Metode Rekayasa Genetika Dan Molekuler

A. Tujuan Pembelajaran

1. Memahami Metode Rekayasa Genetika dan

Molekuler.
2. Mampu Memahami Arus Informasi Genetik dan
Struktur dari DNA dan RNA.
3. Mampu Memahami Enzim dan Teknik rekayasa genetik

B. Materi
Modifikasi yang disengaja dari informasi genetik suatu organisme
dengan secara langsung mengubah genom asam nukleatnya disebut rekayasa
genetika dan dicapai dengan sekelompok metode yang dikenal sebagai teknologi
DNA rekombinan.

 DNA
Struktur asam deoksiribonukleat (DNA) menyediakan kode kompleks
yang mengkode untuk sintesis protein. DNA sebagai molekul menunjukkan
banyak fitur menarik. Salah satu sifat DNA yang berguna adalah bahwa ia siap
menganil, artinya ia mengubah sifat pengikatannya sebagai respons terhadap
pemanasan dan pendinginan. Paparan suhu tepat di bawah titik didih (90-95"C)
menyebabkan DNA menjadi terdenaturasi sementara. Ketika panas memutuskan
ikatan hidrogen yang menjaga heliks ganda tetap bersama, DNA akan terpisah
secara longitudinal menjadi dua untai. Setiap untai menampilkan kode
nukleotidanya sehingga DNA dalam bentuk ini dapat diuji atau direplikasi.
Ketika pemanasan diikuti dengan pendinginan bertahap, dua untai DNA tunggal
bergabung kembali (renature) oleh ikatan hidrogen di tempat yang saling
melengkapi. Annealing adalah fitur penting dari reaksi berantai polimerase (PCR)
dan probe asam nukleat dijelaskan kemudian.
  Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika atau rekombinan DNA merupakan kumpulan teknik-

teknik eksperiental yang memungkinkan peneliti untuk
mengisolasi,mengidentifikasi, dan melipatgandakan suatu fragmen dari materi
genetika (DNA) dalam bentuk murninya. Rekayasa genetika merupakan dasar
dari bioteknologi yang didalamnya meliputi manipulasi gen, cloning gen, DNA
rekombinan, teknologi modifikasi genetic, dan genetika modern dengan
menggunakan prosedur identifikasi, replikasi, modifikasi dan transfer materi
genetic dari sel, jaringan maupun organ. Rekayasa genetika adalah aplikasi ilmu
pengetahuan untuk kebutuhan sosial. Dalam beberapa tahun terakhir, rekayasa
berdasarkan genetika bakteri telah mengubah biologi. Fragmen DNA tertentu
dapat diisolasi dan diperkuat, dan gennya dapat diekspresikan pada tingkat tinggi.
Spesifisitas nukleotida, yang diperlukan untuk pembelahan oleh enzim restriksi,
memungkinkan fragmen yang mengandung gen atau bagian gen untuk terikat
secara kovalen dengan plasmid (vektor) yang kemudian dapat dimasukkan ke
dalam inang bakteri.

Koloni atau klon bakteri yang membawa gen tertentu diidentifikasi

melalui hibridisasi DNA atau RNA dengan probe kimia atau radio kimia. Atau,
produk protein yang dikodekan oleh gen dikenali baik oleh aktivitas enzim atau
dengan teknik logika imun. Dengan demikian, teknik rekayasa genetika
digunakan untuk mengisolasi hampir semua gen dengan sifat biokimia yang
dapat dikenali.

