Fixation of Histology Samples:

Principles, Methods and Types

of Fixatives

Dinna Rakhmina, S.Si., M.Sc

2 Fiksasi
⏷ Langkah pertama dari setiap teknik laboratorium
histologis dan sitologis.
⏷ Proses di mana sel-sel dalam jaringan difiksasi
dalam keadaan kimia dan fisik, dan semua
aktivitas biokimia dan proteolitik di dalam sel
dicegah sehingga sel atau jaringan dapat
menahan setiap perubahan atau distorsi atau
dekomposisi morfologis.
⏷ Fiksasi membantu mempertahankan jaringan
agar mirip dengan keadaan aslinya.
3 Tujuan Fiksasi

1. Mengawetkan jaringan agar tetap memiliki kemiripan sifat

dengan keadaan hidupnya
2. Mencegah perubahan bentuk dan ukuran jaringan pada saat
pemrosesan
3. Mencegah autolisis
4. Membuat jaringan menjadi keras
5. Mencegah pertumbuhan bakteri di dalam jaringan
6. Memungkinkan membantu menghasilkan pewarnaan yang
lebih bening dan jernih
7. Memiliki kualitas optik sel yang lebih baik
4 Syarat Larutan Fiksasi Ideal
1. Mampu mencegah autolisis sel atau jaringan
2. Mampu mencegah pembusukan jaringan oleh bakteri
3. Mampu mempertahankan volume dan bentuk sel semaksimal
mungkin
4. Menghasilkan pewarnaan berkualitas tinggi secara konsisten terutama
pewarnaan rutin seperti pewarnaan hematoksilin & eosin dan
pewarnaan Papanicolaou
5. Dapat bereaksi cepat
6. Murah
7. Tidak beracun
5 Efek Fiksasi Pada Jaringan

✔ Menyebabkan perubahan permeabilitas membran,

penghambatan enzim yang bertanggung jawab untuk
respirasi, dan perubahan transpor ion Na+.

Formaldehida dapat menyebabkan penyusutan

01
✔
Perubahan Volume
volume sebesar 33%.

✔ ketika glutaraldehid dan osmium tetroksida digunakan

sebagai fiksasi dalam resin epoksi maka terjadi
peningkatan ukuran sel sebesar 70%
6 Efek Fiksasi Pada Jaringan

Pengerasan Fiksasi mengubah konsistensi jaringan, dan sejumlah pengerasan

02
✔

Jaringan terjadi karena fiksasi.

✔ Fiksasi dapat menyebabkan hambatan pewarnaan enzim.

Gangguan
03 Pewarnaan
✔ Formaldehida menonaktifkan 80% enzim ribonuklease.

✔ Osmium tetroksida menghambat pewarnaan hematoksilin dan eosin.

Perubahan Fiksasi dapat menyebabkan perubahan kerapatan optik inti, dan inti
04
✔

Kerapatan Optik mungkin terlihat seperti kental padat dan hiperkromatik.

 Tipe & Klasifikasi Fiksasi
7
 Tindakan Pencegahan Selama
8 Proses Fiksasi

Jaringan harus bebas dari

darah yang berlebihan Jaringan harus dipotong
sebelum dimasukkan ke tipis setebal 3–5 mm.
dalam fiksatif.

Jumlah cairan fiksatif harus Jaringan dengan fiksatif

20 kali lebih banyak dari harus dalam botol yang
volume jaringan. tertutup rapat
 Gambar manakah yang tepat
digunakan untuk melakukan fiksasi
jaringan ?

9
”
10

(1) (2)
11
 Faktor-faktor yang
12 Mempengaruhi Fiksasi

1. pH Larutan Fiksasi

▹ pH netral lebih disukai.

