patogen
untuk analisis lebih lanjut. • Strain
yang menunjukkan zona hambat terhadap bakteri patogen memiliki efek
probiotik.
3.4 Identifikasi dari • Lakukan semua karakterisasi awal seperti teknik pewarnaan dan uji
Bakteri Probiotik biokimia menggunakan prosedur standar untuk strain yang diisolasi
yang menunjukkan efek probiotik.
3.4.1 Morfologi dan
Karakteristik Biokimia • Campurkan hasil dengan menggunakan Bergey's Manual of Systematic
[13] Bacte riology, Eighth Edition, untuk menyesuaikan genus strain Anda.
3.4.2 Molekuler • Konfirmasi genus dari galur yang diisolasi menggunakan 16S rRNA
Identifikasi pengurutan.
Referensi
1. Martinez Cruz P, Ibanez AL, Monroy Hermo 5. Zorriehzahra MJ, Delshad ST, Adel M, Tiwari
sillo OA, Ramirez Saad HC (2012) Penggunaan R, Karthik K, Dhama K, Lazado CC (2016)
probiotik dalam akuakultur. Mikrobiol ISRN Probiotik sebagai mikroba bermanfaat dalam
2012:1–14 akuakultur: pembaruan tentang berbagai cara
2. Jahangiri L, Esteban MA´ (2018) Pemberian kerjanya: ulasan. Vet Q 36:228–241 6. Subedi
probiotik dalam air pada sistem budidaya ikan B, Shrestha A (2020) Ulasan: penerapan probiotik
bersirip: review. Aust Fish 3.33 3. Zhu F dalam akuakultur. Int J Untuk Ikan Anim Res
(2020) Review penerapan obat herbal dalam 4:52–60
pengendalian penyakit hewan air. Akuakultur 7. El-Saadony MT, Alagawany M, Patra AK, Kar
526:735422 4. Bermudez-Brito M, Plaza- I, Tiwari R, Dawood MA, Dhama K, Abdel-Latif
Diaz J, Munoz Quezada S, Gomez-Llorente C, HM (2021) Fungsi probiotik dalam akuakultur:
Gil A (2012) gambaran umum. Immunol Kerang Ikan 117:36–
Mekanisme aksi probiotik. Ann Nutr Metab 61:160–174 52
Isolasi Bakteri Probiotik dari Usus Hewan Perairan 103
8. Van Hai N, Fotedar R (2010) Review probiotik probiotik dalam rantai makanan larvakultur.
dalam budidaya udang. J Appl Aquac 22:251– Mar Biotechnol 10:1–12
266 9. Servin A 12. Vidhya Hindu S, Chandrasekaran N, Mukherjee
(2004) Aktivitas antagonis lac tobacilli dan A, Thomas J (2018) Pengaruh suplementasi
bifidobacteria terhadap mikroba patogen. mati bakteri probiotik baru Bacillus vireti 01
Microbiol Rev 28:405–440 10. Panigrahi pada sistem pertahanan antioksidan udang air
A, Azad IS (2007) Intervensi mikroba untuk tawar yang ditantang dengan Pseudomonas
kesehatan ikan yang lebih baik dalam aeruginosa. Probiotik Antimikro Prot 10:356–
akuakultur: skenario India. Fish Physiol 366 13. Manual
Biochem Bergey tentang bakteriologi sistematik (1974) edisi
33: 429–440
Tinh NTN,11.
Dierckens K, Sorgeloos P, Bossier ke-8. Springer, Cham
P (2007) Tinjauan fungsionalitas
Bab 15
Karakterisasi Sifat Probiotik Bakteri Terisolasi

Mahalakshmi S. Patil, Raghu Ram Achar , dan Ann Catherine Archer
Abstrak
Meningkatnya kebutuhan industri akuakultur menuntut langkah-langkah untuk meningkatkan produksi pangan secara aman
dengan mengendalikan kemunculan dan penyebaran penyakit ikan patogen yang menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar.
Probiotik adalah pendekatan alternatif untuk mengekang penggunaan bahan kimia berbahaya dan antibiotik yang membahayakan
kesehatan inang dan lingkungan. Namun, menurut definisi, organisme probiotik harus merupakan strain yang dapat hidup yang
secara menguntungkan mempengaruhi kesehatan inang, dan karenanya mikroorganisme yang disaring untuk aplikasi probiotik
harus memiliki sifat probiotik yang esensial. Food and Drug Administration (FDA) dan Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) telah
menyusun pedoman dan kriteria tertentu untuk karakterisasi organisme probiotik. Bab ini membahas beberapa kriteria penting
yang digunakan untuk mempelajari organisme mikro probiotik potensial in vitro dan metode yang diikuti untuk mengevaluasinya.
Kata kunci Bakteri probiotik, Hidrolase garam empedu, Mucus adhesion, Hidrofobik, Agregasi otomatis, Kerentanan
antibiotik, Aktivitas antimikroba
1. Perkenalan
Probiotik sebagai mikroorganisme hidup yang dapat bermanfaat bagi

kesehatan inang dalam jumlah yang tepat semakin banyak diterapkan sebagai
alternatif yang ramah untuk mencegah dan mengendalikan penyakit dalam akuakultur.
Probiotik telah menunjukkan efek positif dalam akuakultur termasuk
pengurangan beban penyakit, peningkatan kekebalan dan keseimbangan
kesehatan, peningkatan pertumbuhan dan kinerja, pemeliharaan fungsi usus
yang sehat, dan keseimbangan mikroba [1–3]. Tidak semua mikro organisme
komensal adalah probiotik. Mereka harus memenuhi kriteria tertentu untuk
disebut organisme probiotik. Kriteria ini termasuk yang berikut: organisme
harus aman bagi inang, tidak mengandung gen resistensi yang dapat
ditularkan, harus dapat berkolonisasi dan bereplikasi di dalam inang, harus
mentolerir kondisi fisiologis inang, dan harus menunjukkan efek kesehatan
yang menguntungkan. dalam sistem tuan rumah. Sebuah baterai uji in vitro
dilakukan untuk mengkarakterisasi sifat probiotik dari mikroorganisme diikuti
dengan keamanan in vivo dan
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_15,
105
Gambar 1 Skema umum pemilihan probiotik untuk akuakultur
pengujian kemanjuran [4-6]. Namun, pilihan tes dan metode pemilihan

probiotik bervariasi dalam laporan yang berbeda.
Metode skrining awal yang paling umum melibatkan uji
antimikroba/antagonisme karena memilih galur yang memiliki aktivitas
antagonis potensial adalah tujuan utama pencegahan dan pengendalian
penyakit pada ikan. Parameter lainnya meliputi hemolisis darah;
kerentanan anti biotik; uji kepatuhan seperti hidrofobisitas, agregasi
otomatis, dan adhesi musin; toleransi terhadap asam dan empedu; dll.
Tes-tes ini sering didahului dengan pengumpulan informasi latar
belakang inang dan lingkungannya, dan kumpulan kandidat probiotik
potensial yang diisolasi lebih disukai dari asal inang [7-9]. Skema
umum seleksi probiotik budidaya diberikan pada Gambar. 1. Meskipun
beberapa penelitian menyarankan penggunaan metode in vivo untuk
menyaring probiotik, bab ini akan dibatasi pada uji in vitro yang biasa
digunakan untuk mengkarakterisasi bakteri probiotik.
2 Bahan
2.1 Persiapan Komposisi media yang diperlukan untuk sebagian besar pengujian
Media seperti MRS, TSA, NA, LB, dll. disediakan di bab sebelumnya.
2.1.1 Mueller Hinton Bahan-bahan gram/liter

Agar
Ekstrak daging sapi 2.00
hidrolisat asam kasein 17.50
Pati 1,50
Agar 17.00
pH akhir (pada 25 °C) 7,3 ± 0,1

Karakterisasi Sifat Probiotik Bakteri Terisolasi 107
2.1.2 Agar Darah

Pepton 5.00
NaCl 5.00
Agar 15.00
Darah domba (5%) 50 mL
pH akhir (pada 25 °C) 7,2 ± 0,1
2.1.3 Agar Pepton–Gelatin

Pepton 5.00
Glukosa 1.00
agar-agar 15.00
Agar 15.00
pH akhir (pada 25 °C) 7,3 ± 0,1
2.1.4 Pati Agar

Pepton 5.00
Pati 1.00
Agar 15.00
pH akhir (pada 25 °C) 7,2 ± 0,1
2.1.5 Tributyrin Agar

Pepton 5.00
Ekstrak ragi 3.00
Agar 15.00
Tributirin (1%) 10,00 mL
pH akhir (pada 25 °C) 7,5 ± 0,1
2.1.6 Agar Karboksimetil

Selulosa
Pepton 10.00
karboksimetil selulosa 10.00
K2HPO4 2.00
(lanjutan)
MgSO4.7H2O 0,30
(NH4)2SO4 2.50
agar-agar 2.00
Agar 15.00
pH akhir (pada 25 °C) 6.8–7.2 ± 0.1
2.2 Bahan kimia dan Saline, PBS, HCl, natrium klorida (NaCl), indikator fenol merah, cakram antibiotik,
Reagen empedu (Ox-gall), hidrokarbon (n-hexadecane, xylene, chloroform, toluene, n-octane,
ethyl acetate), pepsin, pan creatin , asam taurodeoxycholic (TDCA), kalsium klorida
(CaCl2), kristal violet, buffer asetat, buffer sitrat, larutan benzalkonium klorida 0,1%,
larutan yodium Lugol, yodium Gram, 15% HgCl2.
3 Metodologi
3.1 Uji Keamanan Bakteri probiotik dikatakan organisme menguntungkan, dan karenanya salah satu
kriteria pemilihan probiotik adalah bahwa mereka harus aman dan tidak mengandung
faktor virulensi atau mengandung gen resistensi antibiotik yang dapat ditularkan.
3.1.1 Aktivitas Hemolitik Usus ikan mengandung beberapa patogen seperti Aeromonas yang memiliki gen virulensi
seperti aerolisin dan hemolisin yang mampu menghemolisis sel darah [10, 11]. Darah
manusia, darah domba, darah ikan, darah kuda, dll dapat digunakan untuk menguji
aktivitas hemolitik isolat [12, 13]. Bakteri probiotik tidak seperti patogen seharusnya
tidak memiliki aktivitas hemolitik.
1. Siapkan media kaya seperti agar darah yang dilengkapi dengan 5% darah domba
segar (paling umum, darah domba berada di garis depan untuk kegiatan ini,
sementara beberapa organisme membutuhkan darah kelinci atau sapi karena
aktivitas hemolitik tergantung pada jenis darah yang dipilih) .
2. Kulturkan isolat yang akan diuji dalam tabung reaksi steril.
3. Goreskan atau tempatkan satu ose penuh biakan yang tumbuh semalaman ke
piring agar darah domba dan inkubasi selama 24–48 jam pada suhu 37 °C [14, 15].
4. Pengamatan: Amati ada/tidaknya pembentukan zona di sekitar koloni untuk

menginterpretasikan aktivitas hemolisis.
5. Interpretasi hasil: Representasi aktivitas hemolitik adalah sebagai berikut (Gbr. 2):
Gbr. 2 Interpretasi hasil aktivitas hemolitik pada lempeng agar darah
ÿ-hemolisis—kehijauan hingga zona kecoklatan di sekitar

koloni ÿ-
hemolisis—tampak zona bening ÿ-hemolisis
—tidak tampak zona
3.1.2 Antibiotik Uji kepekaan antibiotik dilakukan untuk mengetahui sensitivitas atau resistensi
Tes Kerentanan bakteri probiotik potensial terhadap berbagai antibiotik. Metode difusi cakram
Kirby–Bauer adalah metode standar yang digunakan untuk melakukan pengujian
ini. Metode ini paling banyak digunakan dalam praktik, yang bergantung pada
pengukuran penghambatan pertumbuhan bakteri sesuai dengan instruksi yang
ditetapkan dari CLSI (Clinical and Laboratory Stan dards Institute) dan FDA
(Food and Drug Administration) [16] .
1. Tumbuhkan biakan uji dalam kaldu cair dalam tabung reaksi dan inkubasi
semalam.
2. Sebarkan biakan biakan semalaman pada agar Mueller Hinton (MHA) dengan
teknik swab (benamkan penyeka kapas steril dalam biakan biakan
semalaman dan sebarkan ke media MHA).
3. Siapkan antibiotik dengan konsentrasi yang sesuai dan rendam ke dalam
cakram bundar kecil yang dipotong di kertas Whatman.
Sebagai alternatif, Anda dapat menggunakan cakram antibiotik siap pakai
yang tersedia dari HiMedia Laboratories (Mumbai).
4. Tempatkan cakram berisi antibiotik pada agar (berhati-hatilah untuk mengambil
cakram antibiotik dengan forsep steril, dan tempatkan dengan jarak 2 cm
satu sama lain untuk menghindari pertempuran zona).
5. Tekan perlahan cakram dengan forsep untuk memastikan cakram tetap berada di tempatnya
di tempat.
6. Inkubasi cawan selama 16–18 jam pada suhu 25–30 °C.
Gambar 3 Hasil interpretasi kepekaan antibiotik dengan metode difusi cakram
7. Pengamatan: Amati pembentukan zona hambat di sekitar cakram.

Diameter zona menunjukkan kerentanan kultur terhadap masing-masing
antibiotik [17, 18].
8. Ukur zona inhibisi dalam mm dan bandingkan diameter zona dengan tabel
kerentanan dengan persetujuan dari Food and Drug Administration (FDA)
dan Clinical and Laboratory Stan dards Institute (CLSI).
9. Interpretasi hasil uji difusi cakram (Gbr. 3): Sensitif—dapat

diobati dengan dosis normal Menengah—
dapat merespons dosis yang lebih tinggi Tahan—tidak
mungkin merespons dosis biasa
3.2 Probiotik Aktivitas antimikroba adalah properti probiotik penting untuk aplikasi dalam
Properti budidaya karena tujuan utamanya adalah untuk mencegah dan mengendalikan
penyakit pada ikan dengan menghambat patogen [3, 5]. Oleh karena itu, sifat
3.2.1 Antimikroba
ini adalah metode pertama dan paling umum digunakan untuk
Aktivitas mengkarakterisasi bakteri probiotik potensial dan sering juga digunakan
sebagai tes untuk menyaring bakteri yang memiliki aktivitas antagonis.
Beberapa metode seperti tes titik di rumput, lapisan agar ganda, dan difusi
sumur agar digunakan [19, 20]. Uji difusi sumur menjadi metode yang banyak
digunakan dijelaskan dalam bab ini. Metode lain dan karakterisasi lebih lanjut
dari aktivitas antimikroba dibahas secara rinci dalam bab berikut.
1. Inokulasi biakan uji dalam kaldu yang sesuai dan inkubasi selama 24 jam.
Demikian pula, tumbuhkan kultur patogen (bakteri indikator) dalam kaldu
BHI dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam.
2. Kumpulkan supernatan bebas sel (CFS) dari kultur uji dengan cen
trifuging pada 8000 rpm selama 10 menit dan saring CFS melalui filter
0,22 ÿm.
3. Usap bakteri indikator pada agar Mueller Hinton atau BHI
piring.
4. Bor sumur di setiap pelat dan tambahkan CFS di masing-masing sumur

berlabel. Inkubasi cawan pada suhu 37 °C selama 24 jam.
5. Amati zona hambat bening di sekitar sumur dan ukur diameter zona hambat
tersebut untuk mengetahui aktivitas hambat [21, 22].
3.2.2 Toleransi terhadap GIT Usus ikan terdiri dari lingkungan yang keras dengan adanya enzim pencernaan,
Kondisi garam empedu, dan variasi pH. Bertahan dari kondisi keras GIT merupakan
kriteria penting untuk pemilihan probiotik karena memastikan bahwa bakteri
Toleransi Asam melewati lingkungan yang keras dan berkoloni di GIT untuk memberikan efek
yang menguntungkan [23, 24]. Dengan demikian, memperoleh isolat dari asal
inang dianggap penting karena isolat ini menunjukkan toleransi terhadap kondisi
GIT inang. Bakteri probiotik harus mentolerir pH hingga 2 dan konsentrasi garam
empedu hingga 1% [25]. Toleransi terhadap konsentrasi asam dan empedu dalam
kaldu digunakan sebagai kriteria seleksi awal diikuti dengan penilaian kemampuan
bertahan hidup dalam simulasi cairan GIT.
1. Siapkan media kaldu sesuai pilihan organisme (MRS untuk BAL dan TSB
atau LB untuk organisme lain).
2. Sesuaikan pH kaldu menjadi pH 2 dan pH 3 masing-masing dengan HCl 0,1
N menggunakan pH meter. Pertahankan kaldu dengan pH netral sebagai
kontrol pertumbuhan.
3. Tambahkan kaldu yang telah disesuaikan pH-nya ke dalam tabung reaksi dan autoklaf.
4. Inokulasikan tabung steril dengan kultur semalaman (5%) dan inkubasi pada
suhu yang sesuai.
5. Gambar alikuot secara berkala (0, 1, 2, 3 jam) dan dapatkan jumlah lempeng
dengan pengenceran dan pelapisan berurutan.
6. Catat persentase kelangsungan hidup bakteri hidup dan hitung dengan
menggunakan rumus berikut:
CFU1
Kelangsungan hidup ð Þ % = × 100
CFU0
dimana CFU1 adalah jumlah bakteri dalam sampel uji dan CFU0 adalah
jumlah dalam tabung kontrol [18, 26].
Toleransi Empedu 1. Siapkan kaldu yang sesuai ditambah dengan 0,3% dan 1% empedu sapi,
masing-masing, dalam tabung reaksi dan autoklaf.
2. Inokulasikan tabung dengan kultur semalaman (5%) dan inkubasi pada suhu
yang sesuai.
3. Gambarkan alikuot secara berkala (0, 1, 2, 3 jam) dan dapatkan jumlah
lempeng dengan pengenceran dan pelapisan berurutan.
4. Hitung persentase kelangsungan hidup seperti yang dijelaskan pada Subjudul
3.2.2 [18, 26].
Toleransi terhadap Simulasi 1. Siapkan cairan lambung simulasi dengan melarutkan 1000 U/mL pepsin dan
Cairan Gastrointestinal 0,01 g/L lisozim dalam dapar steril yang mengandung natrium klorida (2,05 g/
L), dihidrogen kalium fosfat (0,60 g/L), kalsium klorida (0,11 g/ L), dan kalium
chlo ride (0,37 g/L). Sesuaikan pH menjadi 3 dengan 1 M HCl [27].
2. Siapkan simulasi cairan usus dengan melarutkan 3 g/L garam empedu dan
1000 U/mL trypsin dalam buffer yang mengandung 50,81 g/L dinatrium
hidrogen fosfat, 8,5 g/L natrium klorida, dan 1,27 g/L dihidrogen kalium fosfat .
3. Ambil biakan uji semalaman dan panen sel dengan cara disentrifugasi pada
8000 rpm selama 10 menit. Cuci sel dua kali dalam PBS dan resuspensi
dalam jus lambung simulasi (5%). Inkubasi pada suhu yang sesuai.
4. Dapatkan jumlah pelat secara berkala seperti yang dijelaskan pada Sub pos
3.2.2.
5. Panen sel-sel dari jus lambung yang disimulasikan dan resuspensi dalam jus
usus yang disimulasikan. Dapatkan jumlah pelat pada interval reguler yang
sama seperti di Subpos 3.2.2.
6. Hitung persentase kelangsungan hidup seperti yang dijelaskan sebelumnya
pada Sub pos 3.2.2.
3.2.3 Pengujian Bile Salt Hidrolase garam empedu adalah uji presipitasi lempeng yang diperiksa dengan
Hydrolase (BSH). analisis kualitatif.
1. Tuangkan media agar steril (MRS/TSA/LB) yang sesuai yang telah dilarutkan
dengan 0,5% asam taurodeoksikolat (TDCA) dan 0,037% kalsium klorida
(CaCl2) ke dalam cawan Petri steril dan biarkan memadat.
2. Luruskan biakan uji yang tumbuh semalaman pada permukaan agar dan
inkubasi pada suhu yang sesuai selama 24-72 jam.
3. Pengamatan: Zona presipitasi putih di sekitar koloni menunjukkan aktivitas
BSH [28].
3.2.4 Uji Adhesi Adhesi bakteri probiotik potensial ke GIT inang merupakan prasyarat untuk seleksi
probiotik [29]. Beberapa tes adhesi in vitro digunakan untuk menilai kemampuan
adhesi isolat potensial.
Tes sederhana seperti hidrofobisitas, agregasi otomatis, dan koagregasi memberikan
ide awal isolat untuk menempel pada sel dari spesies yang sama dan spesies lain
atau adhesi kompetitif dengan patogen. Pengujian ini sering dilakukan dengan
menggunakan media kaldu atau pelarut buffer. Di sisi lain, substrat seperti lendir
usus dari ikan, sel epitel, dan garis sel juga digunakan untuk menunjukkan kapasitas
adhesi dari isolat [30-32].
Hidrofobisitas Permukaan Sel Metode analisis in vitro ini dilakukan untuk mengukur adhesi menggunakan metode
Pengujian kadar logam adhesi mikroba ke hidrokarbon (MATH) [25, 33].
1. Ambil biakan uji yang ditumbuhkan semalaman dan sentrifus pada 8000 rpm selama
10 menit pada suhu 4 °C untuk mendapatkan pelet sel.
2. Cuci pelet sel dua kali dengan buffer PUM (phosphate urea magne sium) dan
resuspensi dalam buffer PUM untuk mendapatkan suspensi sel yang seragam.
3. Sesuaikan kerapatan optik awal (OD) pada 600 nm menjadi 0,7.

4. Ambil suspensi sel dan hidrokarbon (n-heksadekana, xilena, atau toluena)
dengan perbandingan 3:1.
5. Vortex sampel dengan baik dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam untuk fase
pemisahan.
6. Hati-hati ambil fase berair dan baca OD akhir di
600 nm.
7. Hitung persentase hidrofobisitas permukaan sel menggunakan

rumus berikut:
A0 - A1
ðÞ
× 100
Hidrofobisitas permukaan sel ð Þ % =
A0
di mana A0 menunjukkan kerapatan optik awal dan A1 menunjukkan
kerapatan optik akhir.
Agregasi otomatis 1. Panen kultur semalaman dengan sentrifugasi, cuci dua kali dalam PBS, dan
suspensikan kembali dalam PBS untuk mendapatkan suspensi sel seragam
yang disesuaikan dengan OD 600 nm 0,6.
2. Aduk sebentar suspensi sel dan inkubasi pada waktu yang tepat
temperatur selama 24 jam.
3. Lakukan pembacaan secara berkala (0, 2, 4, 6, dan 24 jam)
[22, 26].
4. Hitung persentase agregasi otomatis menggunakan yang berikut ini

rumus:
A1 × 100
Agregasi otomatis ð Þ % = 1-
A0
dimana A0 = absorbansi awal dan A1 = absorbansi akhir.
Co-agregasi 1. Kultur biakan uji dalam media dan patogen yang sesuai
budaya dalam kaldu BHI.
2. Panen kultur yang ditanam dalam semalam seperti yang disebutkan dalam
prosedur agregasi otomatis.
3. Campurkan biakan uji dan biakan patogen dengan volume yang sama dalam
tabung reaksi dan inkubasi pada suhu ruang selama 4 jam.
4. Simpan tabung yang berisi suspensi sel dari setiap biakan secara
terpisah sebagai kontrol.
5. Baca absorbansi kultur campuran dan monokultur pada
600 nm.
6. Hitung persentase koagregasi menggunakan berikut ini
rumus:
Co-agregasi% =
Di þ Ap - 2Amix × 100
" Di þ Ap #
dimana At dan Ap masing-masing adalah absorbansi kultur uji

dan suspensi patogen gen, sedangkan Amix adalah absorbansi
suspensi campuran bakteri setelah inkubasi [27].
Uji Adhesi Sel In Vitro (a) Persiapan Lendir [24]

1. Kumpulkan ikan yang dipanen dan disinfeksi dengan benzalko 0,1%.
larutan nium klorida.
2. Bedah dengan pisau bedah dan keluarkan hindgut.
3. Bilas permukaan dalam hindgut dengan PBS (pH 7,2)
dan kikis dengan spatula karet.
4. Sentrifuge kerokan dua kali pada 6000 rpm selama 30 menit pada
suhu 4 °C untuk menghilangkan bahan partikulat dan kotoran.
5. Saring sediaan melalui filter jarum suntik 0,22 ÿm.
6. Tentukan konsentrasi mukus dengan metode Bradford
dan atur konsentrasi protein menjadi 0,5 atau 1 mg/mL.
Simpan pada -70 °C hingga digunakan lebih
lanjut. (b) Adhesi pada Lendir [24, 33]
1. Ambil piring mikrotiter 96 lubang dan lapisi dengan 100 ÿL
lendir. Inkubasi cawan semalaman untuk adhesi mukus
pada suhu 4 °C.
2. Ambil biakan uji tumbuh semalaman dan sesuaikan selnya
kerapatan menjadi 1 × 108 sel/mL (A0).
3. Tambahkan 100 µL kultur uji ke dalam mukus yang telah dilumpuhkan
dan inkubasi pada suhu 37 °C atau suhu yang sesuai selama 1 jam.
4. Cuci sumur dengan PBS untuk menghilangkan sel-sel yang tidak melekat.
5. Perbaiki sel yang menempel pada suhu 60 °C selama 20 menit dan warnai
dengan 100 ÿL crystal violet (larutan 0,1%) selama 15 menit.
6. Cuci sumur dengan PBS untuk menghilangkan noda berlebih.
7. Rawat sel dengan 100 ÿL 20 mM asetat atau penyangga

sitrat (pH 4,3) untuk melepaskan noda yang terikat pada sel.
8. Ukur absorbansi pada 600 nm (A1) dalam pembaca
pelat mikrotiter.
9. Pertahankan lendir bernoda tanpa ditambahkan bakteri sebagai

kontrol negatif (Acontrol).
10. Hitung persentase sel bakteri yang melekat dengan menggunakan
rumus berikut:
Adhesi% = A1 - × 100 Kontrol