 Persiapan Fragmen DNA dengan Enzim Restriksi

Salah satu tujuan memperoleh suatu daerah DNA dalam suatu genom
adalah untuk melakukan perbanyakan (cloning ). Untuk memperoleh suatu urutan
DNA tersebut maka dilakukan pemotongan genom DNA menadi frgamen-
fragmen dengan menggunakan enzim tertentu yang mampu memotong ikatan
fosfodieter pada untaian DNA tersebut yakni berupa enzim restriksi.
 Keragaman genetik bakteri tercermin dalam rentang enzim restriksi yang
luar biasa, yang memiliki selektivitas luar biasa yang memungkinkan mereka
mengenali daerah spesifik DNA untuk usia pembelahan. Sekuens DNA yang
dikenali oleh enzim restriksi adalah pra-dominan palindrom (pengulangan
sekuens inwerted). GAATTC adalah sekuens palindrom yang khas, dikenali oleh
enzim restriksi ecori yang sering digunakan. Pengulangan terbalik, yang melekat
pada komplementaritas pasangan basa G-C dan A-T, menghasilkan urutan 5'
TTC yang direfleksikan sebagai AAG dalam untai 3'.

Kebanyakan enzim restriksi mengenali 4, 6, atau 8 basa urutan; namun,

enzim restriksi lainnya mengenali 10, 11, 12, atau 15 urutan basa. Enzim restriksi
yang mengenali 8 basa menghasilkan fragmen dengan ukuran tipikal 64.000 bp
dan berguna untuk analisis daerah genetik yang besar. Enzim restriksi yang
mengenali lebih dari 10 basa berguna untuk konstruksi peta fisik dan untuk
pengetikan molekuler dengan elektroforesis gel medan-pulsa.

 Pemisahan Fisik Fragmen DNA Berukuran Berbeda

Sebagian besar kesederhanaan yang mendasari teknik rekayasa genetika

terletak pada kenyataan bahwa elektroforesis gel memungkinkan fragmen DNA
untuk dipisahkan berdasarkan ukuran. Semakin kecil fragmennya, semakin cepat
migrasinya. Laju migrasi keseluruhan dan kisaran ukuran optimal untuk
pemisahan ditentukan oleh sifat kimia gel dan derajat ikatan silangnya. Gel
dengan ikatan silang yang tinggi mengoptimalkan pemisahan fragmen DNA
kecil. Pewarna etidium bromida membentuk warna fluoresen cerah saat berikatan
dengan DNA, sehingga sejumlah kecil fragmen DNA yang terpisah dapat difoto
pada gel. Fragmen DNA spesifik dapat dikenali dengan probe yang mengandung
sekuens komplementer.

Elektroforesis gel bidang berdenyut memungkinkan pemisahan fragmen DNA

yang mengandung hingga 100.000 bp (100 pasangan kilobase, atau kbp).
Karakterisasi fragmen besar tersebut memungkinkan konstruksi peta fisik untuk
kromosom dari beberapa spesies bakteri.
  Enzim untuk Dicing, Splicing, dan Membalikkan Asam Nukleat

Endonuklease restriksi: Untaian polinukleotida dari DNA juga dapat

dipotong melintang pada posisi yang dipilih dengan enzim yang disebut
endonuklease restriksi. Enzim ini mengenali DNA asing dan mampu mencerna
atau menghidrolisis ikatan DNA. Kehadiran enzim dalam sel bakteri melindungi
bakteri terhadap DNA bakteri riofag atau plasmid yang tidak kompatibel.

Di laboratorium, enzim restriksi endonuklease dapat digunakan untuk

membelah DNA pada tempat yang diinginkan dan merupakan suatu keharusan
untuk teknik teknologi DNA rekombinan. Sejauh ini, ratusan restriksi
endonuklease telah ditemukan pada bakteri. Setiap jenis memiliki urutan 4-10 bp
yang diketahui sebagai targetnya, sehingga lokasi pemotongan dapat dikontrol
dengan baik. Endonuklease diberi nama dengan menggabungkan huruf pertama
genus bakteri, dua huruf pertama spesies, dan nomor endonuklease. Misalnya,
ecori adalah endonuklease pertama yang ditemukan pada Escherichia coli dan
hindiii adalah endonuklease ketiga yang ditemukan pada tipe Haemophilus
influenzae.

Polimorfisme panjang fragmen restriksi: Potongan DNA yang dihasilkan

oleh endonuklease restriksi disebut fragmen restriksi. Karena genom anggota
spesies yang sama dapat bervariasi dalam pola pemotongan oleh endonuklease
spesifik, perbedaan genetik dapat dideteksi dengan polimorfisme panjang
fragmen restriksi (rflps).