▹ pH 6–8 adalah kisaran terbaik.
▹ Keasaman atau alkalinitas tinggi mengganggu fiksasi
 Faktor-faktor yang
13 Mempengaruhi Fiksasi

2. Suhu

▹ Suhu kamar baik untuk fiksasi jaringan, dan tidak ada perbedaan morfologi sel dari
0 sampai 45 °C.
▹ Waktu fiksasi dapat dikurangi pada suhu yang lebih tinggi (60–65 °C). Pada suhu
yang lebih tinggi getaran dan pergerakan molekul meningkat. Hal ini meningkatkan
tingkat penetrasi fiksatif di dalam jaringan dan mempercepat proses fiksasi.
▹ Dalam kasus suhu yang sangat tinggi, antigen di dalam jaringan dapat dihancurkan.
(INGAT !!!!)
▹ Enzim lebih awet pada suhu yang lebih rendah, dan untuk histokimia enzim 0–4 °C
lebih cocok.
 Faktor-faktor yang
14 Mempengaruhi Fiksasi 3. Durasi Fiksasi
▹ Kedalaman penetrasi fiksatif berbanding lurus dengan akar kuadrat waktu fiksasi.
Difusibilitas fiksatif yang berbeda juga dapat bervariasi.
▹ Koef difusi formaldehyde = 0.78
▹ Ket : D = Kedalaman penetrasi; T = Lamanya waktu; k = Koef difusi fiksatif
▹ Laju penetrasi larutan formalin adalah 1 mm/jam. Kehadiran darah dapat
menghambat penetrasi fiksatif. Oleh karena itu sebaiknya cuci spesimen jaringan
secara menyeluruh sebelum memasukkannya ke dalam fiksatif.
▹ Jaringan harus dipotong menjadi 3-5 mm. Keseluruhan formalin memperbaiki
jaringan dalam waktu 24 jam (jaringan besar) dan 6 jam (jaringan kecil) .
▹ Fiksasi yang berkepanjangan dapat menyebabkan hilangnya lipid dan protein dan
penurunan yang signifikan dari aktivitas enzimatik sel serta dapat menyebabkan
pengerasan jaringan.
 Faktor-faktor yang
15 Mempengaruhi Fiksasi 3. Durasi Fiksasi

Spesimen cukup besar

 slicing 0,5 – 1 cm

Spesimen usus  buka dan hilangkan feces

 Faktor-faktor yang
16 Mempengaruhi Fiksasi

4. Osmolaritas Larutan Fiksasi

▹ Osmolalitas fiksatif memiliki efek yang cukup besar pada fiksasi.

▹ Larutan fiksatif hipertonik menyebabkan penyusutan sel, sedangkan larutan fiksatif
hipotonik menginduksi pembengkakan sel.
▹ Larutan fiksatif terbaik untuk penggunaan rutin di laboratorium adalah larutan
fiksatif hipertonik ringan (400–450 mOsm).
 Faktor-faktor yang
17 Mempengaruhi Fiksasi

5. Konsentrasi Larutan Fiksasi

▹ Konsentrasi fiksatif yang sangat rendah memperpanjang waktu fiksasi, dan

konsentrasi yang lebih tinggi menyebabkan fiksasi cepat.
▹ Namun, konsentrasi fiksatif yang lebih tinggi dapat menyebabkan pengerasan
jaringan, penyusutan jaringan dan perubahan artefak. Konsentrasi fiksatif yang
sedikit lebih rendah dengan pH netral diperlukan untuk fiksasi yang tepat.
▹ Konsentrasi formaldehida yang optimal adalah 10%.
 Faktor-faktor yang
18 Mempengaruhi Fiksasi

6. Agitasi

▹ Agitasi meningkatkan laju penetrasi.

▹ Agitasi cepat: merusak jaringan halus.
▹ Lebih disukai agitasi lembut yang lambat.
 Bagaimana cara yang tepat untuk
melakukan fiksasi organ berikut ?