A0
3.2.5 Produksi dari 1. Untuk menguji produksi proteinase, inokulasi pelat agar pepton-gelatin
Enzim ekstraseluler dengan biakan uji dan inkubasi pada suhu yang sesuai selama 48 jam.
Banjir piring dengan 15% HgCl2. Zona bening di sekitar koloni
menunjukkan reaksi positif untuk proteinase.
2. Untuk menguji produksi amilase, inokulasi pelat agar pati (1%) dengan
biakan uji dan inkubasi selama 24 jam pada suhu yang sesuai dan
kemudian banjir dengan larutan iodin Lugol. Perubahan warna kuning
keputihan pada pelat merupakan indikasi aktivitas amilase.
3. Untuk menguji produksi enzim lipolitik, inokulasi biakan uji ke dalam agar
tributyrin (1%). Zona buram keputihan di sekitar koloni kultur uji
menunjukkan aktivitas lipase.
4. Untuk menentukan produksi selulosa, inokulasi biakan uji ke piring agar
karboksimetil selulosa selama 48 jam pada suhu yang sesuai. Banjir
piring dengan larutan yodium Gram.
Kehadiran penampilan keputihan di sekitar koloni merupakan indikasi
produksi selulosa [33, 34].
Terima kasih
Para penulis ingin mengucapkan terima kasih yang tulus kepada otoritas di
JSS Academy of Higher Education & Research, Mysuru, untuk memberikan
dukungan dan fasilitas yang diperlukan. ACA berterima kasih kepada DBT
Wellcome Trust India Alliance atas hibah Early Career Fellowship (IA/E/
20/1/505689). MSP mengakui dukungan Pemerintah Karnataka. untuk hibah
beasiswa OBC (OBC-10/PhD/CR-04/2021-22).
Referensi
1. Amoah K, Huang QC, Tan BP, Zhang S, Chi probiotik terhadap daya tahan tubuh udang
SY, Yang QH, Liu HY, Dong XH (2019) galah Macrobrachium rosenbergii.
Suplementasi mati probiotik Bacillus coa Aquac Res 50(2):644–657
gulans ATCC 7050, meningkatkan kinerja 3. El-Saadony MT, Alagawany M, Patra AK, Kar I,
pertumbuhan, morfologi usus, flora mikro, Tiwari R, Dawood MA, Dhama K, Abdel-Latif
respon imun, dan konfrontasi penyakit udang HM (2021) Fungsi probiotik dalam akuakultur:
vaname Pasifik, Litopenaeus vannamei. Imunol gambaran umum. Fish Shellfish Immunol
Kerang Ikan 87:796– 808 117:36–52 4. Balca'zar JL, De
Blas I, Ruiz-Zarzuela I, Cunningham D, Vendrell
2. Azad MAK, Islam SS, Sithi IN, Ghosh AK, Banu D, Mu'zquiz JL
GR, Bir J, Huq KA (2019) Pengaruh
(2006) Peran probiotik dalam akuakultur. untuk bakteriologi umum, American Society for
Vet Microbiol 114(3–4):173–186 Microbiology, Washington, DC, pp 409–444
5. Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Ver 15. Buxton R (2005) Pelat agar darah dan protokol
straete W (2000) Bakteri probiotik sebagai lisis hemo. American Society for Microbi
agen pengendali hayati dalam akuakultur. ology, Washington, DC, pp 1–9
Microbiol Mol Biol Rev 64(4):655–671 16. EFSA Panel on Additives and Products or
6. Kumari VBC, Huligere SS, Ramu R, Naik Bajpe Substances used in Animal Feed (FEEDAP) (2012)
S, Sreenivasa MY, Silina E, Stupin V, Achar Pedoman penilaian kerentanan bakteri
RR (2022) Evaluasi Atribut Probiotik dan terhadap antimikroba yang penting bagi
Antidiabetes Strain Lactobacillus Diisolasi Dari manusia dan hewan. EFSA J 10(6):2740
Bit Fermentasi. Front Microbiol 13:911243 7. 17. AlKalbani NS, Turner MS, Ayyash MM (2019)
Chemlal-Kherraz D, Isolasi, identifikasi, dan karakterisasi probiotik
Sahnouni F, Matallah Boutiba A, Boutiba Z potensial dari bakteri asam laktat yang
(2012) Potensi probiotik lactobacilli diisolasi diisolasi dan investigasi in vitro aktivitas
dari usus Nil tila pia (Oreochromis niloticus). sitotoksisitas, antioksidan, dan antidiabetes
Afr J Biotechnol 11(68):13220–13227 8. Balca pada sosis fermentasi. Pabrik Sel Mikroba
´zar JL, Vendrell D, de Blas I, 18(1):1–12 18. Patel
Ruiz Zarzuela I, Muzquiz JL, Girones O (2008) P, Patel B, Amaresan N, Joshi B, Shah R,
Krishnamurthy R (2020) Isolasi dan
Karakterisasi sifat probiotik bakteri asam karakterisasi Lactococcus garvieae dari usus
laktat yang diisolasi dari biota mikro usus ikan untuk fermentasi in vitro dengan
ikan. Akuakultur 278(1–4):188–191 9. Munõz- karbohidrat berasal dari limbah agroindustri.
Atienza E, Go´mez-Sala B, Arau´jo C, Campanero Biotechnol Rep
C, Del Campo R, Hernańdez PE, Herranz C, 28:e00555 19. Ringø E, Schillinger U, Holzapfel W (2005)
Cintas LM ( 2013) Aktivitas antimikroba, Aktivitas antimikroba bakteri asam laktat
kerentanan antibiotik, dan faktor virulensi diisolasi dari hewan air dan penggunaan bakteri
bakteri asam laktat asal air yang dimaksudkan asam laktat dalam akuakultur. Dalam: Biologi
untuk digunakan sebagai probiotik dalam akuakultur. hewan tumbuh, vol 2. Elsevier, Amster dam,
BMC Microbiol 13(1):1–22 pp 418–453 20.
10. Abdel-Latif HM, Khafaga AF (2020) Koinfeksi Deodware SA, Barache UB, Dhale PC, Gaik wad
alami ikan nila Oreochro mis niloticus dengan KD, Shivamallu C, Ubale PA, Shati AA, Alfaifi
Aeromonas hydrophila dan Gyrodactylus MY, Elbehairi SEI, Achar RR, Silina E, Stupin
cichlidarum mengalami kematian tinggi selama V, Frau J, Flores-Holguÿń N, Gaikwad SH,
musim panas. Aquac Res 51(5): 1880–1892 Kollur SP, Glossman-Mitnik D (2022) Skrining
11. El-Son antikanker in vitro, penambatan molekuler dan
MA, Nofal MI, Abdel-Latif HM (2021) studi antimikroba dari logam Nikel (II) berbasis
Ko-infeksi Aeromonas hydrophila dan Vib rio triazol kompleks. Molekul 27 (19):6548 21.
parahaemolyticus yang diisolasi dari belang Ringø E,
belang (Mugil cephalus) yang sakit di Man Løvmo L, Kristiansen M, Bakken Y, Salinas I,
zala, Mesir – sebuah laporan kasus. Akuakultur Myklebust R, Olsen RE, Mayhew TM (2010)
530: 735738 Bakteri asam laktat vs. patogen pada saluran
12. Cota-Gaste'lum LA, Luna-Gonza'lez A, pencernaan ikan: tinjauan . Aquac Res
Gonzalez-Ocampo HA, del Carmen Flores 41(4):451–467 22.
Mir M, Fierro-Coronado JA, Escamilla Montes Govindaraj K, Samayanpaulraj V, Narayanadoss
R, Peraza-Go'mez V (2013) Pengaruh V, Uthandakalaipandian R (2021) Isolasi bakteri
Pediococcus sp. , Pediococcus pentosaceus, asam laktat dari usus ikan air tawar dan
inulin dan asam fulvat, ditambahkan ke dalam penjelasan potensi probiotik untuk aplikasi
makanan, pada pertumbuhan Oreochromis akuakultur. Protein Antimikroba Probiotik
niloticus. Afr J 13(6): 1598–1610 23. Hlophe SN, Moyo NAG,
Microbiol Res 7(48):5489–5495 13. Nayak SK, Ncube I
Mukherjee SC (2011) Skrining bakteri (2014)
gastrointestinal ikan karper utama India untuk Perubahan postprandial pada pH dan aktivitas
kandidat spesies probiotik untuk praktik enzim dari perut dan usus Tilapia rendalli
akuakultur. Aquac Res 42(7):1034–1041 14. (Boulenger, 1897), Oreochromis mos sambicus
Smibert RM, Krieg NR (1981) Karakterisasi (Peters, 1852) dan Clarias gariepinus (Burchell,
umum. Dalam: Gerdhardt P, Murray RGE, 1822). J Appl Ichthyol 30(1):35–41
Costilow RN, Nester EW, Wood WA, Krieg NR, Phillips GB (Eds.) Manual metode
24. Geraylou Z, Vanhove MP, Souffreau C, Rurangwa E, 29. Ringø E, Gatesoupe FJ (1998) Bakteri asam laktat
Buyse J, Ollevier F (2014) Seleksi in vitro dan pada ikan: review. Akuakultur 160(3–4): 177–203
karakterisasi probiotik diduga diisolasi dari usus
Acipenser baerii (Brandt, 1869). Aquac Res 45(2): 30. Abdulla AA, Abed TA, Saeed AM (2014)
341–352 25. Archer AC, Halami PM (2015) Atribut Adhesi, autoagregasi, dan kota hidrofobik dari
probiotik
enam strain Lactobacillus. Br Microbiol Res J
Lactobacillus fermentum diisolasi dari kotoran manusia 4(4):381–391 31.
dan produk susu. Appl Micro biol Biotechnol Lazado CC, Caipang CMA, Brinchmann MF, Kiron V
99(19):8113–8123 26. Samson JS, Choresca CH, (2011) Kepatuhan in vitro dua probiotik dari cod
Quiazon KMA (2020) Seleksi dan Atlantik dan interferensinya dengan adhesi dua
penyaringan bakteri dari nightcrawler Afrika, Eudrilus bakteri patogen . Vet Microbiol 148(2–4): 252–259
eugeniae (Kinberg, 1867) sebagai probiotik potensial 32. Bellon-Fontaine MN, Rault J, Van Oss CJ (1996)
dalam akuakultur. World J Microbiol Biotechnol Adhesi
36(1):1–10 27. Kaktcham PM, Temgoua JB, Zambou mikroba pada pelarut: metode baru untuk menentukan
FN, Diaz-Ruiz G, Wacher C, Pe´rez-Chabela MDL donor elektron/akseptor elektron atau asam-basa
(2018) Lewis sifat sel mikroba. Colloids Surf B: Biointerfaces
Evaluasi in vitro sifat probiotik dan keamanan dari bakteri 7(1–2):47–53 33. Khan MIR, Choudhury TG, Kamilya
asam laktat bakteriosinogenik dan non- D, Mon sang SJ, Parhi J (2021) Karakterisasi
bakteriosinogenik dari usus ikan nila dan ikan mas Bacillus spp. diisolasi dari usus
untuk digunakan sebagai probiotik dalam budidaya. Labeo rohita—untuk mengidentifikasi pro biotik baru
untuk akuakultur. Aquac Res 52(2): 822–830
Probiotik Antimikrob Protein 10(1):98–109 28. Gil-

Rodrÿ´guez AM, Beresford T (2021) Hidrolase garam
empedu dan aktivitas penghambatan lipase dalam 34. Banerjee S, Ghosh K (2014) Penghitungan ragi
susu skim yang dilarutkan yang difermentasi dengan
penghasil enzim ekstraseluler terkait usus pada
bakteri asam laktat. Makanan Fungsi J 77:104342 beberapa ikan air tawar. J Appl Ichthyol 30(5):986–
993
Bab 16
Aktivitas Antibakteri Bakteri Probiotik

dari Akuakultur
Mahalakshmi S. Patil, Anagha Sudhama Jahgirdar,
, Raghu Ram Achar
Ann Catherine Archer dan
Abstrak
Dengan permintaan yang sangat besar untuk agen antibakteri di seluruh dunia karena perkembangan
resistensi terhadap antibiotik yang ada, probiotik menjadi lebih unggul. Hal ini bahkan meluas ke produksi
akuakultur dan telah dianggap sebagai kendala utama. Sebagai alternatif agen antimikroba, penggunaan
bakteri probiotik dalam budidaya telah mendapatkan banyak perhatian. Bab ini menjelaskan secara rinci
protokol yang harus diikuti untuk demonstrasi dan karakterisasi aktivitas antibakteri probiotik yang efektif
dalam penelitian ini. Protokol yang harus diikuti, yaitu persiapan dan pemrosesan sampel serta
demonstrasi aktivitas antibakteri dan bakteriosin, dengan penekanan pada pemurnian dan karakterisasi
bakteriosin, telah ditunjukkan.
Kata kunci Antibakteri, Probiotik, Bakteri probiotik, Ikan, Budidaya, Bakteriosin
1. Perkenalan
Agen antimikroba mengacu pada zat apa pun yang dapat menghambat
pertumbuhan mikroorganisme atau membunuhnya. Industri akuakultur
telah mengalami pertumbuhan yang luar biasa dalam beberapa tahun
terakhir karena meningkatnya permintaan akan makanan akuatik secara
global. Namun, produksi ikan melibatkan tantangan yang signifikan
termasuk produksi, pencegahan pembusukan, dan pengendalian penyakit
[1, 2]. Karena peningkatan produksi, terjadi peningkatan penyakit bakteri
dan virus pada ikan. Antibiotik digunakan secara luas sebagai agen
profilaksis dan terapeutik untuk mengendalikan penyakit, tetapi mereka
terkait dengan munculnya resistensi antibiotik pada bakteri patogen dan
akibatnya pada penyebaran resistensi antibiotik dalam rantai makanan
[3, 4 ] . Hal ini telah mendorong perlunya alternatif baru dan aman untuk senyawa antim
Di antaranya, bakteri probiotik dikatakan mikroorganisme menguntungkan
yang mampu menghambat bakteri patogen melalui berbagai mekanisme
seperti modulasi mikrobiota usus, kompetitif
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_16,
119
eksklusi, dan modulasi sistem kekebalan tubuh [1]. Probiotik juga

mengeluarkan senyawa dengan potensi antimikroba seperti enzim,
bakteriosin, asam organik, dan hidrogen peroksida [5, 6].
Bakteri asam laktat (BAL) adalah salah satu kelompok umum
mikroorganisme yang telah ditemukan memiliki ikatan probiotik yang
tepat karena sejarahnya yang panjang dan aman dalam fermentasi
makanan dan keberadaannya sebagai flora alami di saluran pencernaan
manusia, mamalia, dan bahkan ikan. [1, 7, 8]. LAB sebagai probiotik
telah ditemukan untuk mengurangi penyakit air yang disebabkan oleh
patogen seperti Aero monas salmonicida dan Vibrio anguillarum dan
meningkatkan kesehatan ikan secara keseluruhan [5, 9, 10]. Dengan
demikian, BAL menjadi sumber penting bakteri probiotik dan zat
antimikroba untuk secara efektif mencegah dan mengendalikan penyakit
bakteri pada ikan [11, 12]. Beberapa teknik telah digunakan untuk
menyelidiki aktivitas antagonis atau anti mikroba BAL probiotik [13].
Beberapa metode yang tepat termasuk uji kualitatif aksi antimikroba
untuk mendeteksi keberadaan, pemurnian, dan karakterisasi bakteriosin
telah diuraikan dalam bab ini.
2 Bahan
Strain Bakteri dan Pertumbuhan

BAL ditumbuhkan pada media DeMan Rogosa Sharpe (MRS) (komposisi
pada Tabel 1). Organisme patogen yang digunakan sebagai strain
indikator aktivitas antibakteri ditumbuhkan dalam media tryptic soy (TS)
atau brain heart infusion (BHI) (komposisi pada Tabel 2 dan 3). Strain
indikator yang menyebabkan penyakit pada ikan tercantum pada Tabel
4. Strain yang dipilih dari daftar dapat digunakan untuk studi antibakteri.
Pemurnian dan Karakterisasi

Ammonium sulfat, acetonitrile, trifluoroacetic acid, tricine, sodium dodecyl
sulfate, acrylamide, N,Nÿ-methylenebisacrylamide, ammonium persulfate,
tetramethylethylenediamine, Coomassie brilliant blue R-250, silver nitrate,
formaldehyde, ethanol, acetic acid, CM Sepharose /SP Sepharose, CM
Sephadex G50/75/100, kolom fase balik C18.
3 Metodologi
3.1 1. Kumpulkan ikan air tawar atau air laut dari sumber setempat.
Pengumpulan
2. Timbang ikan dan buang ususnya secara aseptik, masukkan
dan Pemrosesan Sampel es, dan transportasi ke laboratorium.
3. Homogenkan usus ikan dan isinya dalam 10 mL phosphate-buffered
saline.
Aktivitas Antibakteri Bakteri Probiotik dari Akuakultur 121
Tabel 1
Komposisi media MRS
Pepton 10
Ekstrak daging sapi 10
Ekstrak ragi 5
Dekstrosa 20
Polisorbat 80 1
Amonium sitrat 2
Natrium asetat 5
Magnesium sulfat 0,1
Mangan sulfat 0,05
Dikalium fosfat 2
Agar 12
pH 6.5
Meja 2
Komposisi media kedelai tryptic
Pankreas mencerna kasein 15
Pencernaan peptik dari bungkil kedelai 5
Natrium klorida 5
Agar 15
pH 7.3
Tabel 3
Komposisi media infus jantung otak
Serbuk infus HM 12.5
bubuk BHI 5
Pepton 10
Dekstrosa 2
Natrium klorida 5
Dinatrium hidrogen fosfat 2.5
Agar 15
pH 7.4
Tabel 4
Bakteri umum patogen ikan yang dapat digunakan sebagai galur indikator aktivitas antibakteri
Spesies
patogen Tuan rumah Penyakit yang disebabkan
spesies gram negatif
Aeromonas Trout, ikan mas, salmon, koi, dan ikan Furunkulosis

hidrofila lainnya
Aeromonas Trout, ikan mas, salmon, koi, dan ikan Furunkulosis

salmonicida lainnya
Aeromonas Lele, nila, bass bergaris, septikemia aeromonas motil (MAS),

veronii spesies sturgeon, belut, salmonid, septikemia hemoragik, sindrom ulseratif epizootik
dan non-salmonid (EUS), penyakit luka merah
Pseudomonas Belut, turbot, sea bream, ayu Pseudomonadiasis, penyakit musim dingin
anguilliseptica
Yersinia ruckeri Salmonida, sturgeon, krustasea, belut, ikan Mulut merah enterik
kecil
Piscirickettsia Salmonida Piscirickettsiosis

salmonis
Edwardsiella Lele dan nila Septikemia enterik

ictaluri
Edwardsiella Nila, lele, salmon, karper, Edwardsiellosis

tarda yellowtail, flounder, kuningan bergaris
Pasteurella Salmonid dan turbot Pasteurellosis

skyensis
Vibrio Turbot, salmon, bass bergaris, bass laut, Vibriosis

anguillarum belut, cod, ayu, red sea bream
Aliivibrio Cod, salmon Atlantik Vibriosis

salmonicida
Vibrio vulnificus Tilapia, belut Vibriosis
Vibrio ordalii Salmonida Vibriosis
Vibrio harveyi Abalone, hiu, sea bream, red drum, cobia, Vibriosis
sea bass, flounder
Photobacterium Ikan bass, ikan air tawar, ikan bass Fotobakteriosis

damselae bergaris, ekor kuning, sol
Flavobacterium Ikan mas, salmon, belut, hinggap, ayu penyakit air dingin
psychrophilum
Flavobacterium Air dingin dan air hangat Penyakit insang bakteri

branchiophila spesies salmonid dan non-
salmonid
Flavobacterium
columnare
(lanjutan)
Tabel 4
(lanjutan)
Spesies
patogen Tuan rumah Penyakit yang disebabkan
spesies gram positif
Lactococcus Yellowtail, rainbow trout, udang, turbot, Streptokokosis atau laktokokosis

garvieae dan belut
Streptococcus Yellowtail, bass laut, barramundi, Streptokokosis

iniae flounder
Streptococcus Turbot Streptokokosis

parauberis
Streptococcus Salmon Atlantis Streptokokosis

phocae
Enterococcus Trout pelangi, brown bullhead, lele Streptokokosis, perdarahan eksoftalmia

faecalis
Patogen makanan umum lainnya
Listeria – –
monocytogenes
Escherichia coli – –
– –
Stafilokokus
aureus
4. Encerkan homogenat secara berurutan dalam larutan salin steril (0,85%) dan tuang
pengenceran yang sesuai pada piring agar DeMan Rogosa Sharpe (MRS) dalam
cawan Petri steril.
5. Inkubasi cawan pada suhu 25–30 °C (tergantung pada sumber sampel) selama 24–
48 jam.
6. Pilih satu koloni berdasarkan ciri morfologi, tumbuhkan dalam MRS broth, dan
bersihkan dengan teknik streak plate.
7. Isolat yang telah dimurnikan diidentifikasi sebagai BAL dengan pewarnaan Gram dan
uji katalase.
8. Isolat disimpan sebagai stok gliserol 40% pada suhu -20 °C.
3.2 Uji Hamparan Agar Agar overlay assay adalah metode uji aktivitas antimikroba langsung. Ini juga disebut
metode lapisan agar ganda. Ini dapat dilakukan dengan dua metode:
3.2.1 Metode-I 1. Siapkan seri pengenceran sampel usus ikan seperti yang dijelaskan pada Subpos
3.1, tuang cawan dengan agar MRS, dan inkubasi pada suhu 25–30 °C selama 24–
48 jam.
2. Setelah koloni BAL terbentuk, tuangkan selapis tryptic soy atau agar lunak BHI
(0,8%) yang diunggulkan dengan indikator patogen
organisme (1% inokulum) di atas piring dan biarkan memadat [14].
3. Inkubasi cawan pada suhu 37 °C untuk pertumbuhan indikator

organisme.
4. Setelah inkubasi, zona hambat bening di sekitar koloni BAL menunjukkan
adanya aktivitas antibakteri.
3.2.2 Metode-II 1. Siapkan biakan segar isolat BAL murni dengan menginokulasi BAL
dalam kaldu MRS dan inkubasi semalaman.
2. Tempatkan 5–10 ÿL bercak kultur BAL pada lapisan agar MRS di
jarak yang sesuai.
3. Inkubasi cawan pada suhu 25–30 °C agar bercak tumbuh.
4. Lapisi piring dengan tryptic soy (TS) atau agar lunak BHI (0,8%) yang
diunggulkan dengan organisme patogen indikator dan biarkan memadat.
5. Inkubasi cawan pada suhu 37 °C untuk pertumbuhan indikator
organisme.
6. Setelah inkubasi, zona hambat bening di sekitar koloni BAL (Gbr. 1)
menunjukkan adanya aktivitas antibakteri [15].
Gbr. 1 Pelat representatif yang menunjukkan uji overlay agar. Pengenceran serial sampel
usus ikan pertama kali dilapiskan pada MRS agar. Koloni yang berkembang setelah
inkubasi dilapisi dengan agar lunak yang diunggulkan dengan organisme patogen
indikator. Berkembangnya zona hambat di sekitar koloni BAL merupakan indikasi adanya
aktivitas antibakteri. (Data yang tidak dipublikasikan ini milik Dr. Ann Catherine Archer)
3.3 Bebas Sel 1. Isolat BAL yang baru dikultur dalam kaldu MRS selama 18-24 jam.
Supernatan (CFS)
2. Supernatan bebas sel diperoleh dengan mensentrifugasi biakan pada
Persiapan
8000 rpm selama 10 menit.
3. Saring CFS melalui filter 0,22 µm dan simpan pada -20 °C hingga digunakan
lebih lanjut [16].
3.4 Aktivitas Antibakteri Aktivitas antibakteri isolat BAL diuji dengan uji difusi sumur agar terhadap patogen
dengan Uji Difusi Sumur ikan biasa (Tabel 1) yang digunakan sebagai organisme indikator [17, 18].
Agar
1. Siapkan agar lunak 0,8% (b/v) media kedelai tryptic atau jantung otak
media infus.
2. Benih 1% dari masing-masing organisme indikator (1 × 105 CFU/mL) ke dalam

agar lunak secara terpisah, aduk rata, dan tuangkan ke dalam cawan Petri
steril.
3. Biarkan media memadat.
4. Lubangi sumuran berukuran 6–8 mm pada agar yang diunggulkan menggunakan

penggerek gabus atau ujung steril. Label sumur di bagian bawah piring dengan
masing-masing isolat LAB.
5. Tambahkan 50–100 ÿL LAB CFS ke dalam sumur, dan biarkan CFS berdifusi
melalui sumur selama 1–2 jam pada suhu kamar.
6. Inkubasi cawan pada suhu 37 °C atau suhu yang sesuai dari galur indikator
selama 24 jam.
7. Amati pembentukan zona hambat di sekitar sumuran yang menunjukkan

aktivitas antibakteri CFS (Gbr. 2).
Gbr. 2 Pelat representatif yang menunjukkan difusi sumur agar. CFS dari isolat BAL
ditambahkan ke sumur yang dibor ke dalam agar lunak yang diunggulkan dengan
patogen indikator. CFS dibiarkan berdifusi melalui agar menghasilkan pembentukan
zona inhibisi yang menunjukkan aktivitas antimikroba. (Data yang tidak dipublikasikan
ini milik Dr. Ann Catherine Archer)
8. Ukur diameter zona menggunakan skala dan catat hasilnya

dalam mm.
9. Aktivitas antibakteri mungkin karena produksi asam organik atau senyawa

antimikroba seperti bakteriosin.
3.4.1 Penentuan 1. Untuk memastikan apakah aktivitas penghambatan disebabkan oleh produksi
Aktivitas Bakteriosin bakteriosin, CFS dinetralkan dengan 1 M NaOH [19].
2. CFS yang dinetralkan diuji aktivitas antibakterinya dengan uji difusi sumur
seperti dijelaskan dalam Subpos 3.4.
3.5 Dinamika 1. Siapkan 100 mL kaldu MRS dalam labu berbentuk kerucut dan autoklaf di
Pertumbuhan 121 °C selama 20 menit.
dan Produksi Bakteriosin 2. Inokulasikan isolat BAL 1% ke dalam kaldu dan inkubasi pada
30–37 °C selama 48 jam.
3. Ambil alikuot sampel secara berkala (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40,
44, 48 h).
4. Tentukan kerapatan sel pada 600 nm, pH biakan, dan
aktivitas antibakteri dengan uji difusi sumur.
5. Aktivitas tersebut dinyatakan sebagai unit acak per mililiter media kultur (AU/
mL).
6. Satu AU/mL didefinisikan sebagai kebalikan dari pengenceran bakteriosin
tertinggi yang menunjukkan zona hambat yang jelas terhadap galur
indikator.
AU per mililiter dihitung dengan rumus berikut

[20, 21]:
AU
= Kebalikan dari pengenceran tertinggi × 1000
ml Jumlah Bakteriosin yang digunakan
Juga disebutkan sebagai
AU 1000
=
ml V×D
dimana V adalah volume sampel dan D adalah faktor pengenceran tertinggi.
atau
beberapa peneliti mengandalkan persamaan yang baru saja dimodifikasi [22]:
AU
= ab × 100 mL
dimana a = 2 (faktor pengenceran) dan b = nilai pengenceran tertinggi yang

menunjukkan minimal 2 mm zona hambat.
3.6 Kaldu Uji mikrodilusi kaldu dapat dilakukan dengan menggunakan CFS mentah atau ekstrak
Uji Mikrodilusi bakteriosin murni untuk menentukan konsentrasi hambat minimum (MIC) dari senyawa
penghambat. Prosedur melibatkan pengenceran serial sampel uji (CFS mentah/
bakteriosin murni) dan inkubasi dengan organisme indikator. MIC adalah konsentrasi
agen antimikroba terendah yang secara kasat mata dapat menghambat pertumbuhan
organisme [23].
1. Tambahkan 200 µL volume sampel uji yang mengandung 100 µL CFS yang
dinetralkan atau bakteriosin murni dari isolat BAL dan 100 µL organisme indikator
(105 –106 CFU/mL) dalam kaldu TS/BHI ke dalam lubang pertama pelat mikrotiter.
2. Pindahkan 100 µL sampel dari sumur pertama ke sumur kedua yang mengandung
100 µL organisme indikator dalam kaldu TS/BHI.
3. Ulangi pengenceran untuk sumur berikutnya seperti yang dijelaskan pada langkah 3.
4. Inkubasi cawan pada suhu 37 °C selama 24 jam.
5. MIC ditentukan dengan mengukur densitas optik sumur uji pada 600 nm.
6. Cawan alikuot setiap pengenceran untuk menentukan jumlah organisme indikator

yang layak.
3.7 Pengujian Time-Kill Time-kill assay adalah metode untuk menentukan efek bakterisidal dari CFS. Ini adalah
metode yang tergantung waktu untuk mempelajari aktivitas bakterisidal LAB terhadap
dinamika pertumbuhan organ indikator [24, 25].
1. Siapkan tryptic soy atau kaldu BHI (10 mL) dalam tabung reaksi dan autoklaf tabung
pada 121 °C selama 20 menit. Biarkan tabung menjadi dingin.
2. Inokulasikan tabung dengan organisme indikator (105 CFU/mL)

dan tambahkan 100 ÿL CFS mentah ke dalam tabung.
3. Inkubasi tabung pada suhu 37 °C selama 24 jam.
4. Gambarkan alikuot secara berkala (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 jam) dan tentukan CFU/
mL dengan metode hitungan lempeng.
5. Tabung yang diinokulasi hanya dengan organisme indikator disimpan sebagai

pengendalian pertumbuhan.
6. Efek bakterisida ditentukan dengan memplot grafik jumlah hidup terhadap waktu dan
membandingkan pertumbuhan organisme indikator pada sampel kontrol dan sampel
uji.
3.8 Time-Kill Co Ini adalah metode untuk menentukan aktivitas antibakteri isolat BAL dengan cara kokultur
Uji budaya dengan organisme indikator [26].
1. Kultur Isolat BAL dan organisme indikator secara individual

media kaldunya masing-masing.
2. Kultur disentrifugasi pada 8000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan

pelet sel.
3. Inokulasi organisme indikator (105 –106 CFU/mL) dengan 106 – 108 CFU/
mL isolat BAL dalam 10 mL kaldu MRS-TS/BHI (rasio 1:1).
4. Inkubasi tabung kokultur pada suhu 37 °C. Sampel alikuot pada interval
reguler (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 jam) dan tentukan jumlah yang layak
dengan metode jumlah lempeng (agar MRS untuk LAB dan agar TS/BHI
untuk galur indikator). Juga mengukur perubahan pH.
5. Tabung yang diinokulasi dengan monokultur BAL atau organisme indikator

disimpan sebagai kontrol.
6. Efek bakterisida ditentukan dengan memplot grafik yang layak
menghitung dan membandingkan dengan kontrol pertumbuhan.
3.9 Pemindaian 1. Inkubasi CFS mentah dan organisme indikator seperti yang dijelaskan
Mikroskop Elektron dalam uji waktu mati. Ambil alikuot pada 30, 90, dan 120 menit. Centri
fuge sampel pada 8000 rpm dan cuci pelet sel dengan PBS [27].
2. Pelet sel diperbaiki dengan menambahkan 2,5% glutaraldehid dan

diinkubasi pada 4 ° C semalam [28].
3. Hari berikutnya, cuci sel dengan PBS dan keringkan dengan menginkubasi
sel dalam peningkatan konsentrasi etanol (5, 10, 20, 30, 50, 70, 90, 100%).
4. Aliquot suspensi sel akhir setelah dehidrasi dalam etanol 100% ditempatkan
pada kaca penutup dan dibiarkan mengering.
5. Kaca penutup terkena lapisan sputter emas. Sampel yang dilapisi
divisualisasikan di bawah pemindaian mikroskop elektron.
Metode baru yang dimodifikasi telah diadopsi dari waktu ke waktu dengan
berbagai fiksatif berdasarkan perbesaran dan resolusi yang diinginkan [29].
6. Perubahan morfologi bentuk dan struktur sel diamati pada sampel yang
diberi CFS [30].
3.10 Pemurnian dari 1. Supernatan bebas sel disentrifugasi pada 8000 hingga 10.000×g selama
Bakteriosin 10–20 menit pada suhu 4 °C untuk menghilangkan kotoran. Kemudian,
penambahan amonium sulfat dari 10% sampai 80% saturasi dilakukan
untuk mengendapkan protein besar dengan pengadukan pada suhu 4 °C.
Saturasi yang diperoleh disentrifugasi pada 8000 hingga 10.000×g selama
10-20 menit pada suhu 4 °C untuk mendapatkan fraksi sebagai pelet yang
mengandung bakteriosin [31].
2. Pelet bakteriosin kemudian disuspensikan kembali dalam buffer yang sesuai
atau diencerkan menggunakan air suling. Ekstrak mentah awal ini dikenai
metode difusi sumur agar sebagaimana disebutkan dalam Subpos 3.4.
3. Ekstrak mentah selanjutnya dimurnikan menggunakan filtrasi gel atau