Ratusan situs pembelahan yang menghasilkan RFLPS didistribusikan ke seluruh

genom. Karena RFLPS berfungsi sebagai jenis penanda genetik, mereka dapat
membantu menemukan lokasi spesifik di sepanjang untai DNA. RFLP dengan
demikian berguna dalam persiapan peta gen dan profil DNA, dan juga dalam
analisis hubungan genetik.
  Ligase: Ini adalah enzim yang diperlukan untuk menutup ujung lengket
bersama-sama Cl dengan menggabungkan kembali ikatan fosfat-gula
yang dipotong oleh endonuklease, ing Aplikasi utamanya adalah dalam
penyambungan akhir gen menjadi plasmid dan kromosom.

 Reverse transcriptase: Ini adalah enzim, paling dikenal karena perannya

dalam replikasi virus AIDS dan retrovirus lainnya. Enzim DNA ini
digunakan oleh ahli genetika sebagai alat yang berharga untuk mengubah
RNA kerja menjadi DNA.

 DNA komplementer: Salinan yang disebut DNA komplementer, atau

cdna, dapat dibuat dari messenger, transfer, ribosom, dan bentuk RNA
lainnya. Teknik ini menyediakan sarana yang berharga untuk mensintesis
gen eukariotik dari transkrip mrna. Keuntungannya adalah gen yang
disintesis akan bebas dari sekuens intervening (intron) yang dapat
mempersulit pengelolaan gen eukariotik dalam rekayasa genetika. DNA
komplementer juga dapat digunakan untuk menganalisis urutan
nukleotida RNA, seperti yang ditemukan di ribosom dan RNA transfer.

 Metode yang Digunakan untuk Mengukur, Mensintesis, dan

Mengurutkan DNA

Ukuran relatif asam nukleat biasanya diketahui dengan jumlah pasangan

basa atau nukleotida yang dikandungnya. Misalnya, sekuens palindromik yang
dikenali oleh endonuklease biasanya panjangnya 4-10 bp. Gen rata-rata dalam E.
Coli adalah sekitar 1300 bp, atau 1,3 kilobase (kb), dan seluruh genomnya adalah
sekitar 4,7 juta pasangan basa (Mb). Virus Epstein-Barr, penyebab
mononukleosis menular, memiliki gen 172 kb. Manusia memiliki sekitar 3,5
miliar pasangan basa (Bbp) yang tersusun di sepanjang 46 kromosom.

Oligonukleotida adalah potongan DNA atau RNA yang sangat pendek.

Panjangnya bervariasi dari 2 hingga 200 bp, meskipun yang paling umum adalah
sekitar 20-30 bp. Mereka dapat diisolasi dari sel atau dibuat khusus oleh
penyintesis DNA yang membatasi panjangnya menjadi sekitar 200 nukleotida.
 Probe hibridisasi digunakan secara rutin dalam kloning DNA. Urutan
asam amino protein digunakan untuk menyimpulkan urutan DNA dari mana
probe dapat dibangun dan digunakan untuk mendeteksi koloni bakteri yang
mengandung kloning. Gen. Cdna, dikodekan oleh mrna, digunakan untuk
mendeteksi gen yang mengkode mrna.

 Jenis Hibridisasi

 Northern blot: Hibridisasi DNA menjadi RNA dikenal sebagai Northern

blot, yang memberikan informasi kuantitatif tentang sintesis RNA.

 Southern blot: Hibridisasi DNA menjadi DNA dikenal sebagai Southern

blot. Metode ini berguna untuk mendeteksi sekuens DNA spesifik pada
fragmen restriksi yang dipisahkan pada gel. Bercak ini dapat digunakan
untuk mendeteksi fragmen restriksi yang tumpang tindih.

 Western blot: Ini adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi gen,
di mana antibodi digunakan untuk mendeteksi gen kloning dengan
mengikat produk protein mereka.