19
”
20

Hepar
 Fiksatif yang Biasa Digunakan di
21 Laboratorium

Larutan Fiksasi Formaldehyde

▹ Tersedia secara komersial sebagai konsentrasi 40% (dianggap sebagai formalin

100%)
▹ 10% formalin ini digunakan untuk membuat formalin buffer netral.
▹ Mekanisme: Bereaksi dengan berbagai rantai samping protein dan membentuk
gugus samping hidroksimetil yang kemudian berikatan silang untuk membentuk
jembatan metilen. Selanjutnya terjadi ikatan silang antar molekul dan intramolekul
dari molekul dan akhirnya menghasilkan produk yang tidak larut.
▹ Tingkat penetrasi: Formalin menembus sekitar 1 mm/jam.
▹ Volume formalin: Jumlah formalin harus 20 kali volume jaringan.
22 Larutan Fiksatif Formaldehyde
Kelebihan
 Tingkat penetrasi formalin tinggi.
 Morfologi sel terjaga dengan baik dalam formalin.
 Murah.
 Stabil.
 Mudah untuk membuat larutannya.
 Formalin adalah fiksasi yang efektif untuk
pewarnaan laboratorium rutin pada jaringan.
Kekurangan
 Fiksasi lambat.
 Reaksi formalin dengan jaringan bersifat reversibel,
dan dapat dihilangkan dengan pencucian.
 Formalin gagal mengawetkan asam
mukopolisakarida.
 Jaringan yang sangat vaskular memiliki butiran
coklat tua (artefak).
 Paparan pada kulit dapat menyebabkan dermatitis.
 Penghirupan kronis dapat menyebabkan bronkitis.
 Cara Membuat Larutan Neutral
23 Buffered Formalin 10% (NBF)

 40% formaldehid 100 ml

 Aquadest 900 ml
 Sodium dihydrogen fosfat 4 gr
 Disodium hydrogen fosfat 6.5 gr
24

Perbandingan berbagai
fiksatif
25 Pilihan fiksatif berdasarkan teknik
26 Fiksatif pilihan menurut jaringan
 Fiksatif pilihan untuk zat yang
27 berbeda
28 Fixation Artefact

Artefak fiksasi berikut mungkin ditemui dalam fiksasi laboratorium rutin dengan
formalin :
 Formalin tanpa buffer jika disimpan untuk waktu yang lama akan berubah menjadi
asam format yang bereaksi dengan turunan hemoglobin dari darah dan
menghasilkan asam formaldehida haematein yang merupakan pigmen
birefringent granular hitam kecoklatan yang tidak larut.
 Fixation Artefact
29

Mikrofotograf menunjukkan Pemisahan jaringan karena

pigmen formalin butiran hitam fiksasi berkepanjangan. Jaringan
kecoklatan. (pewarnaan menunjukkan lubang dan ruang
hematoksilin dan eosin ×400) kosong di dalamnya (pewarnaan
hematoksilin dan eosin ×200)
30 Troubleshooting in Fixation
 to be continued .....

31
”
 What are the things that need to be
done when collecting histology
samples ?

32
”
 Specimen collection and transport
33
I. Hindari trauma mekanik
2. Hindari keringnya spesimen
3. Hindari efek termal
4. Hindari efek kimiawi
5. Pelabelan spesimen
6. Fiksasi spesimen dengan benar
7. Pastikan spesimen terfiksasi dalam jumlah cukup dan kontainer yang memadai
8. Cek pH cairan fiksasi
9. Perhatikan fiksasi pada spesimen jaringan yang besar
10. Hindari penundaan yang tak perlu
11. Tangani spesimen dengan hati-hati
 1. Hindari trauma mekanik
34
 2. Hindari keringnya spesimen
35
 3. Hindari efek termal
36
 4. Hindari efek kimiawi
37
 5. Pelabelan spesimen
38
 6. Fiksasi spesimen dengan benar
39
 6. Fiksasi spesimen dengan benar
40
 7. Pastikan spesimen terfiksasi dalam jumlah
41 cukup dan kontainer yang memadai
 8. Cek pH cairan fiksasi
42
 9. Perhatikan fiksasi pada spesimen jaringan
43 yang besar
44 10. Hindari penundaan yang tak perlu
45 11. Tangani spesimen dengan hati-hati
 Grossing
46
1. Cek status fiksasi jaringan
2. Potong jaringan tipis-tipis
3. Hindari trauma pada spesimen
4. Hindari kontaminasi antar spesimen
5. Hati-hati dengan alas/kertas pembungkus spesimen
6. Pemilihan kaset yang benar
7. Hindari kaset yang terlalu penuh
8. Pelabelan kaset yang jelas
47 1. Cek status fiksasi jaringan
48 2. Potong jaringan tipis-tipis
49 3. Hindari trauma pada spesimen
50 4. Hindari kontaminasi antar spesimen

Jaringan Paru

Jaringan hati
 5. Hati-hati dengan alas/kertas pembungkus
51 spesimen
52 6. Pemilihan kaset yang benar
53 7. Hindari kaset yang terlalu penuh
54 8. Pelabelan kaset yang jelas
 Sekian......

55
”