pertukaran ion sesuai protokol standar [32].
4. Secara singkat, kromatografi penukar kation dapat dilakukan dengan
deteksi UV pada 220 nm. Satu liter suspensi yang diperoleh dari
presipitasi dimasukkan ke dalam kolom resin penukar kation yang kuat
dan dielusi dengan laju alir 1,5–2 mL/menit dan dicuci dengan 3x
volume kolom buffer yang sesuai dengan laju alir 1 mL/ min.
Perolehan fraksi bakteriosin harus distandarisasi berdasarkan
konsentrasi NaCl yang berbeda dari 0,2 hingga 1 M [33]. Fraksi aktif
diliofilisasi dan disimpan pada -20 °C untuk pemurnian dan analisis
lebih lanjut.
5. Lebih jauh lagi, fraksi aktif bakteriosin dikenai filtrasi gel dengan
memasukkannya ke dalam kolom Sephadex sesuai spesifikasi yang
diperlukan. Pilihan idealnya didasarkan pada rekomendasi yang
ditetapkan [34]. Idealnya, kolom diseimbangkan dengan buffer yang
sesuai yang dipilih dan digunakan untuk suspensi. Kolom dielusi
dengan buffer yang sama dan fraksi dikumpulkan pada 1,0-1,5 mL/
menit dan serapannya adalah 220 dan 280 nm. Fraksi yang terkumpul
dievaluasi lagi untuk aktivitas antibakteri seperti yang dijelaskan oleh
prosedur yang disebutkan di atas, dan fraksi aktif didialisis dalam air
suling untuk pemurnian lebih lanjut.
6. Fraksi aktif yang dimurnikan dari proses kromatografi filtrasi gel diproses
lebih lanjut ke dalam kolom fase balik C18.
Sistem kromatografi cair kinerja tinggi fase balik (RP-HPLC) dengan
elusi gradien liner akan memberikan konfirmasi kemurnian. Elusi
dilakukan dengan eluen standar, yaitu 95% air-asetonitril yang
mengandung 0,1% asam trifluoroasetat (TFA). Laju aliran biasanya
ditetapkan hingga 0,5 mL/menit dan dapat diperpanjang hingga 1 mL/
menit [35].
7. Catatan: Konsentrasi protein pada setiap proses pemurnian. Fraksi
yang dikumpulkan setelah setiap langkah pemurnian dikumpulkan
berdasarkan puncak yang diperoleh menggunakan salinan spektro
UV-Vis pada 280 dan 220 nm dan dievaluasi untuk aktivitas antibakteri
seperti yang dijelaskan oleh prosedur yang disebutkan di atas.
1. Awalnya, analisis tricine SDS-PAGE dari fraksi dari CFS ke fraksi yang
3.11 Karakterisasi dimurnikan setelah setiap pemurnian dikenai 16–18% gel penyelesaian
Bakteriosin (tergantung pada peralatan dan resolusi yang dicapai) dan gel susun
4%.
3.11.1 Penentuan
2. Gel dikenai pewarnaan dengan Coomassie brilliant blue R-250 atau
Berat molekul
pewarnaan perak untuk berat molekul menggunakan tangga standar
(antara 2 dan 60 kD). Satu lagi bagian gel yang tidak diwarnai harus
dikenai 20% (v/v) isopropanol dan 10% (v/v) asam asetat selama 2-3
jam dan dibilas dalam buffer natrium fosfat (pH 6,0) selama 1 jam
[36 ] .
3. Pita yang dihasilkan kemudian dilapisi dengan media agar lunak

yang diinokulasi dengan strain indikator selama 24-48 jam untuk
aktivitas antibakteri sesuai dengan protokol yang disebutkan di atas
dalam Subpos 3.4.
4. Analisis spektrometri massa dilakukan dengan menggunakan
sistem LC/MS. Secara singkat, dengan mengikuti langkah-langkah
kromatografi cair yang disebutkan di atas yang dihubungkan ke
spektrometer massa diprogram untuk berjalan dalam mode ionisasi
semprotan elektron positif (ESI) dengan rasio massa/muatan (m/z)
dalam kisaran m/z (berdasarkan berat molekul relatif yang diperoleh
dalam analisis PAGE) dan ana lyzer massa quadrupole time of
flight (Q-TOF) idealnya digunakan [37].
3.11.2 Sensitivitas (a) Panas: Fraksi yang dimurnikan dikenai kisaran suhu inkubasi dari
Probiotik yang Dihasilkan 25 hingga 121 °C.
antibakteri untuk
(b) pH: Probiotik dan fraksi yang dimurnikan dikenai kisaran buffer—
Lingkungan mikro
biasanya antara 2 dan 12 selama minimal 1 jam dan dapat
diperpanjang hingga 2–3 jam dengan pengadukan sesekali pada
suhu 37 °C.
(c) Enzim Fisiologis: Probiotik atau ekstraknya atau metabolit yang
dihasilkan harus mengalami inaktivasi dengan perlakuan enzim
fisiologis seperti katalase, tripsin, pepsin, dan proteinase K selama
1–5 jam pada suhu 37 °C dengan konstan mengaduk.
Catatan: Fraksi yang diperlakukan tersebut di atas terkena aktivitas

anti bakteri seperti yang disebutkan dalam Subpos 3.4.
Terima kasih
Para penulis ingin mengucapkan terima kasih yang tulus kepada
otoritas di JSS Academy of Higher Education & Research, Mysuru,
untuk memberikan dukungan dan fasilitas yang diperlukan. ACA
berterima kasih kepada DBT Wellcome Trust India Alliance atas hibah
Early Career Fellowship (IA/E/20/1/505689). MSP mengakui dukungan
Pemerintah Karnataka. untuk beasiswa OBC (OBC-10/PhD/
CR-04/2021-22).
Referensi
1. Archer AC, Halami PM (2015) Atribut probiotik digunakan sebagai probiotik dalam akuakultur. BMC
Lactobacillus fermentum diisolasi dari kotoran manusia Mikrobio 13:15
dan produk susu. Appl Micro biol Biotechnol 99:8113– 3. Alonso S, Carmen Castro M, Berdasco M, de la Banda
8123
IG, Moreno-Ventas X, de Rojas AH (2019) Isolasi dan
2. Munõz-Atienza E, Go´mez-Sala B, Arau´jo C, Campanero karakterisasi parsial bakteri asam laktat dari mikrobiota
C, del Campo R, Hernańdez PE et al (2013) Aktivitas usus ikan laut untuk aplikasi potensial sebagai probiotik
antimikroba, kerentanan antibiotik dan faktor virulensi dalam akuakultur . Probiotik Antimi crob Protein 11:569–
bakteri asam laktat dari asal perairan dimaksudkan untuk 579
4. Agarwal P, Kayala P, Chandrasekaran N, Mukherjee mengurangi infeksi Listeria yang mematikan. Nat
A, Shah S, Thomas J (2021) Aktivitas anti oksidan Commun 11:6344
dan antibakteri Gelidium pusillum (Stackhouse) 15. Arakawa K (1887) Uji antibakteri dasar untuk
terhadap Aeromonas caviae dan aplikasinya dalam menyaring bakteri asam laktat bakteriosinogenik
akuakultur. dan untuk mencirikan bakteri mereka secara
Aquac Int 29:845–858 5. mendasar. Metode Mol Biol (Clifton NJ) 2019:15–
Yi Y, Zhang Z, Zhao F, Liu H, Yu L, Zha J et al (2018) 22
Potensi probiotik Bacillus velezensis JW: aktivitas 16. Koohestani M, Moradi M, Tajik H, Badali A (2018)
antimikroba melawan bakteri patogen ikan dan efek Efek supernatan bebas sel Lac tobacillus
peningkatan kekebalan pada Carassius auratus. acidophilus LA5 dan Lactobacillus casei 431
Imunol Kerang Ikan 78:322–330
terhadap bentuk planktonik dan biofilm
Staphylococcus aureus. Forum Res Dokter Hewan
6. Garce's ME, Olivera NL, Ferna'ndez M, Rossi CR, 9: 301–306
Sequeiros C (2020) Aktivitas antimikroba dari 17. Balouiri M, Sadiki M, Ibnusouda SK (2016)
Carnobacterium spp penghasil bakteriosin. diisolasi Metode untuk mengevaluasi aktivitas antimikroba
dari trout Patagonian yang sehat dan potensinya secara in vitro: review. J Pharm Anal 6:71–79
untuk digunakan dalam akuakultur. Aquac Res
18. Jini R, Swapna HC, Rai AK, Vrinda R, Halami PM,
51:4602–4612
Sachindra NM, Bhaskar N (2011) Isolasi dan
7. Wang G, Jin X (2019) Bakteri asam laktat pada karakterisasi bakteri asam laktat (BAL) potensial
peternakan dan akuakultur. Dalam: Chen W (ed) dari limbah pengolahan ikan air tawar untuk aplikasi
Lact Acid Bact Bioeng Ind Appl. Singa pori: dalam pemanfaatan ikan secara fermentatif
Springer, hlm. 257–283. mengolah limbah. Braz J Mikrobiol 42:1516–1525
8. Kumari VBC, Huligere SS, Ramu R, Naik Bajpe S,
Sreenivasa MY, Silina E, Stupin V, Achar RR 19. Saltaji S, Rue´ O, Sopena V, Sable´ S, Tambadou
(2022) Evaluasi Atribut Probiotik dan Antidiabetes F, Didelot S et al (2020) Keanekaragaman
Strain Lactobacillus yang Diisolasi Dari Fermentasi
Lactococ cus lactis diungkapkan oleh ampli con
Bit. Front Microbiol 13:911243 9. Wang Y, Wang J,
yang ditargetkan sekuensing gen purR,
Bai D, Wei Y, Sun J,
perbandingan metabolik dan sifat antimikroba
Luo Y et al (1862) Mekanisme penghambatan sinergis dalam starter campuran yang tidak terdefinisi kultur
pediosin PA-1 dan asam L-laktat terhadap yang digunakan untuk pembuatan keju lunak. Makanan 9:622
Aeromonas hydrophila. Biochim Biophys Acta BBA 20. Ansari A, Zohra RR, Tarar OM, Qader SAU, Aman
Biomembr 2020:183346 10. Zoumpourtikoudi V, A (2018) Penapisan, pemurnian dan karakterisasi
Pyrgelis N, Chatzigrigoriou M,
Bakteriosin tahan protease yang termostabil dan
Tasakis RN, Touraki M (2018) Interaksi antara ragi dan aktif terhadap Staphylococcus aureus yang resisten
bakteri probiotik meningkatkan sifat dan metabolisme methicillin (MRSA). BMC Microbiol 18:192 21. Daba
probiotik yang menawarkan perlindungan tambahan H, Pandian S,
untuk Artemia franciscana terhadap Vibrio anguil Gosselin JF, Simard RE, Huang J, Lacroix C (1991)
larum. Microb Pathog 125:497–506 11. Verschuere Deteksi dan aktivitas bakteriosin yang diproduksi
L, Rombaut G, Sorgeloos P, Ver straete W (2000) oleh Leuconos toc mesenteroides. Appl Environ
Bakteri probiotik sebagai agens Microbiol 57: 3450–3455
pengendali hayati dalam akuakultur.
22. Gutie´rrez-Corte´s C, Suarez H, Buitrago G, Nero
LA, Todorov SD (2018) Karakterisasi bakteriosin
Mikrobiol Mol Biol Wahyu 64:655–671
yang dihasilkan oleh strain Ped iococcus
12. Hoseinifar SH, Sun YZ, Wang A, Zhou Z (2018) pentosaceus diisolasi dari keju Minas. Ann Microbiol
Probiotik sebagai sarana pengendalian penyakit BioMed Central 68: 383–398
dalam akuakultur, tinjauan pengetahuan saat ini
dan perspektif masa depan. Mikrobiol Depan 9:2429 23. Perales-Adań J, Rubinõ S, Martÿńez-Bueno M,
Valdivia E, Montalbań-Lo´pez M, Cebriań R ,
13. Ringo E, Schillinger U, Holzapfel W (2005) Maqueda M (2018) Bakteriosin LAB mengendalikan
Bab 18. Aktivitas antimikroba bakteri asam laktat makanan yang diisolasi (Tahan Obat)
yang diisolasi dari hewan air dan penggunaan Stafilokokus. Mikrobiol Depan 9:1143 24.
bakteri asam laktat dalam akuakultur. Di dalam: Prabhurajeshwar C, Chandrakanth K (2019)
Holzapfel WH, Naughton PJ, Pierzynowski SG, Evaluasi sifat antimikroba dan zatnya terhadap
Zabielski R, Salek E (eds). Biol Grow Anim 2:418– bakteri patogen secara in-vitro dengan strain
453 14. Drolia R,
lactobacilli probiotik yang diisolasi dari yoghurt
Amalaradjou MAR, Ryan V, Tenguria S, Liu D, Bai X et komersial. Clin Nutr Exp 23: 97–115
al (2020)
Probiotik yang direkayasa dengan target reseptor
25. Appiah T, Boakye YD, Agyare C (2017) Aktivitas lactobacillus plantarum zrx03 diisolasi dari
anti mikroba dan kinetika pembunuh waktu dari kotoran bayi. Food Sci Nutr 8:2214–2222
ekstrak jamur Ghana terpilih. 32. Doonan S, Cutler P (2004) Strategi umum.
Alternatif Pelengkap Berbasis Bukti Med 2017: Dalam: Cutler P (ed) Protein Purif Pro toc
4534350 [Internet]. Totowa: Humana Press. hlm. 1–13
26. Chen CC, Lai CC, Huang HL, Huang WY, Toh 33.
HS, Weng TC, Chuang YC, Lu YC, Tang HJ Selkirk C (2004) kromatografi
(2019) Aktivitas antimikroba spesies lac penukar ion. Dalam: Cutler P (ed) Protein Purif
tobacillus terhadap enterobacteriaceae yang Protoc [Internet]. Totowa: Humana Press. hal.
resisten terhadap karbapenem . Front 125–131 34. O´ 'Fa
Microbiol 10:789 27. Robben C, Witte AK, Schoder ´gaín C, Cummins PM, O'Connor BF (2010)
D, Stessl B, Rossmanith P, Mester P (2019) Kromatografi filtrasi gel. Kromatografi Protein
Pendekatan berbasis ATP yang cepat dan 681:25–33
mudah memungkinkan pengujian MIC untuk 35. Lardeux H, Duivelshof BL, Colas O, Beck A,
patogen VBNC non-resusitasi. Mikrobiol depan 10:1365
McCalley DV, Guillarme D et al (2021)
28. Graham L, Orenstein JM (2007) Memproses Mengubah aditif fase gerak asli untuk
jaringan dan sel untuk mikroskop elektron karakterisasi biofarmasi protein dalam
transmisi dalam patologi diagnostik dan kromatografi cair – spektrometri massa. Anal
penelitian. Nat Protoc 2:2439–2450 Chim Acta 1156:338347
29. Dassanayake RP, Falkenberg SM, Stasko JA, 36. Zhang J, Yang Y, Yang H, Bu Y, Yi H, Zhang L
Shircliff AL, Lippolis JD, Briggs RE (2020) et al (2018) Pemurnian dan karakterisasi parsial
Identifikasi solusi fiksatif yang andal untuk bakteriosin Lac-B23, produksi bakteri ocin baru
melestarikan arsitektur kompleks biofilm bakteri oleh lactobacillus plantarum J23, diisolasi dari
untuk pemindaian evaluasi mikroskop elektron. fermen tradisional Tiongkok susu ted. Front
PLoS One 15:e0233973 30. Microbiol 9:2165 37. Sahoo TK,
Gomes LC, Mergulhaõ FJ (2017) Analisis SEM Jena PK, Patel AK, Seshadri S (2015) Pemurnian
dampak permukaan pada pengobatan antibiotik dan karakterisasi molekuler dari bakteriosin
biofilm. Pemindaian 2017: TSU4 yang sangat kuat diproduksi oleh
e2960194 31. Lei S, Zhao R, Sun J, Ran J, Ruan X, Lactobacillus animalis TSU4. Appl Biochem
Zhu Y (2020) Pemurnian sebagian dan Biotechnol 177:90–104
karakterisasi bakteriosin spektrum luas yang dihasilkan oleh
Bagian III
Metode Pengobatan Infeksi pada Ikan dan Udang

Bab 17
Persiapan Ekstrak Alga Laut (Rumput Laut)

dan Kuantifikasi Phytocompounds
S. Thanigaivel, John Thomas, Natrajan Chandrasekaran,
Abstrak
Protokol untuk ekstraksi rumput laut dibahas di sini yang berfokus pada berbagai jenis pengumpulan alga, pemrosesan,
dan persiapan ekstrak rumput laut yang diperoleh melalui protokol standar.
Manajemen kesehatan akuakultur memerlukan peningkatan output yang stabil dengan mengurangi kerugian ekonomi dan
menggunakan berbagai bioproduk berbasis tanaman alami untuk mengobati bakteri patogen. Oleh karena itu, ekstrak
berbasis bahan alam tersebut dapat direkomendasikan untuk mengatasi efek samping penggunaan antibiotik di sektor perikanan.
Menurut metode saat ini, senyawa bioaktif yang terdapat dalam dua rumput laut diidentifikasi melalui penggunaan berbagai
jenis metode ekstraksi diferensial (berurutan dan maserasi), serta metode ekstraksi tradisional dan berbasis pelarut. Ekstrak
dengan senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas antioksidan dan antibakteri akan efektif melawan patogen ikan.
Kata Kunci Rumput Laut, Fitokimia, Sediaan Ekstrak, Maserasi, Sekuensial, Patogen Ikan
1. Perkenalan
Manajemen penyakit yang efektif dengan bantuan vaksin, serta

formulasi ekstrak dan sediaan emulsi yang efisien, sangat penting
untuk keberhasilan produksi hewan air dan produknya di industri
akuakultur [1]. Hal ini dapat dicapai melalui pengelolaan penyakit
yang efisien dengan bantuan vaksin, serta formulasi dan formulasi
ekstrak dan sediaan emulsi yang efisien dalam industri akuakultur.
Saat ini sedang digunakan untuk mengobati dan mengendalikan
infeksi dalam budidaya, daripada antibiotik komersial, yang
mempromosikan resistensi terhadap bakteri patogen. Ekstrak
nabati digunakan untuk mengobati dan mengendalikan infeksi
dalam akuakultur [2]. Selain itu, konsumsi ikan yang diberi
antibiotik oleh manusia dapat mengakibatkan masalah kesehatan.
Selain itu, hal itu merusak kemampuan ikan untuk mempertahankan
diri terhadap mikroorganisme patogen oportunistik dengan melemahnya
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_17,
135
136 S. Thanigaivel dkk.
sistem kekebalan tubuhnya. Karena aktivitas antibakterinya terhadap

patogen gram negatif dan gram positif, rumput laut dan ekstraknya
semakin mendapat perhatian untuk digunakan dalam pengobatan,
bioteknologi, dan pengawetan makanan [3]. Ekstrak alga mengandung
polisakarida, protein, asam lemak tak jenuh ganda (PUFA), pigmen,
polifenol, flavonoid, asam sinamat, isoflavon, asam ben zoat, lignan,
quercetin, mineral, dan hormon perkembangan tanaman, di antara zat
lainnya [4] . Sebagai bahan awal untuk produksi ekstrak alga, biomassa
rumput laut dapat dimanfaatkan [5, 6]. Ekstraksi adalah langkah paling
penting dan pertama dalam proses isolasi berbagai jenis komponen.
Kemungkinan efisiensi ekstraksi rumput laut akan berkurang karena
adanya dinding sel yang kompleks, dan hal ini akan dipengaruhi oleh
komposisi pelarut, suhu, lama perlakuan, dan pH. Bahan tanaman telah
diisolasi dan dipelajari menggunakan berbagai teknik, termasuk ekstraksi
dengan bantuan gelombang mikro, ekstraksi cairan superkritis dengan
karbon dioksida sebagai pelarut, ekstraksi Soxhlet, ekstraksi dengan
bantuan enzim, dan ekstraksi dengan bantuan ultrasound [6, 7 ] . Ada
berbagai macam pelarut yang dapat digunakan dalam proses ini, antara
lain etanol, aseton, metanol-toluena, metanol-toluena-metanol, petroleum
eter, etil asetat, diklorometana, dan butanol. Pekerjaan dari proses ini
memerlukan penggunaan pelarut yang mahal dan berpotensi beracun
[8, 9]. Untuk mengatasi keterbatasan metode ekstraksi yang khas dan
menghasilkan ekstrak alga, kami menggunakan operasi ekstraksi
perebusan dan perendaman dengan air suling sebagai metode pilihan
kami [10, 11].
2 Bahan
2.1 Reagen dan • Ganggang laut—ganggang laut coklat dan hijau.

Bahan Baku • Air sulingan.
yang Dibutuhkan
• Wadah dan stoples plastik. •
Baki plastik. •
Cawan petri.
• Penggiling pengaduk.
• Penyaringan corong. •
Labu berbentuk kerucut.
• Asam askorbat.
• Reagen Folin–Ciocalteu. •
Asam galat.
• Kuersetin. •
Asam etilena dinatrium tetra asetat. •
Etanol, diklorometana, petroleum eter, dan kloroform.
Persiapan Ekstrak Alga Laut (Rumput Laut) dan Kuantifikasi... 137
2.2 Koleksi dari • Kumpulkan rumput laut dan olah. • Cuci

Rumput laut
rumput laut untuk menghilangkan kotoran dan kotoran garam. • Keringkan
rumput laut pada tingkat kelembapan hingga 15%. • Giling
tanaman hingga ukuran partikel 0,3 mm [9, 12].
3 Metode
3.1 Pengolahan • Hapus epiphytes dan kontaminan mikroba lainnya. • Keringkan

Ekstrak Rumput Laut
rumput laut sebelum digunakan untuk ekstraksi [9, 13]. • Hancurkan daun rumput
laut kering.
• Campurkan dengan 100 mL air dan aduk campuran tersebut

24–48 jam.
• Saring ekstrak melalui kain katun tipis. • Sentrifugasi

filtrat selama 10 menit dengan kecepatan 7000 rpm. • Kumpulkan
supernatan dan awetkan [14].
3.2 Ekstrak • Metode maserasi digunakan untuk ekstraksi.

Persiapan • Tambahkan 5 g bubuk rumput laut ke dalam 100 mL air dan simpan semalaman
(Metode konvensional) di dalam shaker. •
Saring ekstrak menggunakan kertas saring Whatman. •
Ekstrak disaring dan disimpan untuk pengujian [15]. • Evaporasi
ekstrak di bawah tekanan rendah dalam rotary evaporator. • Keringkan sampel
yang dikikis. • Tambahkan sampel
tergores dan campur dengan air Milli-Q yang sesuai. • Ukur berat kering
sampel dan hitung keringnya
hasil [15].
3.3 Deteksi Fitokimia Protokol standar berikut digunakan untuk melakukan analisis fitokimia dari
pada Ekstrak Rumput ekstrak tumbuhan. Tes skrining fitokimia berikut dilakukan pada ekstrak tumbuhan.
Laut [9]
3.3.1 Alkaloid • Tambahkan 1 mL reagen Dragendorff. •

Tambahkan 2 mL ekstrak rumput laut.
• Amati presipitasi jingga–merah. • Konfirmasi

pembentukan alkaloid.
• Adanya alkaloid ditunjukkan dengan adanya endapan berwarna hijau atau putih.
3.3.2 Flavonoid • Tambahkan 1 mL ekstrak rumput laut.

• Tambahkan 0,1 mL kloroform.
• Tambahkan volume yang sama dari asam sulfat ke dalam tabung

yang sama. • Amati lapisan atas untuk pembentukan warna
merah. • Konfirmasi keberadaan flavonoid.
3.3.3 Karbohidrat • Tambahkan 2 mL ekstrak

tumbuhan. • Tambahkan 1 mL reagen
Molisch. • Kemudian tambahkan beberapa tetes asam sulfat
pekat. • Karbohidrat ditandai dengan warna ungu atau kemerahan.
3.3.4 Uji Kina • Ambil 1 mL ekstrak rumput laut.

• Tambahkan 1 mL asam sulfat pekat.
• Amati pembentukan warna merah.
• Konfirmasi kuinon.
3.3.5 Uji Glikosida • Tambahkan 2 mL ekstrak

tumbuhan. • Tambahkan 3 mL kloroform, diikuti dengan larutan amonia
10%. • Amati pembentukan semburat merah
jambu. • Konfirmasikan glikosida.
3.3.6 Uji Triterpen • Ambil 1,5 mL ekstrak rumput laut.
• Tambahkan 1 mL reagen Liebermann–Burchard. •

Amati pembentukan warna biru-hijau di dalam tabung. • Kehadiran
triterpenoid dikonfirmasi.
3.3.7 Fenolik • Ambil 1 mL ekstrak tumbuhan.

• Tambahkan 2 mL air suling.
• Tambahkan beberapa tetes besi klorida 10%. •

Amati rona biru atau hijau. •
Kehadiran fenol dikonfirmasi.
3.3.8 Protein • Ambil 1 mL ekstrak rumput laut.
• Tambahkan beberapa tetes ninhidrin.

• Amati pembentukan warna biru.
• Pastikan adanya protein dalam ekstrak.

Persiapan Ekstrak Alga Laut (Rumput Laut) dan Kuantifikasi... 139
3.3.9 Fitosteroid dan • Ambil 1 mL ekstrak tumbuhan dalam tabung

Steroid
reaksi. • Tambahkan volume yang sama
dari kloroform. • Tambahkan
beberapa tetes asam sulfat. •
Amati cincin coklat. • Konfirmasi fitosteroid.
3.3.10 Phlobatannin • Ambil 1 mL ekstrak tumbuhan.

• Tambahkan 2% hidroklorida.
• Amati endapan berwarna merah. •
Konfirmasi keberadaan phlobatannin.
3.3.11 Antrakuinon • Siapkan 1 mL ekstrak tumbuhan. •

Tambahkan beberapa tetes larutan amonia 10%.
• Amati endapan berwarna pink. • Pastikan
adanya antrakuinon.
Referensi
1. Miccoli A, Manni M, Picchietti S, Scapigliati G S,

6. Thanigaivel Chandrasekaran N, Mukherjee A,
(2021) Penelitian vaksin mutakhir untuk Thomas J (2016) Rumput laut sebagai sumber
penggunaan akuakultur: kasus tiga spesies ikan terapi alternatif untuk pengelolaan penyakit air.
yang relevan secara ekonomi. Vaksin 9:140. Akuakultur 464:529– 536. https://doi.org/10.1016/
https://doi.org/10.3390/VACCINES9020140 J.AQUACUL TURE.2016.08.001
2. Dawood MAO, Koshio S, Esteban MA´ (2018)
Peran menguntungkan aditif pakan sebagai 7. Thanigaivel S, Thomas J, Vickram AS, Anbarasu
imunosti mulan dalam akuakultur: tinjauan. K, Karunakaran R, Palanivelu J et al (2021)
Wahyu Aquac 10:950–974. https://doi.org/ Khasiat nanopartikel perak biogenik yang
10.1111/ dienkapsulasi dan resistensi penyakitnya
RAQ.12209 3. Masoomi Dezfooli S, Gutierrez- terhadap Vibrio harveyi melalui pemberian oral
Maddox N, Alfaro A, Seyfoddin A (2019) di Macrobrachium rosenbergii. Saudi J Biol Sci
Enkapsulasi untuk memberikan bioaktif dalam 28:7281. https://doi.org/10.1016/J.SJBS.
akuakultur. Wahyu Aquac 11:631–660. https://doi.org/10. 2021.08.037
1111/RAQ.12250 8. Thanigaivel S, Thomas J, Vickram AS,
4. Yu YY, Chen WD, Liu YJ, Niu J, Chen M, Tian Gulothungan G, Nanmaran R, Rani DJ (2021)
LX (2016) Pengaruh tingkat diet yang berbeda Khasiat antioksidan dan antibakteri Chaetomorpha
dari kekuatan kering Gracilaria lemaneiformis linum dan evaluasi toksikologinya untuk
pada kinerja pertumbuhan, parameter hematologi pengobatan profilaksis terhadap infeksi
dan struktur usus juvenile Pacific putih udang Pseudomonas aeruginosa di Labeo rohita. https://
(Litopenaeus vannamei). Akuakultur 450:356– doi.org/10.1080/ 10454438.2021.1961966
362. https://doi.org/10.1016/j.
akuakultur.2015.07.037 9. Thanigaivel S, Vijayakumar S, Gopinath S,
5. Abu-Elala NM, Samir A, Wasfy M, Elsayed M Mukherjee A, Chandrasekaran N, Thomas J
(2019) Efikasi vaksin polivalen injeksi dan imersi (2015) Aktivitas antimikroba in vivo dan in vitro
terhadap infeksi streptokokus pada Induk dan dari Azadirachta indica (Lin) terhadap Citro
keturunan Nil tila pia (Oreochromis niloticus). bacter freundii yang diisolasi dari ikan nila yang
Imunol Kerang Ikan 88:293–300. https://doi.org/ terinfeksi secara alami (Oreochromis
10. mossambicus). Akuakultur 437:252–255. https://
1016/J.FSI.2019.02.042 doi.org/10.1016/ J.AQUACULTURE.2014.12.008
10. Schleder DD, Peruch LGB, Poli MA, Ferreira TH, 13. Athukorala Y, Lee KW, Song C, Ahn CB, Shin
Silva CP, Andreatta ER et al (2018) Pengaruh TS, Cha YJ et al (2003) Potensi aktivitas
rumput laut coklat terhadap kinerja pertumbuhan antioksidan ekstrak ganggang merah laut
udang vaname Pasifik, morfologi usus, aktivitas grateloupia filicina. J Makanan Lipid 10:251–265.
enzim pencernaan dan ketahanan terhadap virus https://doi.org/10.1111/J.1745-4522.2003.
white spot. Akuakultur 495:359–365. https:// TB00019.X
doi.org/10.1016/j.aquaculture. 2018.06.020 S,
14. Thanigaivel Chandrasekaran N, Mukherjee A,
Thomas J (2019) Khasiat protektif ekstrak
11. Mariot LV, Bolÿ´var N, Coelho JDR, Goncalves rumput laut mikroenkapsulasi untuk mencegah
P, Colombo SM, do Nascimento FV et al (2021) infeksi Aeromonas pada Oreochro mis
Pakan yang dilengkapi dengan carra geenan mossambicus. Comp Biochem Physiol Bagian C
meningkatkan ketahanan udang vaname Pasifik Toxicol Pharmacol 218:36–45. https://doi. org/
terhadap WSSV tanpa mengubah parameter 10.1016/J.CBPC.2018.12.011 15.
kinerja pertumbuhannya. Akuakultur 545. https:// Thanigaivel S, Vidhya Hindu S, Vijayakumar S,
doi.org/10.1016/j.aquaculture. 2021.737172 Mukherjee A, Chandrasekaran N, Thomas J
(2015) Ekstraksi pelarut diferensial dari dua
12. Godlewska K, Michalak I, Tuhy L, Chojnacka K rumput laut dan kemanjurannya dalam
(2016) Biostimulan pertumbuhan tanaman mengendalikan infeksi Aero monas salmonicida
berdasarkan metode ekstraksi rumput laut yang di Oreochromis mossambicus: pendekatan terapi baru.
berbeda dengan air. Biomed Res Int 2016:1. Akuakultur 443:56–64. https://doi.org/10.
https://doi. org/10.1155/2016/5973760 1016/J.AQUACULTURE.2015.03.010
Bab 18
Mengobati Infeksi Bakteri pada Ikan dan Udang Menggunakan