Menempelkan fragmen ini memungkinkan untuk mengisolasi daerah

mengapit DNA dengan teknik yang dikenal sebagai berjalan kromosom.

 Pengurutan DNA

Sekuensing DNA menunjukkan struktur gen yang membantu para peneliti untuk
mengetahui struktur produk gen.

Point kunci
Sekuensing DNA memiliki banyak aplikasi sebagai berikut:
 Informasi yang diperoleh dengan sekuensing DNA membuatnya
mungkinuntuk memahami atau mengubah fungsi gen.
  Analisis uruta DNA menunjukkan daerah pengatur yang mengontrol
ekspresi gen dan “titik panas” genetic yang sangat rentan terhadap
mutasi.
 Perbandingan urutan DNA ditunjukkan dengan hubungan evolusioner
yang menyediakan kerangka kerja untuk klasifikasi pasti mikroorganisme
termasuk virus.
 Perbandingan urutan DNA memfasilitasi identifikasi daerah yang
dilestarikan, yang brguna untuk pengembangan probe hibridisasi spesifik
untuk mendeteksi mikroorganisme termasuk virus dalam sampel klinis.

Teknik Maxam-Gilbert dan metode Sanger (terminasi dideoksi) adalah

dua metode yang digunakan secara rutin untuk penentuan urutan DNA. Teknik
Maxam-Gilbert tergantung pada tanggung jawab kimia relatif dari ikatan
nukleotida yang berbeda, sedangkan metode Sanger menyela pemanjangan urutan
DNA dengan memasukkan dideoksinukleotida ke dalam urutan.

 Probe Asam Nukleat

Probe asam nukleat adalah segmen DNA dan RNA yang diberi label
dengan radioisotop atau enzim yang dapat berhibridisasi menjadi asam nukleat
komplementer dengan tingkat spesifisitas yang tinggi. Probe hibridisasi memiliki
nilai praktis, karena dapat mendeteksi urutan nukleotida spesifik dalam sampel
yang tidak diketahui. Probe membawa molekul reporter, seperti label radioaktif,
yang merupakan isotop yang memancarkan radiasi, atau label luminescent, yang
mengeluarkan cahaya tampak. Reaksi dapat diungkapkan dengan menempatkan
film fotografi dalam kontak dengan reaksi uji. Probe fluoresen mengandung
pewarna yang dapat divisualisasikan dengan sinar ultraviolet. Probe dapat
digunakan dalam berbagai prosedur analitik.

Dua asam nukleat yang berbeda dapat berhibridisasi dengan bersatu di tempat
komplementernya. Semua kombinasi yang berbeda dimungkinkan: DNA untai
tunggal dapat bersatu dengan DNA untai tunggal atau RNA lainnya, dan RNA
dapat berhibridisasi dengan RNA lain. Properti ini membentuk dasar pelacak
otida oligonukle yang diformulasikan secara khusus yang disebut probe gen.
Point kunci
Aplikasi Probe DNA
Probe DNA adalah metode nonamplifikasi, mereka hanya mendeteksi
DNA dalam spesimen tetapi tanpa amplifikasi yang sama. Probe DNA memiliki
banyak aplikasi sebagai berikut.

 Sejumlah probe DNA telah dikembangkan untuk identifikasi isolat kultur

dan untuk berbagai kegunaan dalam mikrobiologi klinis dengan (a)
deteksi langsung mikroba dalam spesimen klinis dan (b) dengan
identifikasi organisme setelah isolasi budaya.
 Beberapa daerah DNA manusia menunjukkan variabilitas substansial
dalam distribusi situs restriksi. Variabilitas ini disebut polimorfisme
panjang fragmen restriksi. Probe oligonukleotida yang berhibridisasi
dengan fragmen DNA RFLP dapat digunakan untuk melacak DNA dari
sampel kecil ke donor manusianya. Dengan demikian, teknik ini berharga
untuk ilmu forensik.

 Aplikasi RFLP untuk pengobatan mencakup identifikasi daerah genetik

yang terkait erat dengan gen manusia dengan disfungsi yang
digabungkan dengan penyakit genetik. Informasi ini. akan menjadi
bantuan yang berharga dalam konseling genetik.
  Reaksi Rantai Polimerase

Pada tahun 1983, Kary Mullis mengembangkan teknik baru yang

memungkinkan untuk mensintesis sejumlah besar fragmen DNA tanpa
mengkloningnya. Teknik ini disebut rantai polymerase reaksi (PCR) dan
memiliki kepentingan praktis yang besar dan dampak pada bioteknologi. Dengan
teknik ini, sejumlah besar urutan DNA tertentu dapat disiapkan.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan
(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi
oleh dua buah primer oligonukleotida.
Dalam PCR, urutan oligonukleotida yang identik dengan yang mengapit urutan
target pertama kali disintesis. Oligonukleotida sintetik ini biasanya panjangnya
sekitar 20 nukleotida dan berfungsi sebagai primer untuk sintesis DNA. Potongan
mulai dari ukuran kurang dari 100 bp hingga beberapa 1000 bp panjangnya dapat
diperkuat, dan hanya diperlukan 10-100 pmol primer. Konsentrasi DNA target
bisa serendah 10-15 L

Campuran reaksi untuk PCR mengandung (a) DNA target (b) kelebihan
yang sangat besar dari primer yang diinginkan, (c) polimerase DNA termostabil,
dan (d) empat deoksiribonukleosida trifosfat. Hanya DNA polimerase yang dapat
berfungsi pada suhu tinggi yang dapat digunakan dalam teknik PCR. Taq poli
merase dari bakteri termofilik Thermus aquaticus dan Vent polimerase dari
Thermococcus litoralis adalah dua enzim populer yang digunakan dalam PCR.

Siklus PCR berlangsung dalam tiga langkah sebagai berikut:

a. DNA target yang mengandung urutan yang akan diamplifikasi

didenaturasi dengan panas untuk memisahkan untaian
komplementernya. Biasanya DNA target memiliki panjang antara 100
dan 5000 bp.
b. Suhu diturunkan sehingga primer dapat menyatu dengan DNA di kedua
sisi urutan target. Karena primer hadir secara berlebihan, untaian DNA
yang ditargetkan biasanya anil ke primer daripada satu sama lain.
c. DNA polimerase memperluas primer dan mensintesis salinan ukuran
sekuens DNA target menggunakan deoksiri bonukleosida trifosfat.

Pada akhir satu siklus, urutan target pada kedua untai disalin. Ketika
siklus tiga langkah diulang, empat helai dari siklus pertama disalin untuk
menghasilkan delapan fragmen. Siklus ketiga menghasilkan 16 produk. Secara
teoritis, 20 siklus akan menghasilkan sekitar satu juta salinan urutan DNA target,
dan 30 siklus menghasilkan sekitar satu miliar salinan.