Ekstrak Rumput Laut

Abstrak
Penggunaan rumput laut dalam pengobatan infeksi bakteri dapat membantu mengurangi resistensi antibiotik.
Penggunaan ekstrak rumput laut coklat dan hijau, khususnya, meningkatkan perlindungan imunologis terhadap
ikan dan udang. Selama 45 hari, juvenil diberi ekstrak rumput laut dengan konsentrasi 2,5 dan 5 g kg-1
bersamaan dengan makanannya. Ekstrak mengandung molekul bioaktif yang bersifat antioksidan dan
antibakteri, membuatnya sangat efektif melawan infeksi. Jika dibandingkan dengan ekstrak lainnya, ekstrak
etanol dan air dari rumput laut memberikan efek antibakteri yang baik terhadap infeksi bakteri pada ikan, hal
ini menunjukkan bahwa mereka lebih efektif. Menggunakan ekstrak alga untuk mengobati infeksi dalam
akuakultur adalah metode pengelolaan penyakit yang hemat biaya dan ramah lingkungan. Menggunakan
ekstrak ini sebagai langkah profilaksis bisa bermanfaat.
Kata Kunci Ekstrak Rumput Laut, Infeksi Patogen, Patogen Ikan dan Udang, Patogenisitas,
Perlakuan
1. Perkenalan
Akuakultur mengalami lonjakan popularitas dalam beberapa tahun

terakhir, khususnya dalam produksi ikan dan udang, dan hal ini
diperkirakan akan terus berlanjut. Semenjak pesatnya perkembangan
industri ikan dan udang telah mengakibatkan peningkatan produksi
baik ikan maupun udang sebagai akibat pesatnya perkembangan
budidaya dan meningkatnya permintaan ikan, maka produksi ikan
dan udang pun meningkat [1 ] . Wabah penyakit karena itu lebih
mungkin terjadi sebagai akibat dari ini. Dalam hal kematian massal
dalam akuakultur, penyakit menular yang disebabkan oleh bakteri,
virus, dan jamur adalah penyebab yang paling umum. Virus
menyebabkan kerugian besar pada ikan budidaya dan produksi
kerang. Ada berbagai metode pengobatan efektif yang tersedia
untuk berbagai epidemi. Petani biasanya menggunakan antibiotik dan/atau pestisi
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_18,
141
organisme berbahaya di bidangnya [2]. Obat-obatan seperti antibiotik

dan bahan kimia, di sisi lain, telah digunakan dengan hemat karena
mahal, tidak dapat terurai secara hayati, dan sangat biomagnifikasi,
dan resistensi antibiotik telah meningkat dalam beberapa tahun
terakhir. Selain itu, efek samping yang tidak menguntungkan, seperti
akibat bagi kesehatan manusia dan kesehatan spesies nontarget,
telah diamati dalam beberapa kasus. Pestisida dan antibiotik
digunakan sembarangan, yang telah menciptakan perdebatan sengit
di antara para pecinta lingkungan dan organisasi pemerintah tentang
apakah akan langsung melarang produk ini atau membiarkannya
diproduksi dengan cara yang lebih ramah lingkungan [3] . Ini telah
menerima banyak minat dalam dekade terakhir untuk mempelajari
manajemen patogen dalam akuakultur dan pencegahan penyakit menggunakan he
Beberapa metabolit sekunder yang sangat bioaktif yang ditemukan
dalam rumput laut, seperti sterol, hormon, vitamin B kompleks, dan
komponen struktur bio-membran, telah terbukti berkontribusi dalam
pembuatan bahan akuakultur fungsional baru.
Beberapa senyawa ini telah dipelajari potensinya sebagai
antikarsinogenik, antibakteri, dan antiinflamasi [4]. Untuk meningkatkan
pertahanan udang, beberapa peneliti berkonsentrasi pada
pengembangan bahan kimia bioaktif baru yang berasal dari rumput
laut dan produk alami lainnya. Selain itu, meningkatnya kebutuhan
akan strategi pengendalian penyakit yang tidak terlalu berbahaya
bagi lingkungan telah mendorong para ahli untuk mencari pilihan yang
berbeda. Tujuan utamanya adalah untuk menentukan bagaimana
ekstrak rumput laut yang berbeda mempengaruhi pertumbuhan,
kelangsungan hidup, dan perlindungan kekebalan udang dan ikan terhadap infeksi
2 Bahan
2.1 Koleksi dari • Benih yang sehat. •

Eksperimental Wadah kaca.
Ikan [6] • Aerator.
• Tangki fiberglass.
• Tabung reaksi.
2.2 Isolasi • Isolasi mikroorganisme dari ikan yang terinfeksi. •

Bakteri Patogen [4] Kultur dalam kondisi laboratorium.
• Konfirmasi biokimia.
• Identifikasi rRNA 16 detik.
• Postulat Koch. •
Patogenisitas pada ikan.
Mengobati Infeksi Bakteri pada Ikan dan Udang Menggunakan Ekstrak Rumput Laut 143
2.3 Persiapan Inokulum • Kultur bakteri pada media selektif untuk percobaan patogenisitas.
Bakteri [4]
• Diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam.
3 Metode
3.1 Pemeliharaan dari • Kumpulkan bibit ikan. • Pindahkan
Eksperimental bibit dengan aerasi yang tepat.
Hewan [7]
3.2 Pengumpulan dan • Kumpulkan rumput laut dan keringkan. •

Pengolahan dari Hancurkan bubuk dan rendam 5 g dalam 100 mL masing-masing pelarut
Rumput laut selama 48 jam.
• Ekstrak menggunakan air, etanol, dan pelarut lain yang diinginkan.

• Saring ekstrak dan simpan secara in vitro dan in vivo.
3.3 Aktivitas • Siapkan agar Mueller Hinton dan autoklaf pada suhu 121 °C untuk
Antibakteri [8] 15 menit.
• Tuang media ke dalam piring steril. •

Lakukan difusi sumur agar melawan patogen. • Celupkan
biakan kaldu dengan kapas yang telah disterilkan. • Keluarkan
inokulum ekstra dengan meremas kapas di sisi tabung reaksi.
• Swab biakan ke media.
• Buat dua lubang berdiameter 8 mm dengan pemotong lubang di atas agar

piring.
• Tambahkan 0,5, 1, 1,5, 2, dan 2,5 mg/mL ekstrak ke dalam lubang. •
Tambahkan masing-masing pelarut sebagai kontrol di sumur
terpisah. • Biarkan larutan selama 2 jam untuk
menyebar. • Inkubasi cawan selama 24–48 jam
pada suhu 37 °C. • Amati zona hambat di sekitar sumur.
3.4 Patogenisitas dan Tambahkan 1000 mL air ke dalam tangki kaca.

Pengobatan
Simpan tiga tangki.
Ekstrak Rumput Laut [8]
Tambahkan lima ikan sehat di semua tangki.
Suntikkan 20 ÿL pengenceran bakteri patogen (105 ) ke ikan yang dipelihara
tank.
Suntikkan 20 ÿL saline ke ikan dalam satu tangki yang berfungsi sebagai

kontrol patogenisitas.
• Suntikkan 25 ÿL masing-masing ekstrak dengan injeksi intramuskular untuk

perlakuan.
• Suntikkan garam ke dalam satu set ikan untuk pengobatan kontrol [4, 9].
Referensi
1. Mondal H, Chandrasekaran N, Mukherjee A, (2015) Aktivitas antimikroba in vivo dan in vitro

Thomas J (2021) Infeksi virus pada ikan dan Azadirachta indica (Lin) terhadap Citrobacter
udang budidaya: status terkini dan metode freundii yang diisolasi dari ikan nila (Oreochromis
pengobatan. Aquac Int 2021:1–36. https://doi. mossambicus) yang terinfeksi secara alami.
org/10.1007/S10499-021-00795-2 2. Akuakultur 437: 252–255. https://doi.org/10.1016/
Balboa EM, Conde E, Moure A, Falque´ E, Domÿ J.AQUA CULTURE.2014.12.008
ńguez H (2013) Sifat antioksidan in vitro dari 7. Thanigaivel S, Thomas J, Vickram AS,
ekstrak kasar dan senyawa dari ganggang Gulothungan G, Nanmaran R, Jenila Rani D
coklat. Food Chem 138:1764–1785 3. (2021) Khasiat antioksidan dan antibakteri
Balasubramanian G, Sarathi M, Rajesh S, Kumar, Chaetomorpha linum dan evaluasi toksikologinya
Hameed ASS (2007) Skrining aktivitas antivirus untuk pengobatan profilaksis terhadap infeksi
tanaman obat India terhadap virus sindrom bintik Pseudomonas aeruginosa di Labeo rohita. https://
putih pada udang. Akuakultur 263:15–19 doi.org/10.1080/10454438. 2021.1961966
4. Thanigaivel S, Vidhya Hindu S, Vijayakumar S, 8. Aftabuddin S, Abdul M, Siddique M, Habib A,

Mukherjee A, Chandrasekaran N, Thomas J Akter S, Hossen S et al (2021) Pengaruh ekstrak
(2015) Ekstraksi pelarut diferensial dari dua rumput laut terhadap pertumbuhan, kelangsungan
rumput laut dan kemanjurannya dalam hidup, aktivitas antibakteri, dan respon imun
mengendalikan infeksi Aero monas salmonicida Penaeus monodon terhadap Vibrio
di Oreochromis mossambicus: pendekatan terapi baru. parahaemolyticus. https://doi.org/
Akuakultur 443:56–64. https://doi.org/10. 10.1080/1828051X.2021. 1878943
1016/J.AQUACULTURE.2015.03.010 5. 9. Thanigaivel S, Chandrasekaran N, Mukherjee A,
Chojnacka K (2012) Senyawa aktif secara biologis Thomas J (2019) Khasiat protektif dari ekstrak
dalam ekstrak rumput laut – prospek aplikasi. rumput laut enkapsulasi mikro untuk mencegah
Buka Conf Proc J 3:20–28. https://doiorg/1 0 . 2 infeksi Aeromonas pada Oreochromis mossam
.
1 7 4 / 1876326X01203020020 bicus. Comp Biochem Physiol Bagian C Toxicol
Pharmacol 218:36–45. https://doi.org/10.
6. Thanigaivel S, Vijayakumar S, Gopinath S, 1016/J.CBPC.2018.12.011
Mukherjee A, Chandrasekaran N, Thomas J
Bab 19
Persiapan dan Perawatan Pelet Enkapsulasi Rumput Laut

Pakan di Perikanan Budidaya
Abstrak
Akuakultur adalah salah satu metode paling efektif untuk meningkatkan produksi ikan dunia. Wabah penyakit
merupakan masalah yang signifikan dalam industri akuakultur. Menggunakan pendekatan kemoterapi, wabah
penyakit telah diobati dan dicegah di masa lalu. Penggunaan bahan kimia memiliki konsekuensi yang
merugikan bagi lingkungan serta bagi kesehatan manusia. Resistensi antibiotik terjadi akibat penggunaan
berulang antibiotik dalam jangka waktu yang lama. Pemanfaatan bahan alam seperti tumbuhan obat,
ganggang laut, herba, dan senyawa ekstraknya dalam pengelolaan penyakit pada ikan dan udang kini sedang
dieksplorasi. Bahan tunggal, kombinasi dari dua senyawa berbeda, dan aditif pakan semuanya dapat
digunakan. Senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh ekstrak-ekstrak tersebut lebih efektif bila diberikan sebagai
manik-manik yang dienkapsulasi.
Kata kunci Rumput laut, Mikroenkapsulasi, Pakan ikan, Senyawa antibakteri, Patogen ikan, Resistensi
penyakit
1. Perkenalan
Akuakultur menyediakan suplemen protein berupa tepung ikan yang

diproduksi dalam jumlah banyak. Akuakultur mencakup produksi “ikan
konsumsi”, yang merupakan vertebrata dan invertebrata yang
dimaksudkan untuk konsumsi manusia, serta produksi barang-barang
non-makanan seperti mutiara, kerang laut, dan barang-barang dekoratif
[1] . Ada sejumlah besar spesies tanaman air yang dibudidayakan,
seperti rumput laut, dan makhluk hidup yang dapat dibudidayakan
yang diproduksi dalam beberapa tahun terakhir. Selain itu, hampir 43
juta ton ikan telah digunakan sebagai sumber makanan alga laut, yang
memiliki berbagai aplikasi. Ikan yang dibudidayakan menyumbang
sebagian besar produksi primer [2]. Residu ikan merupakan bagian
terbesar dari total produksi tepung ikan dunia. Perdagangan
internasional di bidang perikanan dan ekspor produk perikanan merupakan ekonom
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_19,
145
kegiatan di negara berkembang, terhitung lebih dari 10% dari total transportasi
pertanian pada tahun 2007. Selama lima dekade sebelumnya, produksi ikan
global telah berkembang pesat [3]. Untuk memastikan produktivitas akuakultur
jangka panjang, penggunaan produk alami berbasis bio dalam kesehatan hewan
akuatik dan pengelolaan penyakit menjadi semakin penting. Karena teknik ramah
lingkungan, hal ini dimungkinkan.
Produk alami berbasis bio ini dapat digunakan untuk menggantikan bahan kimia
sintetis di lingkungan. Proses ramah lingkungan digunakan dalam penciptaan
barang-barang alami tersebut, yang membantu dalam pemecahan masalah
lingkungan yang diciptakan oleh bahan kimia sintetik [4]. Hal ini diperlukan untuk
secara kompak menjangkar komponen menggunakan polisakarida termasuk
matriks biopolimer natrium kaseinat dan natrium alginat. Mengenkapsulasi bahan
kimia bioaktif dengan cara ini adalah pendekatan baru untuk mencegah
degradasi biologis dan oksidasi molekul [5]. Karakteristik bioaktif produk
mikroenkapsulasi dipertahankan untuk jangka waktu yang lebih lama. Bahan
kimia aktif yang diisolasi dari ekstrak rumput laut, yang dipilih karena kemampuan
antibakteri dan antioksidannya, diselidiki dalam penelitian ini untuk menentukan
efeknya [6, 7]. Mereka dimikroenkapsulasi dalam sistem biopolimer untuk menguji
sifat antibakteri dan faktor perangsang pertumbuhan terhadap penyakit yang
menyerang ikan dan udang, dengan tujuan meningkatkan kesehatan dan
ketahanan penyakit pada hewan [8, 9 ] . Pengembangan suplemen diet bioefektif
untuk digunakan dalam pakan ikan ini sangat efektif [10].
2 Bahan
2.1 Pengumpulan • Ganggang laut—ganggang laut coklat dan hijau.
Rumput Laut • Air sulingan.
dan Ikan
• Wadah dan stoples plastik. • Baki
Percobaan [11]
plastik. • Cawan
petri.
• Penggiling pengaduk.
• Penyaringan corong. •
Labu berbentuk kerucut.
• Benih yang sehat. •

Wadah kaca.
• Aerator.
• Tangki fiberglass.
• Tabung reaksi.
Penyiapan dan Perawatan Pakan Pelet Terenkapsulasi Rumput Laut di Perikanan... 147
2.2 Ekstraksi dari • Ekstrak mentah rumput laut.

Senyawa Aktif • Kromatografi kolom. • Gel silika.
[10, 12]
• Pelarut.
• Kertas penyerap.
3 Metode
3.1 Pembuatan • Kumpulkan rumput laut dan keringkan. •

Senyawa Bioaktif [10] Bedakkan sampel. •
Tambahkan 5 g rumput laut dengan 100 mL etanol. •
Simpan dalam shaker selama
24 jam. • Ambil kolom kaca.
• Kemas kolom silica gel (2×25 cm) dengan kapas. • Tambahkan
pelarut fase gerak sampai mencapai kapas. • Tambahkan
ekstrak ke dalam kolom.
• Kumpulkan setiap pecahan secara terpisah.
3.2 Enkapsulasi • Campurkan sodium caseinate dan xanthan gum dengan gliserol 1% dan air
Senyawa Aktif [10] Milli-Q. •
Tambahkan senyawa bioaktif yang telah dimurnikan ke dalam matriks
biopolimer dan campur
menjadi satu. • Lakukan pengadukan dengan
magnetic stirrer. •
Simpan selama 24 jam. • Teteskan matriks biopolimer ke dalam HCL 1 N
menggunakan spuit 5 mL. • Diamati pembentukan bead.
• Saring HCL menggunakan kain muslin. •

Kumpulkan manik-manik dan cuci tiga kali dalam air Milli-Q. •
Keringkan manik-manik semalaman pada suhu kamar.
3.3 Perlakuan Pakan • Tambahkan 1000 mL air ke dalam tangki kaca. •

[10] Simpan tiga tangki. •
Tambahkan lima ikan sehat di semua tangki. •
Suntikkan 20 ÿL pengenceran bakteri patogen (105 ) ke ikan menjadi dua
tank.
• Suntikkan 20 ÿL saline ke ikan di tangki lain.

• Dalam satu tangki (ikan yang disuntik patogen), tambahkan 1 g manik-manik

(diperlakukan).
• Di dua tangki lainnya, tambahkan pakan ikan biasa (kontrol). •

Amati hasilnya dan bandingkan antara kontrol dan perlakuan.
Referensi
1. Ma Q, Li LY, Le JY, Lu DL, Qiao F, Zhang ML 7. Thanigaivel S, Vickram S, Saranya V, Ali H,

et al (2018) Minyak mikroenkapsulasi diet Alarifi S, Kumar Reddy Modigunta J et al
meningkatkan fungsi kekebalan dan kesehatan (2022) Polisakarida rumput laut memediasi
usus pada ikan nila yang diberi diet tinggi lemak. tesis nanopartikel perak dan peningkatan
Akuakultur 496:19–29. https://doi.org/10. ketahanan terhadap penyakit pada
1016/J.AQUACULTURE.2018.06.080 2. Oreochromis mossambi cus. J King Saud
Van Doan H, Hoseinifar SH, Faggio C, Chitmanat Univ Sci 34:101771. https://doi.org/10.1016/
C, Mai NT, Jaturasitha S et al (2018) Efek J.JKSUS.2021. 101771
xylooligo sakarida turunan tongkol jagung 8. Willer DF, Aldridge DC (2019) Microencaps
pada respon imun bawaan, ketahanan sulated diets to improve bivalve shellfish
terhadap penyakit, dan pertumbuhan kinerja aqua culture for global food security. Glob
benih ikan nila (Oreochromis niloticus). Food Bagian 23:64–73. https://doi.org/10.1016/
Akuakultur 495:786–793. https://doi.org/ J.GFS. 2019.04.007
10.1016/j.aquaculture.2018.06.068 9. Jones DA, Holland DL, Jabborie S (1984)
3. Padmaja R, Pramanik S, Pingali P, Bantilan Status diet mikroenkapsulasi saat ini untuk
C, Kavitha K (2019) Memahami hasil gizi akuakultur. Sel Buatan Mikroenkapsulasi:
melalui analisis gender pola penggunaan 275–288. https://doi.org/10.1007/
waktu di semi-arid India. Glob Food Bagian 978-1-4612-5182-8_32
23:49–63. https://doi.org/10.1016/j.gfs. 10. Thanigaivel S, Chandrasekaran N, Mukherjee
2019.04.001 A, Thomas J (2019) Khasiat pelindung ekstrak
4. Lawlor JB, Gaudette N, Dickson T, House JD rumput laut mikroenkapsulasi untuk mencegah
(2010) Profil asam lemak dan sifat sensorik infeksi Aeromonas pada Oreochro mis
telur meja dari ayam petelur yang diberi mossambicus . Comp Biochem Physiol Bagian
ransum yang mengandung mikroenkapsulasi C Toxicol Pharmacol 218:36–45. https://doi.
minyak ikan. Anim Feed Sci Technol 156:97– org/10.1016/J.CBPC.2018.12.011
103. https://doi. org/10.1016/ 11. Peixoto MJ, Ferraz R, Magnoni LJ, Pereira R,
J.ANIFEEDSCI.2010.01.003 5. Magowan E, Gonçalves JF, Calduch-Giner J et al (2019)
McCann MEE, Beattie VE, McCracken KJ, Efek perlindungan dari diet suplemen rumput
Henry W, Smyth S et al (2010) Pengaruh laut pada respon antioksidan dan kekebalan
metode penambahan minyak diet pada diet pada seabass Eropa (Dicentrarchus labrax)
pellet terhadap performa dan kecernaan nutrisi yang mengalami infeksi bakteri. Sci Rep 9:1–
dalam menyelesaikan babi. Anim Feed Sci 12. https://doi.org/10.1038/s41598-019-
Technol 156:89–96. https://doi. org/ 52693-6
10.1016/j.anifeedsci.2010.01.002 6. Linke A, 12. Xu S, Zhang L, Wu Q, Liu X, Wang S, You C
Linke T, Kohlus R (2020) Kontribusi oksigen et al (2011) Evaluasi rumput laut kering Gra
internal dan eksternal terhadap oksidasi cilaria lemaneiformis sebagai bahan pakan
minyak ikan mikroenkapsulasi. Eur J Lipid Sci ikan teleost Siganus canaliculatus. Aquac Int
Technol 122:1900381. https://doi. org/10.1002/EJLT.201900381
19(5):1007–1018. https://doi.org/10.1007/
S10499-011-9418-Z
Bab 20
Perlakuan Menggunakan Rumput Laut pada Ikan dan Udang

dengan Metode In Vivo
R. Bharath, K. Karthikeyan, R. Vidya, and R. Sudhakaran
Abstrak
Wabah penyakit merupakan masalah serius di sektor budidaya, mempengaruhi perkembangan ikan dan udang.
Munculnya patogen pada udang dan ikan telah menyebabkan kerugian ekonomi yang signifikan dan berdampak
buruk pada industri akuakultur. Namun, tidak ada metode terapeutik yang efisien yang tersedia untuk
mengendalikan penyakit. Untuk mengendalikan kondisi penyakit pada udang dan ikan, penggunaan tanaman
obat, rumput laut, dan metabolit sekundernya menjadi penting. Suplemen makanan dengan rumput laut
memiliki kemampuan untuk meningkatkan respon imunologi dan fungsi fisiologis. Di sini, kami menjelaskan
bagaimana senyawa bioaktif dari rumput laut diisolasi dan digunakan sebagai pakan untuk hewan air.
Kata Kunci Ekstrak Rumput Laut, Hewan, Respon Imun, Antioksidan
1. Perkenalan
Rumput laut atau alga laut merupakan tumbuhan air laut yang menghuni
wilayah pesisir samudera dan lautan [1]. Ini adalah ganggang makroskopis
yang ditemukan menempel di dasar bebatuan, cangkang, dan bahan
tumbuhan lainnya. Ini merupakan sekitar 6000 spesies dengan keragaman
bentuk dan ukuran yang besar dan hanya 5% yang digunakan. Rumput
laut memiliki sumber senyawa bioaktif yang besar dan menghasilkan
metabolit sekunder yang menunjukkan berbagai fungsi biologis seperti
antibakteri [2], antijamur, antivirus, anti inflamasi, nematosidal, dan
antikoagulan [3, 4]. Berdasarkan pigmentasinya, mereka dibagi menjadi
tiga kategori, seperti Rhodophyta (ganggang merah), Chlorophyta
(ganggang hijau), dan Phaeo phyta (ganggang coklat). Permintaan
penggunaan rumput laut meningkat dalam satu dekade terakhir.
Akuakultur adalah industri produksi hewan yang tumbuh paling cepat.

Udang dan ikan adalah salah satu produk akuakultur yang paling banyak
diperdagangkan, terhitung sebagai salah satu kelompok spesies ekspor
terbesar dalam hal harga. Penyakit merupakan salah satu kendala utama dalam
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_20,
149
150 R. Bharath dkk.
pengembangan akuakultur, menghabiskan biaya bisnis lebih dari $6 miliar setiap

tahun. Perlunya pengurangan penggunaan bahan kimia menjadi perhatian
penting karena penerapan berbagai kemoterapi termasuk antibiotik memiliki
pengaruh buruk pada sistem kekebalan tubuh ikan dan udang [5]. Untuk
mengendalikan penyakit pada hewan air, beberapa strategi imunisasi termasuk
vaksin DNA dan vaksin rekombinan digunakan. Rute pemberian oral (pakan)
adalah rute pengiriman yang paling menonjol, tetapi hewan yang terinfeksi
mungkin kehilangan nafsu makan dan gagal menelan atau mencerna pakannya
secara memadai. Hal ini pada akhirnya menyebabkan pelepasan antibiotik ke
lingkungan melalui feses. Namun, pengembangan vaksinasi lebih mementingkan
keamanan daripada efektivitas. Tekanan yang meningkat untuk menghentikan
langkah-langkah pengelolaan penyakit tradisional tertentu mendorong petani
untuk mencari alternatif asli yang tidak berbahaya untuk mengobati dan
mencegah wabah penyakit. Dalam beberapa tahun terakhir, minat terhadap
rumput laut dan ekstraknya meningkat karena kemampuannya untuk meningkatkan
pertumbuhan, respon imunologi, dan ketahanan terhadap penyakit pada hewan
air. Rumput laut menunjukkan sumber aktivitas antimikroba yang hebat, tetapi
jumlah kemanjurannya berbeda menurut spesies.
Dibandingkan dengan antibiotik dan obat kimia lainnya, ekstrak rumput laut
hemat biaya dan mudah terurai secara hayati, dan mudah terdegradasi dalam
sistem akuakultur alami. Ekstrak yang diperoleh dapat berupa senyawa tunggal
maupun campuran dari dua senyawa yang berbeda. Penghantaran senyawa
yang diperoleh dari ekstrak terbukti lebih efektif bila disampaikan dalam bentuk
butiran yang dienkapsulasi [6].
2 Bahan
2.1 Pengumpulan • Rumput laut.
Rumput Laut • Penggiling.
• Wadah kedap udara.
2.2 Pembuatan Ekstrak • Bubuk rumput laut. •

Rumput Laut Petroleum eter.
• Aseton.
• Kloroform.
• Metanol.
• Inkubator.
• Whatman no. 1 kertas saring. •

Penguap vakum berputar.
Perlakuan Menggunakan Rumput Laut pada Ikan dan Udang dengan Metode In Vivo 151
2.2.1 In Vitro • Kapas steril.

Aktivitas antibakteri • Pemotong sumur steril.
• Piring agar. •
Ekstrak rumput laut.
2.3 Pengobatan Menggunakan • penyangga NTE.

Ekstrak Rumput Laut • Ekstrak rumput laut.
2.3.1 Bioassay • Ikan/udang.
2.4 Perlakuan Menggunakan • Makanan ikan.

Pakan Pelet • Kue minyak kacang tanah.
2.4.1 Persiapan • Bubuk kedelai.

Diet Rumput Laut
• Dedak gandum.
• Vitamin.
• Campuran mineral.
• Pengikat.
• Fraksi aktif rumput laut (SAF).
2.4.2 Jejak Makan • Pakan pelet.
• Ikan/udang.
2.5 Penentuan Parameter • 1 mL jarum.