Teknik PCR kini telah otomatis dan dilakukan melalui mesin yang
dirancang khusus yang disebut thermocy cler. Saat ini, mesin thermocycler atau
PCR dapat melakukan 25 siklus dan mengamplifikasi DNA 10' kali hanya dalam
57 menit. Selama siklus khas, DNA didenaturasi pada 94°C selama 15 detik,
kemudian primer dianil dan diperpanjang (langkah 2 dan 3) pada 68°C selama 60
detik. Teknologi PCR terus berkembang dan mengalami banyak perubahan
sebagai berikut:
 Saat ini, RNA dapat digunakan secara efisien dalam prosedur PCR. The
DNA polimerase, Thermas rekombinan thermophilus DNA polimerase,
akan mentranskripsi RNA menjadi DNA dan kemudian mengamplifikasi
DNA. RNA seluler dan virus RNA dapat dipelajari bahkan ketika RNA
hadir dalam jumlah yang sangat kecil (sedikitnya 100 salinan dapat
ditranskripsi dan diperkuat).
 Juga, PCR dapat mengukur produk DNA tanpa menggunakan isotop.
Hal ini memungkinkan seseorang untuk menemukan jumlah awal DNA
target dalam waktu kurang dari satu jam menggunakan peralatan
otomatis. PCR kuantitatif cukup berharga dalam studi virologi dan
ekspresi gen.
 Seperti disebutkan sebelumnya, DNA target yang akan diamplifikasi
biasanya panjangnya kurang dari sekitar 5000 bp. Teknik PCR panjang
telah dikembangkan yang akan memperkuat sekuens hingga 42 kilo basa.
Itu tergantung pada penggunaan polimerase koreksi kesalahan karena
Taq polimerase rawan kesalahan.
 Multiplex PCR adalah modifikasi lain dari PCR di mana dua atau lebih
sekuens target dapat ditunjukkan secara simultan dalam satu spesimen
pada waktu yang sama. Metode ini menggunakan dua atau lebih set
primer yang dirancang untuk amplifikasi target yang berbeda. Multipleks
sekarang semakin dievaluasi untuk demonstrasi simultan dari dua atau
lebih gen patogen dalam spesimen klinis.
 Real-time PCR adalah perkembangan terbaru. Dinamakan demikian,
karena amplikon PCR dapat dideteksi secara real time. Faktanya, "waktu
nyata" mengacu pada deteksi amplikon setelah setiap siklus PCR.
Beberapa instrumen komersial tersedia yang menggabungkan amplifikasi
PCR DNA target dengan deteksi amplikon dalam wadah tertutup yang
sama. Format deteksi probe melibatkan pendeteksian fluorofor. Hasilnya
semikuantitatif dan dapat diperoleh dalam waktu yang jauh lebih singkat
daripada yang diperlukan untuk melakukan uji PCR konvensional.
Komponen PCR
1. Enzim DNA polymerase
Dalam sejarah, PCR dilakukan dengan menggunaka klenow fragmen DNA
polymerase 1 selama reaksi polimerasinya. Enzim ini tidak aktif secara termal
selama proses denaturasi, sehingga harus menambah enzim disetiap siklusnya,
dan hanya bisa dipakai untuk perpanjangan.
2. Primer
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai
urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer
berkisar sekitar 20-30 basa.

3. Reagen lainnya
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen yang lain yang ikut
menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah Dntp
untuknreaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgC 2.

 Teknologi DNA rekombinan

Dalam teknologi DNA rekombinan, pertama, DNA yang bertanggung jawab

untuk fenotipe tertentu diidentifikasi dan diisolasi. Setelah dimurnikan, gen atau gen
tersebut menyatu dengan potongan DNA lain untuk membentuk molekul DNA
rekombinan. Ini dipropagasi (kloning gen) dengan memasukkan ke dalam organisme
yang bahkan tidak perlu berada di kerajaan yang sama dengan donor gen asli.

 Mengkloning Vektor dan Host

Vektor rekombinan yang baik memiliki dua kualitas yang sangat diperlukan:
ia harus mampu membawa sebagian besar DNA donor dan harus siap diterima oleh
inang kloning.
a. Vektor kloning
Vektor kloning meliputi:
 Plasmid adalah vektor yang sangat baik karena kecil, berkarakteristik
baik, mudah dimanipulasi, dan dapat dipindahkan ke sel inang yang
sesuai melalui transformasi. Plasmid E. coli membawa penanda genetik
untuk resistensi terhadap antibiotik, meskipun dibatasi oleh jumlah DNA
asing yang relatif kecil yang dapat diterimanya.
 Bakteriofag juga merupakan vektor yang baik karena memiliki
kemampuan alami untuk menyuntikkan DNA ke dalam inang bakteri
melalui transduksi. Fag Charon2 adalah vektor fag yang dimodifikasi
yang tidak memiliki sebagian besar genomnya; karenanya dapat
membawa segmen DNA asing yang cukup besar.
 Vektor hibrida telah dikembangkan dengan menyatukan dua vektor yang
berbeda. Kosmid adalah contoh vektor hibrida yang menggabungkan
plasmid dan fag dan mampu membawa urutan genom yang relatif besar.
Vektor hibrid E. coli-ragi dapat disisipkan pada host kloning bakteri dan
ragi.

b. Mengkloning host

E. coli adalah inang kloning tradisional yang masih digunakan di sebagian

besar percobaan. Ini karena bakteri ini adalah inang rekombinan asli dan protokol
yang menggunakannya sudah mapan, relatif mudah, dan dapat diandalkan. Ratusan
vektor kloning khusus telah dikembangkan untuk itu. Kerugian utama dengan E. colt
adalah kurangnya fleksibilitas dalam mengekspresikan gen eukariotik dengan benar.

Ragi Saccharomyces cerevisiae adalah inang alternatif lain yang digunakan

untuk proses dan penelitian industri tertentu. Inang yang eukariotik ini sudah
memiliki mekanisme untuk memproses dan memodifikasi produk gen eukariotik.
Teknik tertentu juga dapat menggunakan bakteri yang berbeda (Bacillus subtilis),
kultur sel hewan, dan bahkan hewan dan tumbuhan hidup untuk dijadikan sebagai
inang kloning.
 Produk Biologis Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan digunakan oleh perusahaan farmasi untuk

memproduksi obat-obatan yang tidak dapat diproduksi dengan cara lain. Penyakit,
seperti diabetes dan dwarfisme, yang disebabkan oleh kekurangan hormon esensial
sekarang sedang diobati dengan mengganti gen hormon yang hilang. Insulin babi dan
sapi pernah menjadi satu-satunya bentuk yang tersedia untuk mengobati diabetes,
meskipun produk hewani tersebut digunakan untuk menyebabkan reaksi alergi pada
individu tertentu yang sensitif. Sebaliknya, dwarfisme yang tidak dapat diobati
dengan hormon pertumbuhan hewan hanya diobati dengan hormon pertumbuhan
manusia (HGH) yang diperoleh dari hipofisis mayat. Pada suatu waktu, HGH tidak
cukup tersedia untuk merawat ribuan anak yang membutuhkan. Namun, sekarang
skenario diubah dengan munculnya HGH rekombinan. Teknologi rekombinan telah
mengubah hasil dari kondisi ini dan banyak kondisi lainnya dengan memungkinkan
pembuatan hormon dan enzim penyelamat kehidupan dalam skala besar yang berasal
dari manusia.

 Organisme yang Dimodifikasi Secara Genetik

Proses pengenalan gen asing secara artifisial ke dalam organisme disebut

transfeksi, dan organ rekombinan yang dihasilkan dengan cara ini disebut
organisme transgenik atau yang dimodifikasi secara genetik.
Gen asing telah dimasukkan ke dalam berbagai mikroba, tumbuhan, dan
hewan melalui teknik DNA rekombinan yang dikembangkan khusus untuk
mereka. Organisme "perancang" transgenik tersedia untuk berbagai aplikasi
bioteknologi. Karena mereka adalah bentuk kehidupan yang unik yang tidak akan
pernah terjadi, mereka dapat dipatenkan.

 Terapi gen

Terapi gen adalah teknik untuk mengganti gen yang rusak dengan yang
normal pada individu dengan penyakit genetik yang fatal atau sangat
melemahkan. Manfaat yang melekat dari terapi ini adalah untuk secara permanen
menyembuhkan disfungsi fisiologis dengan memperbaiki cacat genetic.
 Ada dua strategi untuk terapi ini: terapi ex vivo dan terapi in vivo. Dalam
terapi ex eine, gen normal dikloning dalam vektor, seperti retrovirus (misalnya,
virus leukemia tikus) atau adenovirus yang menular tetapi relatif kurang
berbahaya. Jaringan yang diambil dari pasien diinkubasi dengan virus yang
dimodifikasi secara genetik ini untuk ditransfeksi dengan gen normal. Sel-sel
yang ditransfusikan kemudian dimasukkan kembali ke dalam tubuh pasien
melalui transfusi. Sebaliknya, jenis terapi in vivo tidak memiliki langkah
perantara untuk menginkubasi jaringan pasien yang dieksisi. Sebaliknya, DNA
telanjang atau vektor virus langsung dimasukkan ke dalam jaringan pasien.