Kekebalan Setelah
• Tabung mikrosentrifus 1,5 mL. •
Pemberian Senyawa
Antikoagulan (NaCl 0,45 M, glukosa 0,1 M, natrium sitrat 30 mM, asam sitrat 26
Bioaktif
mM, EDTA 10 mM pada pH 7,5).
2.5.1 Analisis Sampel

Darah
3 Metode
3.1 Pengumpulan • Kumpulkan rumput laut segar dan singkirkan kotoran dan garam yang ada di
Rumput Laut permukaan menggunakan air ledeng.
• Naungan mengeringkan sampel selama
72 jam. • Siapkan rumput laut kering menjadi bubuk halus dan simpan di tempat kedap udara
wadah untuk percobaan selanjutnya.
3.2 Pembuatan Ekstrak • Timbang 10 g bubuk rumput laut dan ekstrak menggunakan pelarut yang
Rumput Laut berbeda seperti petroleum eter, aseton, kloroform, metanol, dan air (1:100
b/v).
• Simpan dalam inkubator pengocok selama 24 jam pada suhu 37 C [7].
152 R. Bharath dkk.
• Lalu saring ekstraknya menggunakan whatman no. 1 kertas saring dan menguap
melalui rotary vacuum evaporator. • Untuk
menghitung rendemen kering sampel, tentukan rendemen kering ekstrak rumput

laut yang dihasilkan dengan menggunakan prosedur ekstraksi diferensial.
3.3 Aktivitas • Untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak rumput laut, agar
Antibakteri In Vitro teknik difusi sumur dapat dilakukan.
• Kapas lidi steril digunakan untuk menyebarluaskan inokulum
patogen bakteri pada 108 cfu/mL di atas pelat agar yang dipadatkan.
• Kemudian dengan menggunakan pemotong sumur steril, lubangi sumur berdiameter 8

mm ke dalam pelat agar.
• Tambahkan berbagai konsentrasi ekstrak rumput laut dan biarkan
berdifusi selama 2 jam.
• Kemudian inkubasi cawan pada suhu 37 C selama 24
jam. • Aktivitas antibakteri akan ditentukan dengan zona hambat tertinggi di sekitar
sumur [8, 9].
3.4 Pengobatan Menggunakan • Aktivitas antibakteri dan antivirus ekstrak rumput laut in vivo
Ekstrak Rumput Laut dapat diperiksa dengan injeksi intramuskular.
• Bagi hewan menjadi tiga kelompok dan lakukan penelitian
3.4.1 Bioassay
rangkap tiga.
• Kelompok 1 diinjeksi buffer NTE sebagai kontrol negatif; kelompok 2 disuntik

dengan 100 ÿL (5 ÿL patogen dan 95 ÿL buffer NTE) patogen yang berfungsi
sebagai kontrol positif; dan kelompok 3 diinjeksi dengan 100 ÿL (5 ÿL patho
gen, 20 ÿL ekstrak, dan 75 ÿL NTE buffer) patogen ditantang dengan ekstrak
1 mg/mL.
• Beri makan hewan dua kali sehari menggunakan yang tersedia secara komersial
pakan [10].
• CM% dapat dihitung dengan jumlah total hewan dalam kelompok kontrol dengan
jumlah total hewan dalam kelompok eksperimen dikalikan dengan 100 [11].
3.4.2 Analisis GC–MS • Untuk mengetahui komposisi kimia ekstrak rumput laut, serta keberadaan senyawa
Ekstrak Rumput Laut alami bioaktif, GC-MS dapat digunakan [12].
untuk Identifikasi Bioaktif
Senyawa
3.4.3 Analisis FTIR untuk • Untuk mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat dalam ekstrak rumput laut,
Identifikasi a Spektroskopi FTIR dapat dilakukan [13].
Kelompok fungsional
3.5 Perlakuan Menggunakan • Diet pelet mengandung tepung ikan 56%, bungkil kacang tanah 20,7%, bubuk
Pakan Pelet kedelai 11%, dedak gandum 6%, dan campuran vitamin dan mineral 2%,
minyak ikan cod 2%, dan pengikat 2% [14] . • Ekstrak pelarut
3.5.1 Persiapan Pakan
Rumput Laut fraksi aktif rumput laut (SAF) harus dimasukkan satu per satu ke dalam pengujian
pada konsentrasi berbeda yang dicampur dengan bahan dasar pada 100,
200, 300, dan 400 mg kg1 . • Menggunakan pelletizer pakan manual, pelet
pakan melalui
saringan
(2mm).
• Pada pakan kontrol, fraksi aktif rumput laut tidak ditambahkan. • Umpan
kemudian dapat dikeringkan dengan udara pada suhu 60 C selama 18 jam sebelum dikeringkan
dikemas secara individual dalam bejana yang sesuai.
3.5.2 Jalur Pakan • Menyuntikkan patogen secara intramuskular (IM) ke dalam udang atau ikan
dari kelompok eksperimen dan kontrol [15].
• Selama eksperimen tantangan, beri makan semua hewan
diet eksperimental yang relevan dua kali sehari.
• Lakukan penelitian dalam rangkap tiga dan untuk kontrol negatif normal
pakan harus diberikan.
• Kotoran dan kotoran harus dibuang setiap hari dengan air
menukarkan.
3.5.3 Pertumbuhan • Di akhir masa percobaan, perkirakan parameter pertumbuhan dengan cara
Pertunjukan membagi berat total hewan di setiap kandang jaring dengan jumlah hewan
[16].
• Variabel berikut dapat diperkirakan:
¼
Pertambahan berat badan (BB) (%) 100 (Wf Wi)/Wi.
¼
Laju pertumbuhan spesifik (SGR) (% hari1 ) 100 (lnWf lnWi)/t.
¼
Kelangsungan hidup (%) 100 Nt/No.
¼
Rasio konversi pakan (FCR) konsumsi pakan kering/(Wt Wo).
Rasio efisiensi protein (PER) 100 (Wt¼ Wo)/(I CNf).
3.6 Penentuan Parameter • Kumpulkan darah atau hemolymph dari hewan yang dipilih secara acak di
Kekebalan Tubuh Setelah setiap kelompok pada akhir percobaan. • Kumpulkan 0,5
Pemberian
mL darah dari setiap ikan melalui vena jantung
Senyawa tusukan dengan jarum 1 mL [17].
Bioaktif
• Pada udang keluarkan 0,5 mL hemolymph dari rongga sinus ventral masing-
3.6.1 Analisis Sampel masing udang. • Kemudian
Darah tambahkan sampel ke tabung berisi 0,5 mL larutan antikoagulan (0,45 M NaCl,
0,1 M glukosa, 30 mM natrium sitrat, 26 mM asam sitrat, 10 mM EDTA pada
pH 7,5).
154 R. Bharath dkk.
• Ukur THC (jumlah hemosit total), TPP (protein plasma total),

aktivitas fenoloksidase (PO), aktivitas peroksidase (POD), dan
aktivitas superoksida dismutase (SOD), dan simpan dalam suhu
20°C untuk studi lebih lanjut.
3.6.2 Analisis RT-PCR • Total RNA diekstrak dan diubah menjadi cDNA oleh
metode transkripsi terbalik [18].
• Ekspresi mRNA dari gen imun pada hewan yang diberi diet kontrol
dan eksperimen dapat dianalisis menggunakan real time PCR.
3.6.3 Analisis • Untuk analisis komparatif dari hewan sehat, terinfeksi, dan dirawat,
Histologis organ yang berbeda, seperti insang, hepatopankreas, otot, dll.,
dapat dikumpulkan dengan cara diseksi dan dapat digunakan
untuk pemeriksaan [19] .
Referensi
1. Leupp JL, Caton JS, Soto-Navarro SA, Lardy GP konsultasi dari Pulau Pasifik yang terpencil:
(2005) Pengaruh blok molase yang dimasak dan dampak gambar radiologi digital pada keputusan
ekstrak fermentasi atau inklusi tepung rumput laut rujukan. Pencitraan Digit J 17(4):253–257. https://
coklat pada asupan, pencernaan, dan efisiensi doi.org/10.1007/S10278-004- 1022-6
mikroba pada sapi jantan yang diberi jerami
berkualitas rendah. J Anim Sci 83:2938–2945. https://doi.org/10.
6. Elshobary M, El-Shenody R, Ashour M, Zabed H
2527/2005.83122938X (nd) Karakterisasi antimikroba dan antioksidan
2. Singh AP, Chaudhary BR (2010) Analisis fikokimia komponen bioaktif dari Chlorococcum minutum.
awal dan skrining antibakteri in vitro dari pithophora Bios makanan. Biosains, Undefined 2020. https://
oedogonia (Mont.) www. sciencedirect.com/science/article/pii/
Wittrock – alga hijau air tawar yang membentuk S2212429219306078. Diakses 30 Nov 2021 7.
tikar di badan air. J Biomassa Alga Utln 1:33–41 Zakaria N, Ibrahim D, Sulaiman S, Supardy A (nd)
Penilaian aktivitas antioksidan, kandungan fenolik
3. Caijiao C, Leshan H, Mengke Y, Lei S, Miansong total dan toksisitas in-vitro rumput laut merah Malay
Z, Yaping S, Changheng L, Xinfeng B, Xue L, Xin sian, Acanthophora spicifera.
L, Airong J (2021)
Studi perbandingan aktivitas antioksidan, Undefined 2011. Researchgate.Net. https://
penghambatan enzim pengonversi angiotensin dan www.researchga te.ne t/profile/Afi fah Supardy/
antikoagulan dari ekstrak metanol dari dua publication/286395213_Assess
ganggang coklat (Sargassum hor neri dan ment_of_antioksidan_activity_total_phenolic_
Sargassum thunbergii). Russ J Mar Biol 47(5):380– content_and_invitro_toxicity_of_Malaysian_
387. https://doi.org/10. red_seaweed_Acanthophora_spicifera/links/
1134/S1063074021050035 4. 572bd0fc08aef7c7e2c6b924/Assessment-of-
de Almeida CLF, Falcaõ H d S, Lima GR d M, antioksidan-keracunan-aktivitas-keracunan-dan-
Montenegro C d A, Lira NS, de Athayde-Filho PF, keracunan-tronik Malaysia -rumput laut merah-
Rodrigues LC, de Souza MFV, Barbosa Filho JM, Acanthophora-spicifera.pdf. Diakses 30 Nov 2021
Batista LM (2011 ) Bioaktivitas Alga Laut Genus
Gracilaria. Int J Mol Sci 12:4550–4573. https:// 8. Raghunathan G, Dhayanithi NB, Ajith Kumar TT,
doi.org/10. Kumaresan S (nd) Evaluasi aktivitas antibakteri
3390/IJMS12074550 5. dan imunostimulan rumput laut merah
Park JM, Ruess L, O'Connor SC, Hussain F, Oshiro Chondrococcus hornemannii (Kuetzing, 1847)
DY, Orang DA (2004) Internet terhadap ikan hias laut.
Undefined 2014. Researchgate.Net. https://www. re udang. Imunol Kerang Ikan 36:52–60. https://doi.org/
sea rchga te.ne t/profile/Dr-Nb Dhayanithi/publication/ 10.1016/J.FSI.2013.10.010 14. Abdelhamid AF, Ayoub
263651504_Evalua tion_of_antibacterial_activity_and_immuno
HF, Abd El-Gawad EA, Abdelghany MF, Abdel-Tawwab M
(2021) Potensi efek campuran pakan rumput laut
terhadap pertumbuhan performa, status antioksidan,
respon imunitas, dan ketahanan lele belang
(Pangasianodon hypophthal mus) terhadap infeksi
Aeromonas hydrophila.
Immunol Kerang Ikan 119:76–83. https:// doi.org/

10.1016/J.FSI.2021.09.043 15. Esquer-
Miranda E, Nieves-Soto M, Rivas-Vega ME, Miranda-Baeza
A, Pinã-Valdez P (2016)
Efek ekstrak makroalga metanol dari Caulerpa
sertularioides dan Ulva lactuca pada kelangsungan
hidup Litopenaeus vannamei di hadapan bakteri vibrio.
Immunol Kerang Ikan 51: 346–350. https://doi.org/
10.1016/J.FSI. 2016.02.028
stimulant_of_red_seaweed_Chondrococcus_hornemanni_Kuetzing1847_against_marine_ornamental_fish_pathogens/links/00b4953 b68fdf
16. Arizo MAM, Simeon EC, Layosa MJT, Mortel RMM,
10. Thanigaivel S, Vidhya Hindu S, Vijayakumar S, Pineda CMB, Lim JJE, Maningas MBB (2015) Crude
Mukherjee A, Chandrasekaran N, Thomas J (2015) fucoidan dari Sargassum poly cystum merangsang
Ekstraksi pelarut diferensial dari dua rumput laut dan pertumbuhan dan respon imun Macrobrachium
kemanjurannya dalam mengendalikan infeksi Aero rosenbergii terhadap white spot syndrome virus (WSSV).
monas salmonicida di Oreochromis mossambicus:
pendekatan terapi baru. AACL Bioflux 8. http://www.bioflux.com. ro/aacl.
Akuakultur 443:56–64. https://doi.org/10. Diakses 5 Jan 2022 17. Rama
1016/J.AQUACULTURE.2015.03.010 11. Kubilay
Nisha P, Elezabeth Mary A, Uthayasiva M, Arularasan S
A, Altun S, Ulukoy S, Ekici S, Diler O (2008) Imunisasi ikan (2014) Rumput Laut Ulva reticulata merupakan
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) terhadap suplemen pakan potensial untuk pertumbuhan,
Lactococcus garvieae menggunakan campuran vaksin. pewarnaan dan ketahanan penyakit pada ikan mas
Isr J Aquacult Bamidgeh 60:268–273. http://evols.library. hias air tawar, Carassius aur atus. J Aquac Res
manoa.hawaii.edu/handle/10524/19264 Diakses 30 Development 5(254):2 18. (PDF) Konfirmasi
Nov 2021
aktivitas anti-WSSV dari Red Algae Hypnae spinella pada
kepiting air tawar Paratelphusa hydrodomous (nd).
12. Thomas J, Jerobin J, Seelan TSJ, Thanigaivel S, https://www.researchgate.net/publication/2
Vijayakumar S, Mukherjee A, Chandrasekaran N (2013) 83509025_Confirmation_of_Anti-WSSV_
Studi tentang patogenesitas Aero monas salmonicida activity_from_Red_Algae_Hypnae_spinella_
pada ikan lele Clarias batrachus dan tindakan
in_freshwater_crab_Paratelphusa_ hydrodomous.
pengendalian dengan neem nanoemulsion. Diakses 5 Jan 2022 19. Thanigaivel S, Vijayakumar S,
Akuakultur 396–399:71–75. https://doi. org/10.1016/ Mukherjee A, Chandrasekaran N, Thomas
J.AQUACULTURE.2013. 02.024
J (2014) Antioksi dant dan aktivitas antibakteri Chaetomor
pha antennina terhadap patogen udang Vibrio
13. Wongprasert K, Rudtanatip T, Praiboon J (2014) parahaemolyticus. Akuakultur 433:467–475. https://
Aktivitas imunostimulan galaktan tersulfasi yang doi.org/10.1016/J.AQUACUL TURE.2014.07.003
diisolasi dari rumput laut merah Graci laria fisheri dan
perkembangan resistensi terhadap white spot syndrome
virus (WSSV) di
Bagian IV
Pengobatan Menggunakan Tanaman Obat

Bab 21
Pengobatan Menggunakan Tanaman Obat pada Ikan dan Udang
Vernita Priya, AT Manishkumar, K. Karthikeyan, and R. Sudhakaran
Abstrak
Ikan, seperti hewan lainnya, rentan terhadap berbagai penyakit. Penyakit merupakan faktor utama kematian
ikan, terutama pada ikan muda. Infeksi virus, infeksi bakteri, infeksi jamur, dan patogen lainnya dapat
menyebabkan penyakit pada ikan. Penggunaan obat antimikroba dalam akuakultur dapat menyebabkan
resistensi bakteri patogen. Alternatif pengganti antibiotik telah muncul dalam beberapa tahun terakhir dan
tanaman obat menjadi salah satu pilihan yang disediakan. Metabolit sekunder dan zat fitokimia yang ditemukan
pada tanaman ini menunjukkan sifat antimikroba pada ikan. Fakta bahwa mereka asli daerah tersebut memberi
mereka keunggulan, dan sebagian besar tanaman ini tidak berbahaya bagi manusia dan ikan. Bab ini merangkum
metode pengobatan menggunakan ekstrak tanaman sebagai alternatif jangka panjang dan sukses untuk
perawatan kimia dalam budidaya ikan.
Kata kunci Tanaman obat, Imunostimulan, Antibakteri, Antivirus, Antijamur, Antiparasit
1 Latar Belakang
Industri makanan yang tumbuh paling cepat adalah akuakultur; namun,

permintaan global akan membutuhkan peningkatan produksi sebesar 50% pada
tahun 2050. Setiap tahun, akuakultur berkembang lebih cepat, dan penyakit
yang paling umum di antara para pengelola tambak adalah penyakit ikan, yang
menyebar dengan cepat dan menyebabkan kerugian tak terkendali dan penutupan industri.
Sektor kepiting, di antara berbagai aspek budidaya, telah tumbuh secara
dramatis dalam beberapa tahun terakhir sebagai akibat dari permintaan pasar
global untuk krustasea [1].
Tumbuhan semakin banyak digunakan sebagai pengobatan untuk berbagai
penyakit, terutama yang di mana obat sintetik menyebabkan efek negatif.
Prevalensi penyakit meningkat dalam produksi akuakultur dan semakin intensif,
mengakibatkan kerugian ekonomi yang besar. Vaksinasi mahal untuk sejumlah
besar pembudidaya ikan, dan kelemahannya hanya efektif melawan satu infeksi.
Antimikroba dan obat hewan lainnya
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_21,
159
160 Vernita Priya dkk.
Ikasi umumnya digunakan sebagai profilaksis (untuk mencegah infeksi sebelum

timbul), terapi (untuk mengobati hewan yang sakit), dan pemacu pertumbuhan
dalam makanan ikan, mandi, dan injeksi [2].
Pengobatan tradisional sebagian besar didasarkan pada tanaman obat,
yang dikonsumsi oleh sekitar 3,3 miliar orang di negara-negara terbelakang.
Karena adanya komponen aktif seperti fenolik, flavonoid, dan lainnya, ekstrak
tanaman dalam akuakultur juga dapat menunjukkan berbagai aktivitas seperti
pengurangan stres, stimulasi nafsu makan, pemacu pertumbuhan, peningkatan
imunostimulan, aktivitas anti patogen, dan pematangan kultur. jenis. Karena
karakteristik antioksidan dan antibakterinya, ekstrak herbal menawarkan sifat
penting seperti pengendalian penyakit. Ekstrak tumbuhan diketahui memiliki
berbagai mode aksi karena kompleksitasnya [3].
Dalam akuakultur, penyakit bakteri merupakan masalah yang parah, dan

kadang-kadang antibiotik digunakan untuk mengobatinya. Bakteri adalah agen
patogen dengan dampak ekonomi terbesar. Penyakit bakteri membunuh
banyak ikan, baik di penangkaran maupun di alam liar, di seluruh dunia.
Penggunaan antibiotik secara teratur dapat menyebabkan resistensi bakteri
dan residu yang tidak diinginkan pada produk akuakultur dan lingkungan.
Infeksi bakteri pada ikan dan produknya dapat berdampak pada kesehatan
manusia, baik secara langsung dengan menimbulkan penyakit maupun
secara tidak langsung melalui sisa residu obat antimikroba dari pengobatan
infeksi pada ikan yang menyerang manusia. Strain bakteri yang resisten dapat
membahayakan pengobatan penyakit ikan dan lingkungan tambak ikan [3].
Budidaya ikan laut cukup menguntungkan di India. Munculnya penyakit
menular yang disebabkan oleh virus, yang mempengaruhi banyak spesies ikan
bernilai tinggi dan menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar,
merupakan salah satu risiko terbesar bagi bisnis akuakultur. Senyawa alami
nabati merupakan sumber penting untuk menemukan obat antivirus yang efektif.
Teknik yang paling signifikan untuk menguji kemanjuran pengobatan antivirus
adalah kultur sel hewan. Untuk diagnosa virus, beberapa garis sel ikan baru-
baru ini telah diproduksi [4].
Dalam kebanyakan kasus, jamur menginfeksi ikan sebagai akibat dari
faktor atau patogen lain, seperti kualitas air yang buruk, kondisi yang buruk,
trauma (penanganan yang kasar atau agresi), penyakit bakteri, atau parasit.
Jamur bisa berada di luar atau di dalam, dan bisa menyebar ke seluruh tubuh.
Jamur dapat mendatangkan malapetaka pada reproduksi dengan menginfeksi
telur yang telah dibuahi, misalnya. Dalam pakan yang disimpan dengan buruk,
spesies jamur tertentu dapat tumbuh subur dan menghasilkan mikotoksin.
Ikan air tawar dan air payau paling sering terinfeksi oleh jamur air, yang paling
umum dari semua infeksi jamur [5]. Agen jamur mendapat banyak perhatian
selama dekade terakhir, terutama pada populasi ikan liar.
Pengobatan Menggunakan Tanaman Obat pada Ikan dan Udang 161
2 Metode Soxhlet
2.1 Bahan – Bahan tanaman.

– Labu.
– Ekstraktor Soxhlet.
- Benang halus dari kaca.
2.2 Metode – Bahan tanaman segar atau bahan tanaman kering diambil.
– Jumlah bahan tanaman yang digunakan harus cukup untuk mengisi
bidal selulosa berpori.
– Pelarut (etanol) dipindahkan ke labu alas bulat.
– Di dalam ekstraktor Soxhlet, bahan tanaman yang dihancurkan ditempatkan.
– Glass wool diambil dan diletakkan di lengan samping ekstraktor Soxhlet.

Isomantle memanaskan pelarut, yang mulai menguap saat melewati
perangkat ke kondensor.
– Pelarut mencapai siphon dan mengalir kembali ke labu,
dan siklus diulang selama 16 jam.
– Setelah proses selesai, rotary evaporator digunakan untuk menguapkan
etanol, menyisakan sejumlah kecil bahan tanaman yang diekstrak
dalam labu dasar kaca (sekitar 2–3 mL) [6].
3 Pencernaan

– Penangas air/oven.
3.2 Metode – Ini adalah metode ekstraksi yang menggunakan panas ringan selama
proses ekstraksi.
– Pelarut yang telah diekstraksi ditempatkan dalam wadah bersih, dengan
bahan obat bubuk.
– Pada suhu sekitar 50 C, adonan dimasukkan ke dalam
mandi air.
– Sepanjang prosedur ekstraksi, panas diperlukan untuk mengurangi

viskositas pelarut ekstraksi dan meningkatkan pembuangan metabolit
sekunder.
- Bahan tanaman yang mudah larut digunakan.
– Filtrasi dan dekantasi dilakukan untuk memisahkan
ekstrak [7].
4 Ekstraksi Pewarna Tanaman
– Kain keju/kapas/kertas penyaring.
4.2 Metode - Bagian tanaman yang berbeda yang digunakan untuk pembuatan pewarna adalah
diambil.
– Bagian tanaman dikumpulkan dan dikeringkan di tempat teduh atau di bawah sinar matahari sebelumnya
ekstraksi.
– Homogenkan menggunakan alat gerinda manual atau elektrik untuk memecahnya

menjadi potongan atau bubuk yang sangat kecil.
– Kondisi ekstraksi optimal ditentukan oleh berbagai parameter ekstraksi seperti jenis
pelarut, waktu ekstraksi, rasio bahan tanaman terhadap pelarut, suhu, dan pH,
yang semuanya bergantung pada sifat komponen pewarna tertentu.
– Setelah ekstraksi, saring filter ekstrak menggunakan kain katun tipis,

kapas, atau filter kertas [7].
4.3 Sumber dari Tumbuhan obat dengan bagian yang berbeda seperti daun, rimpang, akar, buah, kulit
Tanaman Obat kayu, biji, dan umbi digunakan untuk mengekstrak berbagai metabolit sekunder dan
senyawa fitokimia seperti alkaloid, flavonoid, dan tanin [8] .
4.4 Persiapan Pakan – Pakan kering (dengan kadar air akhir 6–10%), semi-lembab (dengan 35–40%), atau
Ikan basah (dengan kadar air 50–70%).
Formulasi – Bergantung pada kebutuhan pakan ikan, pelet akan dimodifikasi menjadi tenggelam
atau mengapung [8].
– Bahan pakan dicampur selama 5 menit sebelum menambahkan 200 mL kg1

air dan pencampuran selama 5 menit lagi.
– Campuran tersebut kemudian dibentuk menjadi struktur seperti bola dan otomatis
clave selama 45 menit.
– Setelah autoklaf, ramuan herbal harus benar-benar bersih

campuran [9].
– Pakan kering berbentuk silinder akan dikemas dalam kantong plastik dan disimpan
di tempat yang sejuk dan gelap.
– Pemberian pakan ikan dilakukan dengan takaran 3% dua kali sehari dalam percobaan
pemberian pakan selama 8 minggu. Tepi sirip akan berkembang dan menghancurkan lebih
banyak jaringan dari waktu ke waktu [10].
4.5 Administrasi dari Teknik pemberian jamu untuk mencegah dan mengobati berbagai penyakit ikan ini
Tanaman Obat di dinyatakan tidak berbahaya mencemari lingkungan atau merugikan ikan dan manusia.
Akuakultur
– Obat herbal yang diberikan pada ikan dan kerang melalui injeksi (intramuskular atau
intraperitoneal), pemberian oral, dan perendaman atau mandi [11].
– Teknik pemberian tanaman obat yang paling umum adalah melalui pemberian oral.
Infeksi bakteri dapat diobati dengan memasukkannya ke dalam makanan ikan.
– Dosis terapeutik atau pencegahan harus dihitung dengan menggunakan tanaman obat
dan jumlah ikan yang ditelan [12].
– Memandikan ikan dengan berbagai larutan tanaman obat juga bisa memberikan hasil
yang positif. Berbagai ekstrak tumbuhan dapat mengobati infeksi bakteri dan jamur
dengan merendam ikan di dalamnya. Dosis terapeutik atau pencegahan harus
dihitung dengan menggunakan tanaman obat dan jumlah ikan yang tertelan.
– Injeksi intraperitoneal adalah cara paling efektif untuk memberikan dosis yang tepat.
Suntikan dengan cepat meningkatkan kadar zat antibakteri dalam darah dan jaringan
[12].
– Tumbuhan obat dapat digunakan sendiri atau dikombinasikan dengan trace element
dan probiotik untuk mengobati penyakit ikan [12].
– Mandi sering digunakan untuk mengobati ektoparasit. Akibatnya, pengobatan oral

adalah alternatif yang baik untuk akuakultur, karena tanaman obat dapat
meningkatkan kesehatan ikan dan ketahanan terhadap penyakit.
4.6 Bakteri Dalam akuakultur, penyakit bakteri merupakan masalah yang parah, dan antibiotik
Penyakit Ikan dan terkadang digunakan untuk mengobatinya. Penggunaan antibiotik secara teratur dapat
Udang menyebabkan resistensi bakteri dan residu yang tidak diinginkan pada produk akuakultur
dan lingkungan.
5 Bahan dan Metode
5.1 Persiapan Ekstrak – Eclipta alba digunakan.

Herba – Untuk memfasilitasi kelarutan yang mudah dari ekstrak herbal dalam pengujian
antibakteri, ekstrak kasar selanjutnya diproduksi sebagai butiran kompleks
menggunakan polivinilpirolidon (PVP) [13].
5.2 Antibakteri – Pengujian antibakteri dilakukan dengan menggunakan pengenceran pelat agar Tragen
Tes metode.
– Ekstrak jambu biji akan dibuat dalam rangkaian pengenceran dua kali lipat yang
memberikan nilai mulai dari 0,625 hingga 10 mg/mL.
– Untuk mengurangi inokulum pelat uji, prakultur dalam kaldu kedelai tryptic selama 18
jam pada suhu 30 C. Dua persen NaCl ditambahkan sebagai suplemen.
– Sebelum melapisi pelat uji, kaldu prakultur (0,1 mL) dicampur dengan 1 mL kaldu
yang sama.
– Aktivitas antibakteri akan diuji dengan melihat perkembangan bakteri setelah
inkubasi pada suhu 30 C selama 24 jam [13].
5.3 Efisiensi 10 mg/mL ekstrak dari E. alba dapat sepenuhnya menghambat semua
Herbal mikroorganisme yang diuji (100%). Satu (8,3%) dan sepuluh (83,3%) dari strain
yang diteliti dapat ditekan dengan konsentrasi masing-masing 2,5 dan 5 mg/mL.
Tumbuhan ini dapat mencegah Macrobrachium rosenbergii dari infeksi Aeromonas
hydrophila [13].
5.4 Penyakit Viral dari – Menggunakan jarum suntik steril, diambil hemolymph udang yang terinfeksi
Ikan dan Udang langsung dari hati.
- Centrifuge hemolymph pada 3000g selama 20 menit pada 4 C.
5.4.1 Persiapan
Inokulum Virus – Supernatan akan disaring melalui filter 0,4 m setelah disaring
disentrifugasi pada 8000g selama 30 menit pada 4 C.
– Simpan filtrat pada suhu 20 C untuk pengujian infektivitas [14].
5.4.2 Persiapan Tanaman obat Cynodon dactylon yang sebelumnya dilaporkan memiliki aktivitas
Ekstrak Tumbuhan antivirus dapat digunakan.
– Tanaman dikeringkan dan ekstraksi dilakukan secara terpisah dengan petro

leum eter, benzena, dietil eter, kloroform, etil asetat, metanol, etanol, dan air
suling menggunakan alat Soxhlet.
– Ekstrak kasar akan disaring menggunakan kertas saring Whatman No. 1 sebelum
dikeringkan dalam vacuum evaporator pada suhu 40 C dan 25–30 mm Hg.
– Ekstrak kasar (100 mg) dicampur dalam 0,2 mL aseton sebelum dicampur
dengan 0,8 mL air suling pada 1000 ppm.
– Pada tes akhir, polisorbat 80 (Tween 80) digunakan dengan ekstrak. Ekstrak
kontrol negatif terdiri dari campuran aseton dan polisorbat 80 [14].
5.4.3 Penentuan – Untuk bioassay, 30 ÿL suspensi virus, ekstrak tumbuhan, dan buffer NTE (0,2 M
Aktivitas Antivirus NaCl, 0,02 M Tris–HCl, dan 0,02 M EDTA, pH 7,4) disuntikkan secara
intramuskuler ke dalam udang atau kepiting air tawar (lima hewan per tangki)
(suspensi virus 5 L, ekstrak tumbuhan 10 L dengan konsentrasi bervariasi (100
atau 150 mg/kg berat badan hewan), dan buffer NTE 15 L).
– Campuran 25 ÿL buffer NTE dan 5 ÿL suspensi virus digunakan sebagai kontrol

positif, yang akan dikombinasikan dengan ekstrak tanaman dengan dosis
bervariasi.
– Sebelum injeksi simpan pada suhu 29 C selama 3 jam.
- Kombinasi diberikan secara intramuskular ke hewan percobaan

setelah 3 jam.
– Setelah infeksi, percobaan akan dilakukan hingga
30 hari. Catat hasilnya [14].
Referensi
1. Ghosh AK, Panda SK, Luyten W (2021) Aktivitas anti 29 Januari. PMID: 32801594; PMCID: PMC7398001
vibrio dan peningkatan kekebalan tanaman obat pada
udang: tinjauan komprehensif. Immunol Kerang Ikan 8. Pandey G (2013) Formulasi pakan dan teknologi
117:192–210.
pakan ikan. Int Res J Pharm 4(3): 23–30. https://
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2021.08.006 2. Reverter .
doiorg/1 0 . 7 8 9 7 / 2230-8407.04306
M, Bontemps N, Lecchini D, Banaigs B, Sasal P (2014)
Penggunaan ekstrak tumbuhan dalam budidaya ikan 9. Sinha A, Mondal C, Santra S. Eksplorasi sumberdaya
sebagai alternatif terapi kemo: status saat ini dan kanal untuk pengembangan perikanan di Sunderbans
perspektif masa depan. (WB) dan Punjab. Aquaculture Asia, hal 3–8.
Akuakultur 433:50–61. https://doi.org/10. 1016/ www.ijltemas.in 10. Santra S,
j.aquaculture.2014.05.048 3.
Sinha A, Mondal C (2017) Pengaruh Tumbuhan Jamu
Muniruzzaman M, Chowdhury MBR (2009) (Tulsi) terhadap Penyakit Umum pada Ikan Mas,
Sensitivitas bakteri patogen ikan terhadap berbagai Carassius auratus (Linn. 1758).
tanaman obat. Bangladesh J Vet Med 2. https://doi.org/ International Journal of Latest Technology in
10.3329/bjvm.v2i1.1941 4. Krishnan K, Khanna VG, Engineering, Management & Applied Science
Hameed S (2010) (IJLTEMAS) 6:29–31 11.
Aktivitas antivirus dasyscyphin C yang diekstraksi dari Ramudu KR, Dash G (2013) Kajian tentang obat herbal
Eclipta prostrata terhadap nodavirus ikan. J Antivir terhadap patogen berbahaya dalam akuakultur. Am J
Antiretrovir 2(1):29–32. https://doi. org/10.4172/ Drug Discov Dev 3(4): 209–219
jaa.1000018 5. RPE Yanong
(2003) Penyakit jamur pada ikan. 12. Stratev D, Zhelyazkov G, Noundou XS, Krause RWM
Klinik Dokter Hewan Utara Am Exot Anim Pract 6(2): (2018) Efek menguntungkan dari tanaman obat pada
377–400. https://doi.org/10.1016/S1094- penyakit ikan. Aquacult Int 26(1): 289–308. https://
9194(03)00005-7 6. doi.org/10.1007/s10499- 017-0219-x
Redfern J, Kinninmonth M, Burdass D, Verran J (2014)
Menggunakan ekstraksi etanol soxhlet untuk 13. Direkbusarakom S, Ezura Y, Yoshimizu M, Herunsalee
memproduksi dan menguji bahan tumbuhan (minyak A (1998) Khasiat ekstrak herbal tradisional Thailand
atsiri) untuk sifat antimikroba mereka. J Mikrobiol Biol terhadap bakteri patogen ikan dan udang. Fish Pathol
Pendidikan 15(1):45–46. https://doi.org/10. 1128/ 33:437 14. Balasubramanian G, Sarathi M,
jmbe.v15i1.656 7. Kumar SR, Hameed ASS (2007) Skrining aktivitas antivirus
Abubakar AR, Haque M (2020) Penyiapan tumbuhan tanaman obat India terhadap virus sindrom bintik putih
obat: prosedur dasar ekstraksi dan fraksiasi untuk pada udang. Akuakultur 263(1–4):15–19. https://
tujuan percobaan. J Pharm Bioallied Sci 12(1):1–10. doi.org/10. 1016/j.aquaculture.2006.09.037
https://doi. org/10.4103/jpbs.JPBS_175_19. Epub
2020
Bab 22
Penyiapan Pakan dan Karakterisasi Pakan

Dilengkapi dengan Phytocompounds
N. Chandra Mohana, AM Nethravathi, Raghu Ram Achar,
KM Anil Kumar, dan Jalahalli M. Siddesha
Abstrak
Akuakultur telah menjadi terkenal secara global dalam beberapa tahun terakhir terutama dalam produksi ikan dan udang.
Lonjakan permintaan yang meningkat telah menyebabkan peningkatan pesat dalam beberapa implementasi penyiapan akuakultur.
Namun, hal itu juga telah meningkatkan risiko wabah penyakit yang mengarah ke angka kematian massal yang disebabkan
oleh bakteri, virus, dan jamur. Juga, penggunaan antibiotik yang tidak tepat yang menyebabkan resistensi pada patogen
mikroba merupakan ancaman yang meluas. Oleh karena itu, penyiapan dan karakterisasi pakan menggunakan tanaman
etnomedisinal dapat memberikan bantuan untuk persyaratan saat ini dalam akuakultur. Formulasi pakan dengan menganalisis
kebutuhan nutrisi yang dilengkapi dengan pakan nabati etnomedisin akan menguntungkan akuakultur dalam menghadapi resistensi antibiotik.
Formulasi pakan menggunakan pakan nabati akan membayangkan solusi alami untuk infeksi bersama dengan keberlanjutan
ekonomi dengan pakan murah untuk industri akuakultur yang sedang tumbuh.
Kata Kunci Akuakultur, Pakan, Tumbuhan Obat, Antimikroba, Phytocompounds
1. Perkenalan
Dalam hal spesies, metode pertanian, dan keadaan lingkungan,

akuakultur adalah praktik pertanian yang paling beragam di dunia.
Pertanian akuatik adalah sektor pertanian yang berkembang pesat untuk
produksi makanan berprotein tinggi dengan ikan dan kerang diproduksi
secara luas secara global [1, 2]. Ikan telah lama dikenal sebagai sumber
protein berbiaya rendah dan berkualitas tinggi, dengan permintaan dan
konsumsi yang meningkat di beberapa negara berkembang [3]. Tidak
mungkin menghitung dengan tepat jumlah total spesies yang
dibudidayakan dan sejauh mana mereka dibudidayakan; biasanya,
laporan yang menyertakan angka tersebut terbatas dan tidak akurat.
Tantangan utama bagi pembudidaya ikan adalah membudidayakan
ikan berproduksi tinggi dan ikan budidaya tahan penyakit [4]. Selain itu,
mahalnya pakan ikan berkualitas tinggi menjadi salah satu hambatan
pengembangan akuakultur. Dengan wabah penyakit meningkat sejalan dengan
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_22,
167
168 N. Chandra Mohana dkk.
Perluasan budidaya intensif, kebutuhan pakan ikan murah dengan atribut

multifungsi adalah kebutuhan saat ini. Penggunaan obat antimikroba yang tidak
tepat dalam budidaya ikan memperburuk masalah resistensi antibiotik global [5].
Meningkatnya permintaan akan protein hewani untuk penggunaan manusia telah
menghasilkan peningkatan yang mengkhawatirkan dalam kebutuhan akan obat-
obatan yang menyelamatkan nyawa dalam sistem produksi hewan modern ini.
Karena munculnya resistensi antibiotik pada bakteri, yang mengancam untuk
membatalkan sebagian besar kemajuan medis yang dibuat pada dekade
sebelumnya, jumlah antimikroba yang tersedia untuk pengobatan penyakit menjadi
semakin terbatas, mahal, dan, dalam beberapa kasus, tidak tersedia.
Menurut temuan penelitian tersebut, kurangnya pengendalian penyakit yang agresif

telah merugikan produksi ikan dalam jangka panjang [6].
Antimikroba terutama telah digunakan dalam akuakultur untuk tujuan
terapeutik dan pencegahan [7]. Dengan antibiotik yang sepenuhnya dilarang
sebagai aditif pakan di Uni Eropa karena kekhawatiran bahwa mereka dapat
berkontribusi terhadap resistensi bakteri atau membahayakan kesehatan manusia
melalui residu produk sampingan hewan, ada kebutuhan untuk alternatif alami [8] .
Sumber daya alam, seperti jamu, telah digunakan untuk mengobati berbagai
macam penyakit manusia selama ribuan tahun. Banyak senyawa aktif dengan
bioaktivitas potensial telah diidentifikasi.
Akibatnya, telah terjadi lonjakan minat dalam menggunakan tanaman obat

dalam akuakultur untuk memberikan alternatif yang aman dan dapat diterima
lingkungan untuk antibiotik dan senyawa kimia, serta untuk meningkatkan fungsi
kekebalan dan mengendalikan penyakit ikan. Tumbuhan, biji-bijian, dan rempah-
rempah digunakan sebagai imunostimulan dalam berbagai bentuk, termasuk
bahan mentah, ekstrak, campuran, dan bahan kimia aktif, menghasilkan
peningkatan yang signifikan dalam sistem kekebalan ikan, memungkinkan mereka
untuk menghindari dan mengendalikan penyakit mikroba. Segmen tanaman seperti
biji, akar, bunga, dan daun juga menunjukkan berbagai tingkat aktivitas. Seperti
yang diukur dengan peningkatan parameter imunologi, tanaman obat ditemukan
untuk meningkatkan respon imun seluler dan humoral. Saat disuntikkan, direndam,
atau diminum, tanaman obat telah terbukti meningkatkan sistem kekebalan tubuh
ke berbagai tingkat dan jumlah. Namun, menentukan dosis optimal untuk
meningkatkan sistem kekebalan ikan sambil menghindari imunosupresi sangatlah
penting. Tumbuhan obat tertentu telah berhasil digunakan untuk menggantikan
protein dalam tepung ikan sebagai sumber protein yang murah.
Tumbuhan obat dapat berfungsi sebagai imunomodulator dan perangsang

pertumbuhan [9].
2 Bahan
(i) Protein (asam amino esensial). (ii)

Karbohidrat (gula, pati).
Penyiapan Pakan dan Karakterisasi Pakan Tambahan... 169
(iii) Lipid (lemak, minyak, asam lemak). (iv)
Vitamin. (v)
Mineral. (vi) Obat:
ekstrak tumbuhan/phytocompounds. (vii) Pelarut berair dan
organik. (v iii) Peralatan pelet.
3 Metode
3.1 Persiapan Pakan Pengendalian infeksi mikroba dalam akuakultur secara tradisional dilakukan dengan
yang Dilengkapi penerapan agen antimikroba dalam akuakultur. Berkaitan dengan hal tersebut, maka
dengan Phytocompounds dikembangkan feed obat dengan menggunakan tanaman obat [5]. Tumbuhan obat
dan ekstrak dengan aktivitas anti bakteri, antivirus, dan antijamur pada ikan dan
udang telah dicantumkan pada Tabel 1, dan langkah-langkah yang terlibat dalam
persiapan dan karakterisasi pakan telah digambarkan pada Gambar. 1.
Persiapan Ekstrak Air [10]
• Timbang dan larutkan bahan tanaman dalam 100 mL air. • Larutan berair
dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80 C selama

15 menit.
• Campuran kemudian dibiarkan mendingin hingga suhu kamar sebelumnya

disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit.
• Filtrat larutan supernatan dikumpulkan dan dicampur

pakan ikan.
Persiapan Ekstrak Alkohol [11]
• Dalam 100 mL EtOH/MeOH, bahan tanaman yang dikeringkan dengan udara digiling
terguncang.
• Larutan alkohol dipanaskan selama 48 jam pada suhu 40 C.
• Kertas saring (Whatman No. 1/4) digunakan untuk menyaring bahan yang tidak larut,
yang kemudian diuapkan hingga kering pada suhu 40 C dengan penurunan
tekanan. • Timbang
ekstrak dan gabungkan dengan pakan ikan.
Persiapan Pakan Ikan Padat [12]
• Bahan tanaman dicuci bersih, dibilas, dan dipotong kecil-kecil

bagian-bagian.
• Bahan tanaman ditimbang, dan diperoleh pasta dengan bantuan alat penghomogen.
Tabel 1
Tanaman obat menunjukkan aktivitas antimikroba dalam akuakultur
Nama tanaman Nama mikroorganisme
Vitis adnata (minyak esensial) Salmonella pullorum
Cymbopogon sitrat (minyak) Shigella flexneri, Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae
Chamaesyce hirta Shigella flexneri
Ipomea fistulosa (ekstrak etanol) Streptococcus faecalis
Jus kubis Staphylococcus aureus
Anacardium occidental Staphylococcus aureus, Serratia marcescens
Bhallatakasava dan Sukshma Triphala Clostridium titani
Minyak kayu putih Mycobacterium avium
Centella asiatica Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Psendomonas cichorii
Terminalia bellerica, Garcinea gummigulla, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia

Anisomeles malabarica, Aegle marmelos, coli, Pseudomonas aeruginosa
Alangium saluifolium, dan Zizyphus jujuba
Azadirachta indica Mycobacterium tuberculosis, Streptomycin resisten

strain
Tempat suci Ocimum Escherichia coli, Bacillus anthracis, Mycobacterium

tuberkulosis
Gloriosa hebat (ekstrak daun) Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Klebsiella

pneumoniae, Escherichia coli
Triphala churna, Hareetaki churna dan Dashmula Staphylococcus epidermidis, Proteus vulgaris,
churna Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi
Moringa oleifera (ekstrak daun) Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus

aurens, Mycobacterium phlei
Calotropis procera (Ekstrak etanol) Enterobacter cloacae, Fusarium moniliforme
Vasica Adhatoda Pseudomonas fluorescens
Pericarpium granati, Rhizoma sanguisorbae, Fructus Vibrio alginolyticus

schizandrae, Rheum officinale
Acorus calamus, Indigofera aspalathoides Aeromonas hidrofila
Ulva fasciata Vibrio parahaemolyticus
Allium sativum, biji Magnifera indica, Aeromonas hidrofila

Azadirachta indica
ekstrak nimba Virus Vaccinia, Chikungunya, Campak dan

Virus Coxsackie
(lanjutan)
Tabel
1 (lanjutan)
Nama tanaman Nama mikroorganisme

Maclura cochinchinensis, Centella asiatica, Virus herpes simpleks
Mangifera indica, Cynometra cloiselli, C.
madagascariensis, Ravensara retusa,
Evonymopsis longipes, Terminalia monoceros,
ekstrak Acorus calamus
Syzygium kurzi, Syzygium megacarapum (ekstrak) Ensefalitis menyebabkan virus
Scilla hyacianthiana, Dillemia pomifera, Smilax Semilike Forest Virus (SFV), Virus Penyakit Ranikhet
perfoliadour, Rosa osmastonii (ekstrak) (RDV)
Cyanodon dactylon, Aegle marmelos, Virus sindrom bintik putih (WSSV) ditantang
Tinosporacordifolia, Picrorhiza kurooa, Eclipta alba Penaeus monodon
Ocimum sanctum (ekstrak) Properti anti-virus
Geranium sanguineum (ekstrak polifenol) Berbagai strain manusia, unggas dan Equine
Virus flu
Hyptianthera stricta (Ekstrak etanol) Encephalomyocarditis dan Japanese Encephalitis

virus
Obat anti WSSV (MP07X) berasal dari laut WSSV menginfeksi tanaman Litopenaeus
vannamei dan (TP22C) yang berasal dari tanaman terestrial
Obat anti-WSSV (TP22C) berasal dari terestrial WSSV menginfeksi Litopenaeus vannamei
tanaman
Fructus prunusis Penyakit insang hitam pada tambak udang

Platanus orientalis disebabkan oleh Fusarium
oxysporum
Helenium quadridentatum (ekstrak) saprolegniasis pada ikan
Daun mimba (ekstrak), minyak dan bijinya Trichophyton, Epidermophyton, Micsporum,

Trichosporon, Geotirkum, Candida
Deuteromycetes
Minyak kunyit Jamur dermatofita, Trichophyton rubrum
Chenopodium ambrosioides Trychophyton mentagrophytes, Microsporum

audouinii
Ekstrak siung bawang putih Fusarium solani
Ekstrak daun bauhinia variegate Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger
Nelumbo nucifera Aktivitas anti-jamur dan anti-ragi yang kuat
Eucalyptus citriodora, Eucalyptus dalrympleana, Dermatofita

Eucalyptus laveopinea (minyak esensial)
Eucalyptus citriodora Pyricularia grisea
Diadopsi dari Raman [16]

Gbr. 1 Gambaran komponen pakan, penyiapan, dan karakterisasi
• Ekstrak halus dengan partikulat berserat disaring dengan kain kasa halus dilanjutkan
dengan penyaringan menggunakan kertas saring Whatman 541.
• Ekstrak kasar dikumpulkan dan disimpan pada suhu 10 C.
Formulasi Pakan Ikan dengan Phytocompounds atau Tumbuhan

Ekstrak [13]
• Berbagai metode untuk mengintegrasikan obat berbeda tergantung pada jenis

pakannya. Tumbuhan obat/ekstrak dan senyawa fito dengan aktivitas
antimikroba dalam akuakultur terdaftar dengan organisme menular targetnya
pada Tabel 2 dan 3. • Pelet kering dapat diencerkan dalam air atau minyak
sebelum ditaburkan
atas makanan [13].
• Untuk membuat pelet lembab, obat harus dicampur dengan bahan lain dalam
makanan sebelum ekstrusi. • Kedua situasi mengharuskan obat didistribusikan
secara merata dan dimasukkan ke dalam makanan terakhir.
• Untuk membatasi kemungkinan pencucian obat, bisa berupa pelet

dilapisi atau dikeringkan.
• Pakan obat harus diumpankan ke kandang jaring tepat waktu dan

bahkan cara.
• Hanya ikan aktif yang akan melahap makanan jika didistribusikan secara perlahan;
ikan yang sakit dan tidak aktif akan mati kelaparan.
• Pakan harus diberikan dalam rasio yang sesuai dan pada dua atau lebih pemberian
makan setiap hari untuk memastikan penerimaan terus menerus.
Meja 2
Molekul antimikroba dipelajari untuk aktivitas antiparasitnya untuk akuakultur
Sumber (nama Tuan rumah (nama

Fitokonstituen botani) Parasit umum) Referensi
Allicin Allium sativum Neobenedenia sp. Calcarifer akhir [17]
(Barramundi)
Bruceine A Brucea javanica Dactylogyrus Carassius auratus [18]
dan Bruceine D intermedius (Ikan mas)
Chelerythrine Chelidonium majus Ichthyophthirius multifiliis Ctenopharyngodon [19]

Idella (Ikan mas rumput)
Chelerythrine dan Toddalia asiatica Ichthyophthirius Carassius auratus [20]

Chloroxylonine multifiliis (Ikan mas)
Dihydrosanguinarine Macleaya microcarpa Ichthyophthirius Kurikulum [21]

dan multifiliis Squaliobarbus
dihydrochelerythrine (Barbel chub)
Diosin dan polifilin polifil paris Dactylogyrus Carassius auratus [19]

D intermedius (Ikan mas)
Asam ginkgolat (C13:0 Ginkgo Biloba Pseudodactylogyrus Anguilla (Umum [22]

dan C15:1) belut)
Gracillin dan Trillin Dioscorea Dactylogyrus Carassius auratus [23]

zingiberensis intermedius (Ikan mas)
Osthol dan Fructus cnidii Dactylogyrus Carassius auratus [24]
isopimpinellin intermedius (Ikan mas)
Osthole Radix angelicae Dactylogyrus Carassius auratus [25]
pubescentis intermedius (Ikan mas)
pentagalloilglukosa Galla chinensis Ichthyophthirius Ictalurus punctatus [26]

multifiliis (Lele saluran)
Piperin Piper longum Argulus spp. Carassius auratus [27]

(Ikan mas)
Sanguinis Mikrokarpa Macleaya Dactylogyrus Carassius auratus [28]

Macleaya cordata intermedius (Ikan mas)
Ichthyophthirius Ctenopharyngodon
multifiliis idella (ikan mas rumput)
Bahan bubuk dikeringkan pada 70-100 C dalam oven selama 24

jam. Bahan-bahan ditimbang satu per satu dan dicampur secara
menyeluruh menggunakan hand mixer. Komposisi campuran
mengalami densifikasi menjadi pelet. Pelet tunggal diproduksi
menggunakan peralatan pembuatan pelet Pelet kemudian disimpan
dalam wadah plastik tertutup pada suhu 4 C hingga digunakan [14].
Sedangkan cara aplikasi phytocompounds didasarkan pada sifat
budidaya yang dilakukan sebagai berikut:
Tabel 3
Ekstrak tumbuhan antimikroba dipelajari aktivitas antiparasitnya untuk akuakultur
Sumber (nama Tuan rumah (nama

Jenis ekstrak botani) Parasit umum) Referensi
Ekstrak air Cinnamomum cassia Dactylogyrus Carassius auratus [29]

intermedius (Ikan mas)
Ekstrak air Capsicum frutescens Ichthyophthirius Carassius auratus [30]

multifiliis (Ikan mas)
Ekstrak air Camellia sinensis Trichodina sp. Oreochromis [31]

niloticus (Nil
tilapia)
Ekstrak mentah Allium sativum dan Trichodina sp. Oreochromis [32]
Terminalia catappa niloticus (Nil
tilapia)
Siung bawang putih yang Allium sativum Trichodina sp. Oreochromis [33]
dihancurkan Gyrodactilus sp. niloticus (Nil
tilapia)
Minyak esensial Melaleuca alternifolia Uronema sp. Pampus argenteus [34]
Ichthyophthirius (Bawal perak)
multifiliis Piaractus
mesopotamicus
(Paku)
Minyak esensial Origanum Myxobolus sp. Diplodus puntazzo [35]
minutiflorum (Ikan ikan air tawar
kepala domba)
Ekstrak etanol Artemisia tahun Monogenea Heterobranchus [36]

longifilis
(Vundu)
Beku-kering Allium sativum Gyrodactylus turnbulli Poecilia retikulat [13]
(Guppy)
Ekstrak metanol Radix Bupleuri chinensis Dactylogyrus Carassius auratus [36]

intermedius (Ikan mas)
Ekstrak metanol Magnolia officinalis Ichthyophthirius Carassius auratus [37]
dan Sophora multifiliis (Ikan mas)
alopecuroides
Ekstrak metanol Dryopteris Dactylogyrus Carassius auratus [38]
crassirhizoma intermedius (Ikan mas)
Ekstrak metanol Piper guineense Gyrodactylus elegans Carassius auratus [29]
dan Dactylogyrus (Ikan mas)
ekstensi
Ekstrak metanol Semen aesculi Dactylogyrus Carassius auratus [38]

ekstrak air intermedius (Ikan mas)
Ekstrak metanol Mucuna pruriens Ichthyophthirius Carassius auratus [39]
petroleum-eter Carica pepaya multifiliis (Ikan mas)
ekstrak
Perendaman Air
1. Metode berendam dalam bak mandi: Berdasarkan persyaratan nilai

pengobatan untuk pemaparan yang lama. Phytoconstituent harus
dilarutkan dan pada dasarnya disebarkan dengan media kultur. Untuk
persyaratan seperti penerapan phytoconstituents.
2. Metode aplikasi celup adalah untuk interval paparan singkat, di mana

kontak singkat dengan bahan kimia yang harus larut dimasukkan ke
dalam sistem akuakultur.
3. Cara pembilasan : Pemberian pakan obat melalui pembilasan dengan
kebutuhan dosis tertentu pada durasi waktu tertentu dalam pemeliharaan
budidaya.
4. Metode enkapsulasi: Di sini, konstituen tersedia untuk tinggal lebih lama
dan pelepasan terkontrol ke media dan dianggap relatif signifikan dalam
bahaya bahaya lingkungan yang lebih kecil. Tetapi membutuhkan bahan
yang menggugah selera untuk ditambahkan ke dalam pakan.
Dosis Medicated
Feed Direct dapat diberikan sebagai injeksi, rute oral, atau aplikasi topikal.
Metode penerapan ini membutuhkan keahlian dalam menangani ikan hidup.
(a) Injeksi hanya dapat dilakukan pada ikan besar dengan penggunaan
konstituen sedang sesuai kebutuhan per berat badan. (b) Cara
penerapan lisan tidak praktis dan membutuhkan perhatian
bahan penyedap.
(c) Aplikasi topikal untuk tindakan khusus wilayah tetapi membutuhkan
persiapan formulasi.
3.2 Karakterisasi 1. Berbagai faktor mempengaruhi kualitas pakan aqua, yaitu, penanganan,
Pakan Aqua pemrosesan, dan penyimpanan bahan pakan, serta berbagai faktor
terkait pasar, yang semuanya dapat berdampak pada kualitas dan
keamanan bahan pakan. Sebelum bahan baku dapat dibeli, kualitas,
ketertelusuran, kelestarian lingkungan, dan standar keamanan harus
dipenuhi.
2. Pakan yang diproduksi pabrik selalu berkualitas tinggi, tetapi kualitasnya

mungkin telah menurun saat mencapai kolam penanam, yaitu pakan
ikan komersial yang dibeli disimpan di luar tempat sampah di peternakan
besar. Nilai gizi menurun dari waktu ke waktu, mengurangi kelezatan
dan estetika sementara juga jatuh di bawah kriteria minimum.
3. Penyimpanan jangka panjang, antara lain, dapat menyebabkan

pertumbuhan jamur, kerusakan vitamin, dan ketengikan lipid. Penanganan
yang tidak perlu akan merusak kantong pakan dan menimbulkan debu,
yang tidak akan tertelan oleh ikan dan dibuang.
Tabel 4
Komponen umpan dengan unitnya
Komponen umpan Satuan
Protein %
Gemuk %
Serat %
Abu %
Mineral makro (kalsium, fosfor, natrium, dll.) %
Fosfor biasanya diekspresikan berdasarkan ketersediaan
Jejak mineral (seng, mangan, besi, tembaga, selenium, dll.,) mg/kg
Asam amino (arginin, histidin, lisin, metionin, dll.,) %
Asam amino biasanya diekspresikan secara mudah dicerna.
Asam lemak dan komponen lipid lainnya (asam linoleat, asam linolenat, EPA, DHA, %
kolesterol, fosfolipid, dll.,)
Polisakarida pati dan non-pati %
Energi (biasanya dinyatakan sebagai energi yang dapat dicerna untuk aquafeeds) kkal/kg atau MJ/kg
Vitamin (vitamin A, tiamin, riboflavin, dll.) IU/kg, mg/kg, atau

ÿg/kg
Phytocompound atau ekstrak tumbuhan mg/kg
4. Penyimpanan harus bebas hama untuk mencegah infeksi. Penyimpanan sederhana

adalah bagian terpenting untuk melestarikan barang dalam kondisi yang baik.
Komposisi Pakan
Komposisi pakan dianalisis dengan metode standar analisis proksimat yang diikuti
sesuai pedoman dari Asosiasi Ahli Kimia Analitik Resmi (AOAC). Komposisi pakan dan
satuan konsentrasinya disajikan pada Tabel 4.
Densitas Pelet Tunggal Pelet

diukur beratnya masing-masing dengan menggunakan neraca penimbangan. Tinggi
dan diameter diukur dengan jangka sorong. Kepadatan kompak untuk setiap formulasi
dihitung menggunakan rumus yang diberikan di bawah ini dan dinyatakan sebagai kg3
[14]. Hal ini memungkinkan perbandingan persiapan pakan obat bersama dengan
pakan komersial yang digunakan secara tradisional.
Massa
Kepadatan ¼
Volume
Daya Tahan Pelet Tunggal

Daya tahan pelet individu diukur dengan menggunakan rumus berikut [14].
Daya tahan berubah sesuai protokol yang diikuti untuk prosedur aplikasi
tertentu yang digunakan.
Wf _
Ketahanan ð Þ¼ % 100
Wi
¼ ¼
Wf Berat akhir; Wi Berat awal.
Karakterisasi Mikrostruktur Mikroskop

elektron scanning digunakan untuk mengamati morfologi bahan serbuk pelet
[14]. Ini lebih lanjut dapat digunakan untuk penilaian tindakan umpan obat
pada aktivitas antimikroba yang diperlukan [15].
4. Kesimpulan
Kesimpulannya, tanaman obat telah digunakan dalam pengobatan infeksi

parasit, bakteri, virus, dan jamur pada ikan dan udang. Formulasi pakan
dengan dosis efektif ekstrak tanaman antimikroba atau phytocompound
memberikan strategi perawatan terbaik untuk budidaya ikan dan udang.
Karena tanaman obat terkenal dengan penerimaan budaya dan efek samping
yang lebih kecil pada kesehatan manusia, mengintegrasikan komponen
antimikroba yang efektif selama formulasi pakan sangat penting.
Referensi
1. Naylor RL, Hardy RW, Buschmann AH, Bush SR, 5. Okocha RC, Olatoye IO, Adedeji OB (2018)
Cao L, Klinger DH et al (2021) Tinjauan retrospektif Dampak keamanan pangan dari penggunaan
selama 20 tahun tentang akuakultur global. antimikroba dan residunya dalam akuakultur.
Nature 591:551–563 Kesehatan
2. Boyd CE, D'Abramo LR, Glencross BD, Huy ben Masyarakat Rev 39:21 6. Wang C, Li Z, Wang T, Xu
DC, Juarez LM, Lockwood GS et al (2020) X, Zhang X, Li D (2021) Peternakan ikan cerdas—
Mencapai akuakultur berkelanjutan: perspektifnya masa depan akuakultur. Aquacult Int 29:2681–
yang bersejarah dan terkini serta kebutuhan dan 2711 7. Schar D, Klein EY, Laxminarayan R, Gilbert
tantangan di masa depan. J World Aquacult Soc M, Van Boeckel TP (2020) Tren global dalam
51:578–633
penggunaan anti mikroba dalam akuakultur. Sains
3. Hua K, Cobcroft JM, Cole A, Condon K, Jerry DR, Rep 10: 21878
Mangott A et al (2019) Masa depan protein akuatik: 8. Marshall BM, Levy SB (2011) Pangan hewan dan
implikasi sumber protein dalam pola makan antimikroba: dampak terhadap kesehatan manusia.
akuakultur. Satu Bumi 1: 316–329 Klinik Mikrobiol Wahyu 24:718–733
9. Awad E, Awaad A (2017) Peran tanaman obat

4. Mzula A, Wambura PN, Mdegela RH, Shirima GM terhadap performa pertumbuhan dan status imun
(2021) Status akuakultur saat ini dan tantangan pada ikan. Immunol Kerang Ikan 67:40–54
penyakit bakteri pada ikan budidaya air tawar di
10. Venmathi Maran BA, Josmeh D, Tan JK, Yong YS,
Tanzania; panggilan untuk strategi berkelanjutan.
Shah MD (2021) Khasiat ekstrak air Azadirachta
Budidaya Ikan 6:247–253
indica terhadap laut
lintah parasit dan profil fitokimianya. bakteri patogen ikan. Aquac Res 44:1221– 1228
Molekul 26:1908
11. Rashidian G, Boldaji JT, Rainis S, Prokic´ MD, 22. Wang GX, Jiang D, Zhou Z, Zhao YK, Shen YH
Faggio C (2021) Ekstrak Oregano (Origanum (2009) Penilaian in vivo khasiat anthelmintik
vulgare) meningkatkan kinerja pertumbuhan ikan asam ginkgolic (C13:0, C15:1) pada penghilangan
zebra (Danio rerio), respons imun bawaan serum pseudodactylogyrus pada belut Eropa. Akuakultur
dan lendir, serta resistensi terhadap tantangan [Internet]. Amsterdam: Else vier Science; [dikutip
Aero monas hydrophila. Ternak 11:299 12. 9 Februari 2022].
Pandey G (2013) Formulasi pakan dan teknologi Tersedia dari: doi:https://doi.org/10. 1016/
pakan ikan. Int Res J Pharm 4: 23–30 j.aquaculture.2009.09.012 23.
Wang GX, Jiang DX, Li J, Han J, Liu YT, Liu XL
13. Schelkle B, Snellgrove D, Cable J (2013) (2010) Aktivitas antelmintik saponin steroid dari
Kemanjuran in vitro dan in vivo senyawa bawang Dioscorea zingiberensis CH
putih terhadap Gyrodactylus turnbulli yang Wright terhadap Dactylogyrus intermedius
menginfeksi guppy (Poecilia reticulata). Vet (Monogenea) pada ikan mas (Carassius auratus).
Parasitol 198: 96–101 Parasitol Res 107:1365–1371
14. Zettl S, Cree D, Soleimani M, Tabil L (2019) 24. Wang G, Zhou Z, Cheng C, Yao J, Yang Z (2008)
Sifat mekanis pelet pakan akuakultur Osthol dan isopimpinellin dari Fructus cnidii
memungkinkan menggunakan protein nabati. Yildiz F (red).untuk pengendalian Dactylogyrus interme dius
Pertanian Makanan Cogent di Carassius auratus. Vet Parasitol 158: 144–
151 25.
5:1656917 15. Chen Y, Wu J, Cheng H, Dai Y, Wang
Y, Yang H et al. Efek anti-infeksi dari peptida Liu GL, Liu L, Hu Y, Wang GX (2021) Evaluasi
antimikroba turunan ikan terhadap bakteri yang aktivitas antiparasit turunan kumarin terhadap
resistan terhadap obat dan efek sinergisnya Dactylogyrus intermedius pada ikan mas
dengan antibiotik. Mikrobiol Depan [Internet]. (Carassius auratus). Akuakultur 533: 736069
2020 [dikutip 9 Februari 2022];11. Tersedia dari:
https://www. frontiersin.org/article/10.3389/ 26. Zhang Q, Xu DH, Klesius PH (2013) Evaluasi
fmicb.2020. 602412 senyawa antiparasit yang diekstraksi dari Galla
16. Raman RP (2017) Penerapan, kelayakan dan chinensis terhadap parasit ikan Ichthyophthirius
efikasi fitoterapi dalam pengelolaan kesehatan multifiliis. Vet Parasitol 198: 45–53
hewan akuatik. Am J Plant Sci 8:257–287 A,
17. Valenzuela-Gutie'rrez R, Lago-Lesto'n 27. Kumar A, Raman RP, Kumar K, Pandey PK,
Vargas-Albores F, Cicala F, Martÿńez-Porchas Kumar V, Mohanty S et al (2012) Khasiat
M (2021) Menjelajahi sifat bawang putih (Allium antiparasit piperin terhadap Argulus spp. pada
sati vum) untuk budidaya ikan. Fish Physiol Carassius auratus (Linn. 1758): studi in vitro dan
Biochem 47:1179–1198 18. in vivo. Parasitol Res 111:2071–2076 28.
Nakao R, Mizukami C, Kawamura Y, Subeki, Bawm Zhang R, Wang XW, Zhu JY, Liu LL, Liu YC, Zhu H
S, Yamasaki M et al (2009) Evaluasi khasiat (2019) Diet sanguinarine memengaruhi respons
bruceine A, senyawa quassinoid alami yang imun, aktivitas enzim pencernaan, dan mikrobiota
diekstraksi dari tanaman obat, Brucea javanica , usus ikan koi (cryprinus carpiod). Akuakultur
untuk babesiosis anjing. J Vet Med Sci 71:33–41 502:72–79 29. Ji J, Lu C, Kang Y, Wang GX,
Chen P (2012)
19. Li XL, Yao JY, Zhou ZM, Shen JY, Ru HS, Liu Skrining 42 tanaman obat untuk aktivitas
XL (2011) Aktivitas chelerythrine, alkaloid antelmintik in vivo terhadap Dactylogyrus
benzo[c]phenanthridine kuaterner dari intermedius (Monogenea) pada ikan mas (Caras
Chelidonium majus L. pada Dactylogyrus sius auratus). Parasitol Res 111:97–104
intermedius. Parasitol Res 109:247–252 30. Ling F, Wang JG, Lu C, Wang GX, Lui YH, Gong
20. Shan X, Meng Q, Kang Y, Bian Y, Gao Y, Wang XN (2012) Pengaruh ekstrak air Capsicum
W et al (2014) Isolasi senyawa aktif dari ekstrak frutescens (Solanaceae) terhadap ektoparasit
metanol Toddalia asiatica terhadap Ichthyophthirius ikan Ichthyophthirius multifiliis.
multifiliis pada ikan mas (Carassius auratus). Vet Parasitol Res 111:841–848
Parasitol 199:250–254 21. Kang YJ, Yi Y, Zhang 31. Abdel-Tawwab M, Ahmad MH, Seden MEA, Sakr
C, Wu SQ, Shi CB, Wang GX (2013) Isolasi yang SFM (2010) Penggunaan teh hijau, Camellia
dipandu bioassay dan identifikasi senyawa aktif sinensis L., dalam diet praktis untuk pertumbuhan
dari Macleaya microcarpa (maxim) Fedde dan perlindungan ikan nila, Oreochromis niloti
terhadap cus (L.), terhadap Aeromonas hydrophila infeksi.
J World Aquacult Soc. 41:203–213
32. Chitmanat C, Nunsong W, Tongdonmuan K (2005) 36. Ekanem AP, Brisibe EA (2010) Pengaruh ekstrak
Penggunaan ekstrak kasar dari tanaman obat ethanol Artemisia annua L. terhadap parasit
tradisional untuk mengeliminasi Trichodina sp. pada monogenean Heterobranchus longifilis. Parasitol Res
nila (Oreochromis niloticus) finger lings. 106:1135–1139 37. Yi YL, Lu C, Hu XG, Ling
Songklanakarin. J Sci Technol 27:359– 364 F, Wang GX (2012) Aktivitas antiprotozoal tanaman obat
terhadap Ichthyophthirius multifiliis pada ikan mas
33. Abd El-Galil MAA, Aboelhadid SM (2012) (Carassius auratus). Parasitol Res 111:1771–1778
Uji coba pengendalian trikodinosis dan gyro dactylosis
di hatchery benur Oreochromis niloticus yang
dipelihara dengan menggunakan bawang putih. Vet 38. Jiang B, Chi C, Fu Y, Zhang Q, Wang G (2013) Efek
Parasitol 185:57–63
antelmintik in vivo flavonol rhamnosides dari Dryopteris
34. Valladaõ GMR, Gallani SU, Ikefuti CV, da Cruz C, crassirhizoma terhadap Dactylogyrus intermedius
Levy-Pereira N, Rodrigues MVN et al (2016) Minyak pada ikan mas (Carassius auratus). Parasitol Res
atsiri untuk mengendalikan ichthyophthiriasis di pacu, 112:4097– 4104
Piaractus mesopota micus (Holmberg): penekanan
khusus pada pengobatan dengan Melaleuca 39. Ekanem AP, Obiekezie A, Kloas W, Knopf K (2004)
alternifolia. J Fish Dis 39: 1143–1152 Pengaruh ekstrak kasar Mucuna pruriens (Fabaceae)
dan Carica papaya (Carica ceae) terhadap parasit
35. Karagouni E, Athanassopoulou F, Lytra A, Komis C, ikan protozoa Ichthyophthirius multifiliis. Parasitol Res
Dotsika E (2005) Efek antiparasit dan imunomodulator 92: 361–366
pengobatan inovatif terhadap Myxobolus sp. infeksi
pada Diplodus puntazzo. Vet Parasitol 134:215– 228
Bagian V
Actinomycetes Akuatik dan Copepoda

Bab 23
Isolasi dan Identifikasi Actinomycetes

Haimanti Mondal, John Thomas, and Natarajan Amaresan
Abstrak
Actinomycetes adalah bakteri Gram-positif, anaerobik fakultatif karena kebanyakan dari mereka tumbuh paling baik
dalam kondisi anaerobik. Mereka terdiri dari miselium dalam bentuk berserabut dengan pola pertumbuhan bercabang.
Spesies ini dapat membentuk endospora dan berbentuk kokoid atau batang. Beberapa spesies mungkin asidofilik,
termofilik, dan alkalifilik. Mereka sering ditemukan pada tingkat pH sedang dan kebanyakan lebih menyukai suhu
sedang. Actinomycetes membentuk asosiasi simbiosis dengan berbagai spesies tanaman melalui fiksasi nitrogen.
Mereka memiliki aplikasi luas di berbagai bidang dan digunakan sebagai sumber antibiotik, pestisida, dan
segera.
Kata kunci Actinomycetes, Filamentous, Mycelium, Endospore, Anaerob fakultatif
1. Perkenalan
Actinomycetes umumnya Gram-positif di mana-mana, bakteri

pembentuk spora dengan beragam aktivitas biologis [1]. Mereka
ditempatkan dalam filum Actinobacteria, kelas Actinomycetia, sub
kelas Actinobacteridae, dan ordo Actinomycetales yang terdiri dari
lebih dari 160 genera, 10 subordo, dan lebih dari 30 famili [2]. Mereka
dianggap sebagai salah satu filum bakteri besar yang terdiri dari
karakteristik morfologi seperti jamur berfilamen [3]. Mereka diketahui
memiliki lebih dari 55% kandungan guanin hingga sitosin (G + C)
tinggi secara taksonomi [1, 4]. Genera Actinomycetes yang paling
umum termasuk Streptomyces, Actinomyces, Micrococcus, dan
Actinoplanes [5, 6].
Actinomycetes adalah sumber daya mikroba yang sangat besar
yang memiliki nilai komersial yang besar dan penggunaan praktis
yang luas. Mereka memiliki potensi biosintetik yang sangat besar
untuk menghasilkan metabolit sekunder [7]. Mereka adalah sumber
dari sekitar 70% antibiotik dan metabolit bioaktif nonantibiotik seperti
enzim, reagen anti-oksidasi, penghambat enzim, pengatur imunologi, dll. [2].
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_23,
183
[8] melaporkan bahwa Actinomycetes tersebar luas di habitat darat

dan laut, terutama di tanah dan lautan. Sumber laut terbaik dari
Actinomycetes yang dilaporkan adalah sedimen. Isolasi Actinomycetes
juga telah dilaporkan dari air, batuan, pasir, sedimen dalam, sedimen
mangrove, tumbuhan laut, dan makanan laut [2]. Mereka digunakan
dalam produksi metabolit sekunder dan produknya banyak digunakan
untuk perlakuan yang berbeda [9].
2 Bahan
2.1 Isolasi dari • Sampel sedimen. •

Actinomycetes [10] Kantong autoklaf.
• Tabung reaksi.
Media agar isolasi Actinomycetes (AIA) (natrium kaseinat, 2 g; L-
asparagin, 0,1 g; natrium propionat, 4 g; dipotassium fosfat, 0,5 g;
magnesium sulfat, 0,1 g; besi sulfat, 0,001 g; agar, 15 g ; pH akhir,
8,1 0,2; air suling, 1 L). • Kaldu ISP2.
• Natrium klorida (NaCl). •

Asam nalidiksat.
• Mycostatin.
3 Identifikasi Actinomycetes [11–13]

3.1 Metode Pewarnaan • Kit pewarnaan Gram dan pewarnaan kapsul (mengacu pada standar mikro
pedoman laboratorium biologi).
3.2 Uji Biokimia • KB003 Hi 25 Kit biokimia.
• Kit KB009A/KB009B/KB009C Hi Carbo™.
3.3 Molekuler • Campuran reaksi PCR sesuai protokol standar. • Primer

Identifikasi universal 27F dan 1492R. •
Mempertahankan primer universal 800R.
Transiluminator.
Isolasi dan Identifikasi Actinomycetes 185
4 Metode
4.1 Pretreatment • Tuangkan sampel sedimen ke dalam cawan petri kaca. •

Sampel Sedimen Simpan sampel semalaman pada suhu 70 C dalam oven udara panas untuk
Laut pengeringan. • Dalam kondisi aseptik, hancurkan dan giling sampel secara
aseptis menggunakan lesung dan alu.
4.2 Isolasi dari • Timbang 1 g sampel sedimen/tanah. •

Actinomycetes dari Dispersikan sampel ke dalam labu berbentuk kerucut 100 mL yang mengandung
Sedimen/Tanah Laut garam 0,9% dengan air suling.
• Simpan pada suhu kamar selama 10 menit menggunakan pengocok orbital.

• Siapkan pengenceran serial.
• Pindahkan 0,1 mL alikuot dari empat pengenceran terakhir pada media AIA
yang disuplementasi dengan asam nalidiksat (50 ÿg/mL) dan mikostatin
(100 ÿg/mL).
• Inkubasi cawan petri pada suhu 30 C selama 7–14 hari. •
Pilih koloni murni dan subkulturkan dari induknya
piring.
4.3 Identifikasi dari • Lakukan teknik pewarnaan dan tes biokimia sesuai
Actinomycetes prosedur standar.
4.3.1 Metode Pewarnaan

dan Uji Biokimia
4.3.2 Analisis Scanning • Inokulasikan isolat ke dalam media kaldu.

Electron Microscopy (SEM). • Inkubasi media biakan dalam rotary shaker pada suhu 30 C selama 7 hari
sampai pertumbuhan terlihat. •
Sentrifuge kultur kaldu pada 7000 rpm selama 10 menit dan buang
supernatannya. • Tambahkan
1 mL phosphate-buffered saline (PBS) yang diautoklaf ke dalam supernatan
bebas sel dan aduk rata. • Pindahkan
10–20 ÿL biakan pada slide bersih bebas minyak. • Keluarkan 20 ÿL larutan
glutaraldehida 0,25% ke dalam
menggeser.
• Keringkan slide dengan oven selama 48 jam pada suhu 40 C.
4.3.3 Molekul • Ekstrak DNA genomik dari Actinomycetes menggunakan metode lisis dengan
Identifikasi [14, 15] merebus suspensi sel biakan bakteri sesuai dengan protokol standar.
• Lakukan amplifikasi gen 16S rRNA dengan campuran reaksi 50 ÿL yang

mengandung 1 ÿL DNA genom, 0,2 ÿM setiap primer, dan 25 ÿL Master Mix
menggunakan primer universal.
• Reaksi amplifikasi dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 95 C selama 5

menit diikuti dengan 30 siklus denaturasi pada suhu 95 C selama 1 menit,
anil primer pada suhu 55 C selama 1 menit, dan ekstensi primer pada suhu
72 C selama 1,5 menit dengan ekstensi akhir pada suhu 72 C selama 10
menit.
• Memurnikan produk PCR dan mengurutkannya menggunakan primer universal

800R yang dilestarikan.
• Edit urutan yang diambil secara manual dan lakukan analisis nukleotida BLAST
dengan NCBI untuk mengidentifikasi Actinomycetes hingga tingkat genus.
Referensi
1. Daquioag JEL, Penuliar GM (2021) Isolasi Actinomycetes dari sedimen air dan tanah di
Actinomycetes dengan aktivitas selulolitik dan berbagai wilayah Nepal. Int J Mikrobiol
antimikroba dari tanah yang dikumpulkan dari 5586165:1–9
ruang hijau perkotaan di Filipina. Int J Microbiol 10. Singh V, Haque S, Singh H, Verma J, Vibha K et
2021:6699430 al (2016) Isolasi, skrining, dan identifikasi isolat
2. Dilip VC, Mulaje SS, Mohalkar RY (2013) baru Actinomycetes dari India untuk aplikasi
Tinjauan tentang Actinomycetes dan aplikasi antimikroba. Mikrobiol depan 7:1921
logika bioteknologinya. Int J Pharm Sci Res 4(5):
1730–1742 11. Cheesbrough M (2010) Respon imun adaptif
3. Jose PA, Jha B (2016) Dimensi baru penelitian atau spesifik, laboratorium distrik di negara
tentang Actinomycetes: pencarian antibiotik tropis, edisi ke-2. Cambridge University Press,
generasi berikutnya. Front Microbiol 7:1295 Cape Town, hal 11
4. Abdul MKN, Chowdhury AJK, Zainuddin Z, Abidin 12. Rajkumar T, Manimaran M, Taju G, Vimal S,
ZAZ (2014) Isolasi selektif Acti nomycetes dari Majeed AS dkk. (2018) Senyawa virus antivirus
hutan bakau Pahang, Malaysia. Dalam: Prosiding dari Streptomyces ghanaensis seperti strain
konferensi internasional tentang pertanian, terhadap white spot syndrome virus (WSSV)
biologi dan ilmu lingkungan (ICABES'14), Bali, udang. bioRxiv https://doi.org/10.1101/ 340265
Indonesia, hlm 8–9 5. Agadagba SK (2014)
Isolasi 13. Undabarrena A, Beltrametti F, Claverÿás FP,
Actinomycetes dari tanah. J Microbiol Res 4(3):136– González M, Moore ERB et al (2016) Menjelajahi
140 6. Adegboye MF, Babalola OO (2012) keragaman dan potensi antimikroba Actinobacteria
Takson omy dan ekologi akti nomycetes penghasil laut dari Comau Fjord di Patagonia utara.
antibiotik. Afr J Agric Res 7(15):2255–2261 7. Mikrobiol depan Chili 7:1135
Niu G (2018) Penemuan produk alami yang
digerakkan oleh genomik di Actinomycetes. Tren 14. Claverÿás FP, Undabarrena A, González M,
Biotek nol 36:238–241 Seeger M, Cámara B (2015) Penyelam yang
dapat dibudidayakan dan aktivitas antimikroba
8. Chandramohan D (1991) Proses mikroba pesisir. Actinobacteria dari sedimen laut di teluk
Valparaÿso. Mikrobiol depan Chili 6:737
Dalam: Natarajan R, Dwivedi SN, Rama
chandran S (eds) Pengelolaan zona pesisir (di 15. Moore E, Arnscheidt A, Kru¨ger A, Stro¨mpl C,
negara bagian Tamilnadu, India). Ocean Data Mau M (2004) Protokol yang disederhanakan
Center, Anna University, Madras, p untuk penyiapan DNA genomik dari kultur bakteri.
Dalam: Ekologi mikroba molekuler man ual, vol.
93 9. Shrestha B, Nath DK, Maharjan A, Poudel A,
1. Penerbit Akademik Kluwer, Dor drecht, hal 3–
Pradhan RN et al (2021) Isolasi dan karakterisasi
potensi penghasil antibiotik 18
Bab 24
Uji Aktivitas Hemolitik

Abstrak
Hemolisis mengacu pada pemecahan eritrosit / sel darah merah (RBC). Hal ini menyebabkan penghancuran
eritrosit, melepaskan hemoglobin dari dalam sel darah merah ke dalam plasma darah. Hemolisis in vitro adalah
hasil dari penyebab pra-analitik yang terkait dengan parameter termasuk suhu ekstrem, pengumpulan dan
penanganan sampel, teknik transportasi yang mengganggu, pemrosesan yang tertunda, dan penyimpanan
yang lama kemudian. Tes hemolitik dilakukan pada bakteri termasuk Actinomycetes setelah ekstraksi metabolit
sekunder dengan pelarut paling kuat. Kemudian, mereka disaring untuk aktivitas hemolitik terhadap patogen
bakteri dan jamur dalam akuakultur.
Kata kunci Hemolisis, Hemolisis in vitro, Sel darah merah, Tes hemolitik
1. Perkenalan
Salah satu faktor virulensi utama, hemolisin, dianggap sebagai

senyawa yang diproduksi oleh berbagai spesies bakteri termasuk
Actinomycetes. Mereka bertanggung jawab atas lisis sel, penghancuran
sel dan jaringan yang berdekatan, dan kerusakan membran untuk
memasok nutrisi seperti zat besi untuk penghasil racun [1].
Tes hemolitik Actinomycetes dapat dilakukan pada darah hewan
laut [2-5]. Beberapa penelitian telah dilaporkan pada Actinomycetes di
mana metabolit sekunder diekstraksi dan disaring untuk aktivitas
hemolitik terhadap patogen bakteri dan jamur tertentu. Suthindhiran
dan Kannabiran [6] melaporkan aktivitas hemolitik in vitro dari metabolit
sekunder yang diekstraksi dari beberapa spesies Actinomycetes
termasuk Streptomyces, Micromonos pora, Actinopolyspora, dan
Saccharopolyspora pada sel darah merah tikus.
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_24,
187
2 Bahan
Media agar darah domba (SBA) (kasein enzim hidrolisat, 14 g;
pencernaan peptik jaringan hewan, 4,5 g; ekstrak ragi, 4,5 g; natrium
klorida, 5 g; darah domba, 0,5 g; agar-agar, 12,5 g; pH akhir , 7,3
0,2; air suling, 1 L).
• Eritrosit domba/tikus. • Kaldu
ISP2.
• Pelat 96 sumur. •
Kalsium klorida (CaCl2). •
Natrium klorida (NaCl). • Triton
X-100.
• 10 garam buffer fosfat (PBS).
3 Metode
3.1 Uji • Inokulasikan isolat aktinomisetes pada agar darah domba 5%.
Hemolitik [7] sedang.
• Inkubasi pada suhu kamar pada 28–30 C selama 2–3 hari. •

Catat zona inhibisi (dalam mm) di sekitar koloni aktinomisetes yang
menunjukkan aktivitas hemolitik.
3.2 Uji • Cuci fraksi eritrosit tiga kali dengan saline dan resuspensi dalam 10 mL
Hemolitik In PBS.
Vitro [6, 8–10] • Melakukan aktivitas hemolitik senyawa bioaktif dengan cara
uji hemolitik dalam piring 96-sumur.
• Tuangkan 100 ÿL larutan NaCl 0,85% yang mengandung 10 MM CaCl2
di setiap sumur.
• Perhatikan baik-baik kontrol negatif pertama yang berisi saja

air.
• Tambahkan 100 µL berbagai konsentrasi (5–500 µg/mL) senyawa

bioaktif pada sumur kedua.
• Sesuaikan osmolaritas ekstrak dengan 10 PBS untuk mencegah lisis
osmotik sel darah merah. •
Ambil sumur terakhir sebagai kontrol positif yang mengandung 20 µL
Triton X-100 0,1% dalam salin 0,85%.
• Tambahkan 100 µL suspensi 2% eritrosit manusia/tikus dalam salin

0,85% yang mengandung 10 MM CaCl2 pada setiap sumur.
Uji Aktivitas Hemolitik 189
• Inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit

sampai 2 jam. • Centrifuge dan buang
supernatan. • Catat absorbansi hemoglobin yang dibebaskan pada 540 nm.
Referensi
1. Mogrovejo DC, Perini L, Gostincÿar C, Sepcÿic´ Actinomycetes di Teluk Benggala di pantai ceri
K, Turk M et al (2020) Prevalensi resistensi Pudu di India India. J Mikrobiol 50(1): 76–82
antimikroba dan tipe feno hemolitik pada
bakteri Arktik yang dapat dikultur. Mikro bio 7. Fatmawati U, Meryandini A, Nawangsih AS,
depan 11:570 Wahyudi AT (2010) Penapisan dan karakterisasi
2. Norouzi H, Danesh A, Mohseni M, Khoras gani Actinomycetes yang diisolasi dari rizosfer
MR (2018) Marine Actinomycetes dengan kedelai untuk mendorong pertumbuhan
potensi probiotik dan bioaktivitas terhadap tanaman. Penyelam Bio J Penyelam
bakteri yang resistan terhadap berbagai obat. Biol 20(10):2970–2977 8. Costa-Lotufo LV, Cunha
Sel Int J Mol Med 7:44–52 GMA, Farias PAM, Viana GSB, Cunha KMA,
3. Jagannathan SV, Manemann EM, Rowe SE et Pessoa C, Moraes MO, Silveira ER, Gramosa
al (2021) Marine Actinomycetes, sumber baru NV, Rao VSN (2002) The efek sitotoksik dan
produk bioteknologi. Mar Drugs 19(7):365 4. embriotoksik asam kaurenoat, diterpen yang
Bernal diisolasi dari Copaifera langsdorffii oloeo-resin.
MG, Campa-Co´rdova AÍ, Saucedo PE, González Racun 40:1231–1234
MC, Marrero RM et al (2015) Isolasi dan seleksi 9. Saurav K, Kannabiran K (2012) Sitotoksisitas
in vitro strain actinomycetes sebagai probiotik dan aktivitas antioksidan 5-(2,4-dimethyl
potensial untuk akuakultur. benzyl)pyrrolidin-2-one yang diekstrak dari
Dokter Hewan Dunia 8:170–176 Streptomyces laut VITSVK5 spp. Saudi J Biol
5. Das S, Ward LR, Burke C (2010) Penapisan Sci 19: 81–86
Streptomyces spp. potensi untuk digunakan 10. Malagoli D (2007) Protokol lengkap untuk
sebagai probiotik dalam akuakultur. Akuakultur menguji aktivitas hemolitik palytoxin pada
305: 32–41 eritrosit manusia. Balikkan Surviv J 4:92–94
6. Suthindhiran K, Kannabiran K (2010)
Keanekaragaman dan eksplorasi bioaktif laut
Bab 25
Uji Sitotoksisitas
Abstrak
Uji sitotoksisitas didefinisikan sebagai uji skrining dan evaluasi biologis sel jaringan secara in vitro untuk mendeteksi
pertumbuhan, reproduksi, dan juga efek morfologis sel dengan menggunakan alat kesehatan. Ini dilakukan secara
in vitro untuk menentukan apakah perangkat medis tertentu dapat menyebabkan kematian sel baik melalui kontak
langsung atau pencucian beberapa zat beracun. Tes sitotoksisitas mengukur hilangnya beberapa fungsi atau
struktur seluler dan antar sel yang melibatkan sitotoksisitas yang mematikan. Mereka juga menunjukkan apakah
mereka menyebabkan cedera sel dan jaringan. Pengujian ini dilakukan pada beberapa bakteri termasuk
Actinomycetes sebagai pengujian proliferasi 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)
terhadap beberapa garis sel untuk mengamati tingkat sitotoksisitasnya.
Kata kunci Uji sitotoksisitas, Actinomycetes, Lethal, Toksisitas
1. Perkenalan
Analisis aktivitas biologis metabolit sekunder mengungkapkan

kemanjuran agen bakterisidal terhadap beberapa gen patogen dan
juga aktivitas sitotoksik in vitro terhadap garis sel kanker atau tumor
dalam akuakultur [1]. Mereka juga fokus pada penjelasan mode aksi
yang mengakibatkan kematian sel dengan aktivitas sitotoksik selektif
pencahayaan tinggi [2].
Beberapa penelitian telah melaporkan efek sitotoksik dari ekstrak
Actinomycetes terhadap garis sel manusia tertentu [2]. Gozari et al. [3]
melaporkan sebuah studi di mana mereka menyaring dan mengidentifikasi
lima strain Actinomycetes yang paling kuat. Mereka kemudian
menunjukkan bahwa strain Actinomycetes ini menghasilkan metabolit
sekunder antibakteri dengan agen sitotoksik terhadap berbagai mikroba
patogen dan garis sel tumor manusia (HTCLs). Mereka juga mengamati
bahwa ekstrak antibakteri paling kuat dari Actinomycetes menunjukkan
sitotoksisitas ketergantungan dosis tinggi terhadap HTCL, dengan
toksisitas rendah atau tidak signifikan terhadap sel normal.
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_25,
191
2 Bahan
• 5-(2,4-dimethylbenzyl)pyrrolidine-2-one (DMBPO). • Media

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)/ Dulbecco's Modified Eagle
Medium (DMEM).
• Garis sel HEP2 (sel karsinoma laring), Vero (ginjal monyet hijau), Hep G2
(karsinoma hepatoselular). • Streptomisin.
• Penisilin.
• 10% serum janin sapi (FBS). • Kit

pengujian Sel Quanti-MTT. • Pelat
kultur jaringan 96 sumur. • Pembaca
pelat multi sumur. •
Dimetilsulfoksida (DMSO).
3 Metode
3.1 Pengujian • Lakukan sitotoksisitas DMBPO (0–25 ÿg/mL) pada garis sel yang berbeda
Sitotoksisitas [3, 4] seperti HEP2 (sel karsinoma laring), Vero (ginjal monyet hijau), dan Hep
G2 (karsinoma hepatoseluler) dengan uji proliferasi sel MTT.
• Biakan sel secara rutin dalam labu kultur berukuran 75 cm2. •

Pertahankan dalam media RPMI 1640/DMEM yang dilengkapi dengan
streptomisin (100 mg/L), penisilin (100 IU/mL), dan 10% FBS (v/v) dalam
5% karbon dioksida pada suhu 37 C. • Kuantifikasi cell
lines (1 105 sel/sumur) menurut pengguna
manual.
• Kultur sel (80 mL/sumur) dalam pelat kultur jaringan 96-sumur bening di
dasar. •
Inkubasi sampai mereka mendapatkan
pertemuan. • Tambahkan senyawa uji dengan sel dan inkubasi pada periode
waktu yang
berbeda. • Tambahkan 15 mL/80 ÿL kultur sel reagen Cell Quanti-MTT™/
Sehat.
• Inkubasi pada suhu 37 C selama 4 jam.
• Tuangkan 100 mL larutan solubilisasi dan simpan dalam orbital

pengocok pada suhu kamar selama 1 jam.
• Ukur kerapatan optik (OD) untuk setiap sumur pada 570 nm pada a
pembaca pelat multi
sumur. • Lakukan tes dalam rangkap tiga.
Uji Sitotoksisitas 193
• Pertimbangkan sumur-sumur yang dirawat dengan DMSO 0,1% atau kultur saja
media sebagai kontrol.
• Tentukan rata-rata kontrol (kosong) dan kurangi nilai absorbansi.
• Plot grafik viabilitas sel terhadap periode waktu dengan konsentrasi senyawa
yang berbeda.
Referensi
1. Salem SS, El-Beley EF, Niedbala G, Alnoman 3. Gozari M, Zaheri A, Jahromi ST, Gozari M,
MM, Hassan et al (2020) Efikasi bakterisidal Karimzadeh R (2019) Skrining dan
dan sitotoksik in-vitro dari nanopartikel perak karakterisasi Actinomycetes laut dari sedimen
(Ag-NPs) yang dibuat oleh cetes Actinomy Laut Oman utara untuk aktivitas sitotoksik dan
endofit dan penggunaannya sebagai pelapis antimikroba. Mikrobiol Int. https:// doi.org/
untuk tekstil fab rics. Nanomaterials 10.1007/s10123-019-00083-3 4. Saurav
(Basel) 10(10):2082 2. Ser HL, Mutalib NS, Yin K, Kannabiran K (2012) Sitotoksisitas dan
WF, Chan KG, Goh BH et al (2015) Evaluasi aktivitas antioksidan 5-(2,4-dimethylbenzyl)
aktivitas antioksidan dan sitotoksik pyrrolidin-2-one diekstrak dari Marine Strepto
Streptomyces pluripotens MUSC 137 diisolasi myces VITSVK5 spp. Saudi J Biol Sci 19:81–86
dari tanah bakau di Malaysia. Mikrobiol Depan 6:1398
Bab 26
Aktivitas Antibakteri dan Ekstraksi Senyawa Bioaktif dari

Actinomycetes
Abstrak
Saat ini, organisme patogen menunjukkan resistensi didapat yang lebih besar terhadap hampir semua agen
antibakteri yang sering digunakan. Ada kebutuhan yang mendesak dari senyawa bioaktif baru untuk melawan
patogen menular tersebut. Untuk mendeteksi dan mengisolasi senyawa bioaktif yang lebih baru dari Actinomycetes,
banyak area yang belum diketahui dan belum dijelajahi dieksplorasi, dan penyaringan agen antibakteri dilakukan.
Hingga saat ini, beberapa ribu senyawa bioaktif telah diisolasi dari Actinomycetes dan dikarakterisasi. Banyak
dari mereka telah dikembangkan menjadi obat untuk pengobatan penyakit dalam akuakultur. Dengan demikian,
Actinomycetes dianggap sebagai sumber paling kuat dalam produksi antibiotik, metabolit sekunder, dan senyawa
bioaktif baru lainnya.
Kata Kunci Patogen, Antibakteri, Senyawa Bioaktif, Metabolit Sekunder, Pengobatan
1. Perkenalan
Actinomycetes terkenal untuk produksi sejumlah besar senyawa bioaktif

[1]. Hampir dua pertiga senyawa antimikroba yang saat ini digunakan
diproduksi oleh beberapa spesies Actinomycetes [2]. Molekul bioaktif
juga dikenal sebagai metabolit sekunder. Mereka tidak penting untuk
reproduksi dan pertumbuhan tetapi mungkin mengaktifkan sistem
pertahanan mikroba produsen untuk membantu mereka bersaing di
lingkungan eksternal [3]. Actinomycetes dianggap sebagai salah satu
sumber metabolit bioaktif baru yang paling potensial. Hampir 70% dari
obat-obatan yang diketahui, dimana 60% dan 75% digunakan dalam
pertanian dan kedokteran, diisolasi dari actinomycetes. Mereka adalah
sumber utama metabolit sekunder dan selain itu memiliki aktivitas
antiseluler [3].
Actinomycetes memiliki kapasitas luar biasa untuk memberikan

efektivitas antibakteri yang paling unik, bermacam-macam, dan luar biasa
dengan toksisitas rendah [4, 5]. Cho dkk. [6] melaporkan beberapa sekunder
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_26,
195
metabolit yang dihasilkan oleh Streptomyces sp. yang telah berhasil digunakan
sebagai antibiotik dalam mengobati infeksi yang resistan terhadap obat pada
manusia dan hewan. Beberapa penelitian melaporkan bahwa metabolit
sekunder yang diproduksi oleh Actinomycetes menunjukkan aktivitas antibakteri
yang sangat tinggi [7].
2 Bahan
Media agar isolasi Actinomycetes (AIA) (natrium kaseinat, 2 g; L-asparagin, 0,1
g; natrium propionat, 4 g; dipotassium fosfat, 0,5 g; magnesium sulfat, 0,1
g; besi sulfat, 0,001 g; agar, 15 g ; pH akhir, 8,1 0,2; air suling, 1 L). • Media
agar Mueller Hinton (MHA) (infus daging dari setara dengan daging sapi,
300 g; hidrolisat asam kasein, 17,5 g; pati, 1,5 g; agar, 17 g; pH akhir, 7,3 0,1;
air suling, 1 L). • Kaldu ISP2.
• Natrium klorida (NaCl). •

Penggerek gabus.
• Kertas saring Whatman No.1. •

Corong pemisah.
3 Metode
3.1 Aktivitas • Lakukan skrining awal dengan metode cross-streak untuk menyaring isolat
Antibakteri In Vitro terhadap patogen. • Lengkapi pelat agar dengan
[8–10] 2% NaCl. • Inokulasikan isolat dengan satu coretan di
3.1.1 Penyaringan Primer tengah pelat. • Inkubasi cawan petri pada suhu 30 C selama 7 hari. • Coretkan
patogen uji yang disubkultur secara tegak lurus pada 90
ke isolat Actinomycetes.
• Inkubasi cawan petri pada suhu 37 C selama 24 jam.

• Catat zona hambat (dalam mm) di sekitar koloni.
3.1.2 Penyaringan • Pilih isolat Actinomycetes yang menunjukkan potensi antibakteri

Sekunder kegiatan dari skrining primer. • Inokulasi
isolat ke dalam kaldu ISP2.
• Simpan biakan kaldu dalam inkubator pengocok putar dengan kecepatan 120
rpm, 30 C selama 7 hari.
Aktivitas Antibakteri dan Ekstraksi Senyawa Bioaktif dari Actinomycetes 197
• Sentrifuge biakan pada 4 C, 10.000 rpm selama 20 menit. • Kumpulkan
supernatan.
3.2 Metode • Sebarkan biakan rumput dari patogen pada agar yang telah mengeras
Difusi Sumur Agar piring menggunakan penyeka kapas steril.
• Buat lubang dengan menggunakan penggerek gabus steril pada pelat
agar. • Tambahkan supernatan (ekstrak kasar) ke sumur agar. • Tunggu
sampai ekstrak benar-benar menyebar ke agar

piring.
• Inkubasi cawan petri pada suhu 37 C selama 24 jam. •
Lakukan percobaan tiga kali dan catat rata-rata zona hambat (dalam mm).
3.3 Ekstraksi dari • Siapkan inokulum dengan menginokulasikan isolat terpilih ke dalam
Senyawa Bioaktif kaldu ISP2.
• Inkubasi kaldu kultur dalam inkubator pengocok putar pada suhu 30 C

selama 7
hari. • Saring kaldu dengan kertas saring Whatman No.1. • Sentrifuge
filtrat pada 4 C dan 10.000 rpm selama 20 menit. • Kumpulkan supernatan
bebas sel dan ekstrak tiga kali dengan volume yang sama dari etil asetat dalam rasio
1:1 menggunakan corong pisah.
• Kumpulkan lapisan atas dalam labu berbentuk kerucut.
• Simpan dalam inkubator pengocok putar selama 24 jam. •
Biarkan selama 20 menit setelah dikeluarkan dari pengocok. • Kumpulkan
lapisan atas. • Konsentrasikan
lapisan pelarut menggunakan rotary evaporator.
Referensi
1. Undabarrena A, Beltrametti F, Claverÿás Actinomycetes dari Tamil Nadu, India. Asian

FP, González M, Moore ERB et al (2016) Pac J Trop Biomed 2(12):936–943
Menjelajahi keragaman dan potensi 4. Tanvir R, Sajid I, Hasnain S, Kulik A, Grond
antimikroba dari aktinobakteri laut dari Comau S (2016) Langka Actinomycetes Nocardia
Fjord di Patagonia Utara, Chili. Mikrobiol caishijien sis dan Pseudonocardia
Depan 7: 1135 carboxydivorans sebagai endofit, evaluasi
2. Bentley SD, Chater KF, Cerdenõ-Tárraga bioaktivitas dan metabolitnya.
AM, Challis GL, Thomson NR dkk (2002) Microbiol Res 185:22–35 5. Kumari N,
Urutan genom lengkap dari model Acti Menghani E, Mithal R (2019) Karakterisasi
nomycete Streptomyces coelicolor A3(2). senyawa bioaktif dan potensi anti bakteri
Sifat 417(6885):141– Actinomycetes diisolasi dari tanah rizosfer. J
147 3. Kumar PS, Raj JPP, Duraipandiyan V, Sci Ind Res 78:793– 798
Ignaci muthu S (2012) Aktivitas antibakteri beberapa
6. Cho SS, Choi YH, Simkhada JR, Mander P, wilayah, India Selatan. J Coast Life Med 1(3):
Park DJ et al (2012) Strepto myces sp. 175–180
CS392 memproduksi tiga senyawa 9. Dholakiya RN, Kumar R, Mishra A, Mody KH,
antimikroba. Bioproses Biosistem Eng Jha B (2017) Aktivitas antibakteri dan
35:247– 254 antioksidan dari strain Actinobacteria baru
7. Ravi L, Krishnan K (2016) Ekstraksi yang yang diisolasi dari Teluk Khambat, Gujarat.
dipandu bioaktivitas dan identifikasi senyawa Front Micro
antibakteri dari strain Actinomycetes laut biol 8:2420 10. Rajkumar T, Manimaran M, Taju
yang diisolasi dari sampel tanah pesisir G, Vimal S, Majeed AS et al (2018) Senyawa
Rames waram dan Dhanushkodi, Tamil Nadu, India. virus antivirus dari Streptomyces ghanaensis
Asian J Pharm 10(4):S504– seperti strain terhadap white spot syndrome
S509 8. Thirumurugan D, Vijayakumar R (2013) virus (WSSV) udang. bioRxiv. https://doi.org/
Pembunuh bakteri patogen ikan ampuh 10.1101/ 340265
Strepto myces sp. diisolasi dari tanah pantai timur
Bab 27
Isolasi dan Identifikasi Copepod Harpacticoid

MF Yasmeen dan A. Saboor
Abstrak
Kopepod harpacticoid adalah krustasea yang mencakup bentuk bentik dan juga planktonik. Mereka adalah
organisme makanan hidup kaya nutrisi yang digunakan dalam budidaya ikan dan kerang. Mereka memakan berbagai
sumber makanan seperti mikroalga, jamur, protozoa, bakteri, dan detritus. Copepoda ini dapat mempertahankan diri
bahkan pada saat ketersediaan sumber makanannya rendah. Banyak spesies harpacticoid telah diakui memiliki ciri
khas yang membuat mereka lebih cocok sebagai pakan hidup. Bab ini bertujuan untuk memberikan contoh protokol
sederhana untuk mengisolasi dan mengidentifikasi copepoda harpacticoid.
Kata kunci Copepod, Harpacticoid, Pakan hidup, Akuakultur
1. Perkenalan
Dalam ekosistem perairan, copepoda merupakan persentase terbesar dari

biomassa konsumen. Mereka dikenal sebagai penghubung kunci esensial
karena kemampuannya untuk mentransfer energi dari produsen primer ke
konsumen sekunder tepatnya ke larva dan juvenil ikan [1]. Studi pada tahap
larva mayoritas ikan mengungkapkan bahwa mereka bergantung pada
copepoda untuk sumber makanan utama mereka [2].
Kopepoda merupakan sintesis alami asam lemak esensial seperti asam
lemak tak jenuh ganda (PUFA), yaitu asam eicosapentaenoic (20:5 ÿ-3) dan
asam docosahexaenoic (22:6 ÿ-3) [3] . Banyak spesies copepoda yang
berperan penting dalam akuakultur karena memiliki kapasitas reproduksi
yang tinggi, ukuran induk yang lebih besar, durasi reproduksi yang lebih
lama, populasi betina yang lebih banyak, waktu generasi yang lebih singkat,
waktu turnover yang lebih pendek, pertumbuhan yang lebih cepat, dan
tingkat kelangsungan hidup yang tinggi [4] . Semua fitur ini ditemukan
bertahan di banyak harpacticoid copepoda [5]. Mereka dapat memakan
makanan yang tersedia di alam termasuk bahan organik detrital dan
mikroorganisme seperti bakteri, alga, dan protozoa. Bakteri juga merupakan
salah satu komponen makanan penting untuk harpacticoid copepoda [6].
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7_27,
199
200 MF Yasmeen dan A. Saboor
Banyak pembudidaya akuakultur yang bergantung pada pakan impor untuk

akuakultur yang tidak hanya mahal tetapi juga berisiko memperkenalkan patogen
non-asli penyebab penyakit [7]. Sangatlah penting untuk mengidentifikasi, mengisolasi,
dan mengkulturkan copepoda asli karena secara komparatif lebih cocok sebagai
pakan hidup.
Di antara copepoda, spesies harpacticoid lebih menguntungkan karena
ukurannya yang lebih kecil, profil bergizi tinggi, dan mudah beradaptasi dengan
makanan [8]. Meskipun harpacticoid adalah salah satu pilihan terbaik sebagai pakan
hidup untuk aquafarmers, protokol mereka untuk produksi skala besar masih
tertinggal. Jadi, menjadi perlu untuk memahami taksonomi dan biologi copepoda
harpacticoid untuk mengidentifikasi spesies asli yang membantu merancang protokol
kultur yang tepat untuk kopepoda yang teridentifikasi. Bab ini mengilustrasikan
prosedur untuk mengisolasi dan mengidentifikasi copepoda harpacticoid.
2 Bahan
2.1 Koleksi dari • Jaring plankton.
Sampel Zooplankton
• Sarung tangan. •
Air habitat.
• 10 L kaleng air.
• Tangki kaca.
• Aerator.
• pena pH.
2.2 Isolasi • Saringan plankton.

Copepod Harpacticoid • Sarung tangan.
• Lampu meja. •
Gelas 200 mL.
• Kaca arloji (besar, sedang, dan kecil). • Mikroskop
diseksi. • Pipet Pasteur. • Kuas
halus.
2.3 Identifikasi dari • 5% larutan formaldehida. • 10%

Harpacticoid
gliserol. • 90% etanol.
Copepod
2.3.1 Morfologi
• Benggala mawar (1 g/L). •
Kaca arloji (kecil). • Pipet
Pasteur.
• Slide kaca.
• Mikroskop majemuk teropong dengan kamera.

Isolasi dan Identifikasi Harpacticoid Copepod 201
2.3.2 Kamera Lucida • 5% larutan formaldehida. • Kaca

Gambar arloji (kecil). • Pipet
Pasteur. • Slide kaca.
• Set pembedahan.
• Jarum tungsten. •
kamera lucida.
• Mikroskop majemuk. •
Mikroskop diseksi.
2.3.3 Analisis SEM • Pemindaian mikroskop elektron analisis sampel.
3 Metode
3.1 Pengumpulan • Kumpulkan sampel zooplankton menggunakan jaring plankton bergagang yang
Sampel Zooplankton terbuat dari sutra perbautan dengan ukuran mata jaring 50 ÿm.
• Pindahkan filtrat ke kaleng air 10 L.
• Lakukan pengambilan sampel zooplankton hanya pada dini hari

hari.
• Dengan hati-hati bawalah sampel zooplankton yang terkumpul ke laboratorium
tory dan transfer ke tangki kaca.
3.2 Isolasi • Saring sampel zooplankton yang dipelihara di laboratorium menggunakan

Copepod Harpacticoid saringan plankton.
• Pindahkan filtrat ke kaca arloji besar dan simpan di dekat sumber cahaya.
• Berdasarkan sifat fototaktiknya, copepoda harpacticoid bisa jadi

diisolasi dari sampel zooplankton.
• Gunakan sikat halus atau pipet Pasteur untuk memindahkan harpacticoid
ke kaca arloji ukuran sedang atau kecil yang baru berisi air habitat yang
telah disaring.
3.3 Identifikasi • Pindahkan sampel yang telah difiksasi ke dalam gelas arloji yang berisi
Copepod Harpacticoid campuran etanol dan gliserol (90% etanol dan 10% gliserol) yang
Terisolasi mengandung Rose
3.3.1 Morfologi
bengal (1 g/L). • Tunggu sampai alkohol
menguap. • Tempatkan spesimen pada slide kaca dengan setetes gliserol
dan amati di bawah mikroskop majemuk. •
Memotret struktur seluruh hewan. • Mengidentifikasi
spesies dengan bantuan kunci identifikasi yang disediakan
oleh ahli taksonomi [9-12].
202 MF Yasmeen dan A. Saboor
3.3.2 Kamera Lucida • Tempatkan spesimen tetap pada slide dengan setetes gliserol. •
Gambar Membedah bagian tubuh seperti prosome, urosome, dan appendages. •
Pasang
bagian tubuh yang dibedah. • Pasang
kamera lucida ke mikroskop majemuk. • Amati slide kaca
terpasang dengan sampel di bawah kamera
mikroskop majemuk tetap lusida.
• Amati dan gambar kesan sampel yang jatuh pada
kertas.
• Gambar kamera lucida dapat dijelaskan mengikuti terminologi standar
[13].
3.3.3 Analisis SEM • Perbaiki dan proses sampel menggunakan protokol standar. •
Fotomikrograf spesimen pada berbagai sudut dan perbesaran.
Referensi
1. Gee JM (1989) Tinjauan ekologi dan ekonomi 8. Saboor A, Altaff K (2012) Karakteristik demografi
meiofauna sebagai makanan ikan. Zool J Onychocamptus bengalensis (Cope poda:
Linnean Soc 96(3):243–261 Harpacticoida)–pakan hidup potensial untuk
2. Sampey A, McKinnon AD, Meekan MG, akuakultur. Revelat Sci 2(01):51–57 9.
McCormick MI (2007) Sekilas tentang usus: Bruno MC, Reid JW, Perry SA (2005) Daftar dan
ikhtisar pemberian makan larva ikan pantai kunci identifikasi untuk copepoda Florida (AS)
tropis. Mar Ecol Prog Ser 339:243–257 3. Arndt air tawar yang hidup bebas. J Crustac Biol
C (2013) Menguji kesesuaian har pacticoid 25(3):384–400 10.
copepoda sebagai pakan lar vae ikan laut. Go'mez S, Gee JM (2009) Pada empat spesies baru
Disertasi doktoral, Christian-Albrechts Universit€at Cletocamptus Shmankevich, 1875 (Cope poda:
Kiel Harpacticoida) dari perairan pedalaman
4. Hagiwara A, Lee CS, Shiraishi DJ (1995) Argentina. J Nat Hist 43(45–46):2853–2910 11.
Beberapa karakteristik reproduksi induk Lee W, Huys R (1999) New Normanellidae
harpacticoid copepoda Tigriopus japonicus yang (Copepoda: Harpacticoida) dari rembesan dingin
dibudidayakan pada salinitas berbeda. Fish Sci Pasifik barat termasuk tinjauan genus Normanella.
61(4): Cah Biol Mar 40(3): 203–262 12. Schizas NV,
618–622 5. Sun B, Fleeger JW (1995) Kultur Shirley
massal yang berkelanjutan dari Amphiascoides TC (1994) Onychocamptus Yrusensterni (Copepoda,
Harpacticoida, Laophontidae) – spesies baru
di atas sebuah copepod harpacti coid laut dalam sistem resirkulasi.
Akuakultur 136(3–4):313–321 6. dari Krusen stern Lagoon, Alaska. Crustaceana
Yasmeen MF, Saboor A (2016) Kemampuan 66(2): 227–239 13. Huys R, Boxshall G (1991)
kopepoda harpacticoid untuk menelan bakteri Order of
sebagai makanan. Asian J Multidiscip copepods, Copepod evolution, vol 159. The Ray
7. Stud 4(13):41 FAO (2020) Keadaan Perikanan Society, London, hal 31–314
dan Akuakultur Dunia 2020. Keberlanjutan
dalam Tindakan, Roma, hal 190
INDEKS
A e
Actinomycetes .............................. 183–188, 191, 195, 196 Edwardsiellosis ............................................................... .............122

Actinomycetes Isolation Agar (AIA).... ...... 184, 185, 196 Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) .........................77–81
Aerolisin .............................................. ..............................3, 108 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)............ .. 15, 25, 51, 61,
Aeromonas ................ .......... 3–10, 12, 86, 108, 120, 122, 164, 170 62, 70, 74, 78, 89, 151, 153, 164 Etil-p-
aminobenzoat .............................. .............................. 89
Elektroforesis gel agarosa .................15, 16 , 44, 48, 53, 62, 63, 94, Eksoftalmia .................. ...................................30, 56, 123
95 Uji lapisan
agar................................. ................ 123, 124 Alpha F
hemolisis ........................... .................................... 6
Fetal bovine serum (FBS)................................ 38, 39, 42, 46, 70,
Antijamur............ ................................................... 149 , 169
71, 192
Antioksidan ............................................... .......... 146, 160
Patogen ikan ............................................... .69, 122, 125
Antiparasit.................................... ...................... 173, 174
Flavobacterium ............................................... ...... 19–26, 122
Antivirus ........................ ..............149, 152, 160, 164, 169 API
reagen Folin-Ciocalteu ................................... .............136 Analisis
20E................................. ............................................24, 31 umpan
FTIR................................... ...............................152
aqua. ............................................................... ....................175
G
B
ÿ-hemolisis ............................................... .....................109 Analisis
Penyakit ikan bakteri ............................................................... ......122
GC-MS........................ ....................................152 Motilitas
Bakteriosin ...............................................100, 120, 126–129
meluncur .......... ............................................................... ... 23
Bakteriostatik efek ............................................................... .....100
Beta hemolisis................................................... .................... 6 H
Hidrolase garam empedu (BSH)........................ ......................112
Toleransi empedu ......................... ........................................111 Copepoda harpacticoid........................................ 199–201
Senyawa bioaktif..........................147, 149, 188, 195 Branchiomyces Hemolisis .... ............................................................... ....... 106, 108
demigrans (B. demigrans) ........ ........73–76 Bromocresol Hepatopancreas............................. 29, 38, 39, 42, 43, 46, 47, 78–
80, 154
ungu................................................. ..............89, 91 Pengujian
mikrodilusi kaldu ............................... ...............127 Histopatologi .............................................. ........................ 65
C SAYA
Citrobacter ................................................. ................29–34 Ichthyophonus hofer ............................................... ....69–72 Respon

Minyak cengkeh ................................................ .......................... 89 imun ............................................... ...............168
Kolom ............................................................... ....................122 Imunostimulan ............................... .............. 160, 168 Hipodermal
Cynodon dactylon................................................... .............164 Agar menular .............................................. ..................... 60 Virus Anemia
Cytophaga (CA)................................. ........20, 21, 23 Uji Infeksi Salmon (ISAV)............37, 38, 40
sitotoksisitas................................... ................ 191–193

L
D Bakteri asam laktat (BAL)....................... 86, 91–93, 111, 120, 123–
DNase ............................................................... ...............3, 6, 9, 24 128
Modified Eagle Medium (DMEM) Dulbecco...........192
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3032-7,
© Editor(s) (jika ada) dan Penulis (s), di bawah lisensi eksklusif untuk Springer Science+Business Media, LLC, bagian dari Springer
Nature 2023
203
MIKROBIOLOGI BUDIDAYA
204
Indeks
M RT-LAMP................................................... ...............53, 55 RT-
PCR ......................... ........................... 39–40, 43, 44,
Kelelahan................................................. ....................137
47–48, 51–53, 154
Ganggang laut ........................................136, 145, 146, 149 Obat
feed................................................... 169, 172, 175 Molisch's S
pereaksi ............................................... .........138 Adhesi
mukus ...................................... ......................114 Scanning electron microscopy (SEM) ...............177, 185, 201, 202 Diet
rumput
N laut.................. .................................... 151, 153 Rumput
laut......... ....................................136–138, 142, 143,
Nanodrop................................................... ......................... 31 Nervous
145–147, 149–153
necrosis virus (NNV).................. .................... 41
Serin protease ............................................... .................. 3 Shieh
medium ........................... ..............................20, 21 Ketahanan pelet
P
tunggal ............... ....................................177 Ekstraktor
Patogenisitas .............................................. 3, 29, 142–144 Tes Soxhlet ........... ..............................................161
PCR................................................... .......................... 54 Flagela SYBR Hijau ............................................... .......52, 55, 79

peritrichous ........................ .................................... 31
Filogeni ............ ............................................................... ....26, 45 T
Phytocompounds................................172, 173, 176, 177
Taq polimerase ............................................... ..25, 51, 71 3,3',5,5'-
Probiotik .. ..............................................85–87, 90, 99 , 100, 102, 105,
tetramethylbenzidin .............................. ...... 17 Tilapia lake virus
106, 108–115, 119, 120, 130, 163
(TiLV)............................................ ......49–57 Uji waktu
mati ............................................... ................. 127, 128 Jumlah hemosit
Q
total (THC) ........................ ............154 Mikroskopi elektron transmisi
Quercetin................................................................ ......................136 (TEM) ............ 56, 57, 65, 81 Reagen Trizol.......... ....................................
38, 39,
R 42, 46
Acak DNA polimorfik diamplifikasi (RAPD-

Z
PCR) ............................................... ............. 95 Heksamer
acak................................... ........................ 38 Zona hambat...................................... 102, 110, 111, 124–126 , 143,
Sel darah merah (RBC) ....................................... 187, 188 152, 188, 196, 197
Rhabdoviridae . ............................................................... .............. 45 Zooplankton....................................... ................. 200, 201
Roseobacter .............................................................. ........................ 87

Aquaculture Microbiology

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Aquaculture Microbiology

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Machine Translated by Google

BUKU PEGANGAN S PRINGER P ROTOCOLS

Untuk volume lebih

Pusat Nanobioteknologi, Institut Teknologi Vellore, Vellore, Tamil Nadu, India

ISSN 1949-2448 ISSN 1949-2456 (elektronik)

Vellore, Tamil Nadu, India John Thomas

kata pengantar. . ............................................................... ................. ay

BAGIAN I ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PATOGEN DARI IKAN

1 Isolasi dan Identifikasi Aeromonas sp. dari Ikan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

12 Isolasi dan Identifikasi Parasit Microsporidian, Enterocytozoon

BAGIAN II ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PROBIOTIK

16 Aktivitas Antibakteri Bakteri Probiotik dari Akuakultur. . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Mahalakshmi S.

BAGIAN III METODE PENGOBATAN INFEKSI PADA IKAN DAN UDANG

17 Pembuatan Ekstrak Alga Laut (Rumput Laut) dan Kuantifikasi

BAGIAN IV PENGOBATAN MENGGUNAKAN TANAMAN OBAT

21 Pengobatan Menggunakan Tanaman Obat Pada Ikan dan Udang. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159

BAGIAN V AQUATIC ACTINOMYCETES DAN COPEPODS

23 Isolasi dan Identifikasi Actinomycetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Haimanti

Isolasi dan Identifikasi Patogen dari Ikan

Isolasi dan Identifikasi Aeromonas sp. dari Ikan

Kata kunci Bakteri penyakit ikan, Aeromonas, Isolasi, Identifikasi, Karakterisasi

Aeromonas spp. adalah patogen oportunistik yang sering

4 Mirunalini Ganesan dkk.

patofisiologi dan epidemiologi A. veronii, sangat penting untuk mengeksplorasi

2.1 Isolasi • Ikan yang terinfeksi.

2.2 Metode • Lihat manual laboratorium mikrobiologi standar.

Isolasi dan Identifikasi Aeromonas sp. dari Ikan 5

• Terakhir suspensikan pelet dengan 1 mL PBS steril. •

6 Mirunalini Ganesan dkk.

Hasil untuk spesies berikut

Membentuk tongkat tongkat tongkat tongkat tongkat

Gas dari glukosaa + + +

H2S dari L-sistein + Nd

Isolasi dan Identifikasi Aeromonas sp. dari Ikan 7

Hasil untuk spesies berikut

Karakteristik A. hydrophila A. caviae A. sobria A. veronii A. salmonicida

Sakarosa (sukrosa)a ++++ +

8 Mirunalini Ganesan dkk.

Hasil untuk spesies berikut

Karakteristik A. hydrophila A. caviae A. sobria A. veronii A. salmonicida

Isolasi dan Identifikasi Aeromonas sp. dari Ikan 9

• Kehadiran zona tidak berwarna yang berbeda di sekitar koloni menunjukkan

ditunjukkan dengan munculnya zona bening di sekitar koloni. Setiap suspensi

• Aktivitas gelatinase ditunjukkan dengan munculnya zona bening di sekitar koloni.

3.4.3 Aktivitas Lipolitik • Oleskan 5 mL suspensi ke resazurin-butter agar dan incu

• Kehadiran koloni merah muda menunjukkan aktivitas lipase.

pada cawan dan inkubasi pada

• Lingkaran merah muda di sekitar koloni menunjukkan aktivitas nuklease.

suspensi bakteri pada cawan dan inkubasi pada

Tambahkan 200 ÿM masing-masing dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP.

Tambahkan 5 ÿL 1 penyangga PCR (50 mM KCL, 10 mM Tris–HCl,

Tambahkan 5 ÿL 2,5 mM MgCl2.

10 Mirunalini Ganesan dkk.

Tambahkan 2 ÿL dari 5 pM dari setiap primer.

Tambahkan 3 ÿL dari 10 ng DNA genom.

Lakukan PCR dengan ketentuan sebagai berikut: denaturasi pada 93 C selama 3

Isolasi dan Identifikasi Penyebab Edwardsiellosis

Sakthinarenderan Sai, Ravi Mani, dan Mirunalini Ganesan

Edwardsiellosis adalah wabah bakteri penting di sebagian besar

12 Sakthinarenderan Sai dkk.

2.1 Isolasi • Ikan yang terinfeksi.

2.2 Metode • Lihat manual laboratorium mikrobiologi standar.

1. EtfD- F 5ÿGGTAACCTGATTTGGCGTTC 3ÿ.