Percobaan terapi gen pertama pada manusia dimulai pada tahun 1990 oleh
para peneliti di National Institutes of Health, AS. Subjek adalah seorang anak
perempuan berusia 4 tahun yang menderita penyakit imunodefisiensi berat akibat
kekurangan enzim adenosin deaminase (ADA). Dia ditransfusikan dengan sel
darahnya sendiri yang telah direkayasa untuk mengandung gen ADA fungsional.
Kemudian, anak-anak lain diberi jenis terapi yang sama. Sejauh ini, anak-anak telah
menunjukkan peningkatan yang luar biasa dan terus sehat, tetapi pengobatannya tidak
permanen dan harus diulang. Uji coba terkontrol ilmiah yang tepat diperlukan
sebelum induksi sebagai praktik klinis rutin.

 Ada beberapa prinsip yang digunakan untuk menggantikan atau

memperbaiki gen yang rusak
1. Insersi gen yang normal pada lokasi yang tidak spesifik di dalam genom untuk
menggantikan gen yang tidak berfungsi. Prinsip ini merupakan pendekatan umum
yang paling sering digunakan.
2. Gen yang tidak normal dihilangkan dari genom individu dan digantikan oleh gen
yang normal menggunakan cara homologous recombination.
3. Gen yang tidak normal dapat diperbaiki melalui cara selective reverse mutation.
4. Mengubah regulasi (pengaturan) gen tertentu.
 Jenis terapi gen
Terapi gen dibedakan atas 2 jenis yaitu
a) Terapi gen sel somatik (somatic-cell gene therapy) atau gene therapy
non hereditable. Pada terapi gen sel somatik, gen yang normal atau telah
dimodifikasi ditransfer ke dalam sel-sel somatik pasien. Terapi gen ini
hanya dapat mengatasi penyakit atau kelainan pada pasien yang
bersangkutan. Gen yang telah diperbaiki atau dimodifikasi ini tidak
dapat diturunkan kepada generasi selanjutnya, karena gen yang telah
diperbaiki ini hanya ada pada sel-sel somatik saja dan tidak ada pada sel-
sel germinal.
b) Terapi gen sel germinal (Germ line /hereditable gene therapy)
Pada terapi gen sel germinal, gen yang mengalami defek pada sel-sel
germinal akan diperbaiki dengan cara menginsersikan dan mengintegrasikan gen
yang normal atau gen yang telah dimodifikasi kedalam genom sel-sel germinal.
Gen yang telah diinsersikan ini kemudian akan diturunkan ke generasi
berikutnya. Terapi gen sel germinal sangat bermanfaat untuk mengatasi
penyakit-penyakit genetik dan penyakit-penyakit yang bersifat herediter. Akan
tetapi terapi gen sel germinal hingga kini masih sulit dilakukan karena alasan
tehnis dan etik. Bila gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal ini
diperbaiki dan diturunkan berarti kita telah mengubah genetik
seseorang. Hal inilah yang menjadi kendala untuk melakukan terapi gen sel
germinal.
 Metoda terapi gen
Metoda terapi gen dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok besar yaitu
1. transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen normal kedalam sel-sel sasaran
pada pasien dengan menggunakan vector biologi yaitu virus.
2. transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen yang normal
kedalam sel-sel sasaran pada pasien dengan menggunakan cara non virus.
Beberapa cara non virus yang dapat digunakan adalah Naked DNA,
Oligonucleotides, lipoplexes dan polyplexes, hibrid methods, dendrimers.
 Transfer gen menggunakan vektor biologis
Jenis virus yang banyak digunakan sebagai vektor adalah
A. Retrovirus.
Materi genetik pada virus ini adalah dalam bentuk rna, sebaliknya materi
genetik pada sel-sel tubuh sasaran adalah dalam bentuk dna. Ketika retrovirus
menginfeksi sel sasaran (host), selain memasukkan rna-nya, ia juga akan
memasukkan ensim reverse transcriptase dan integrase kedalam sel sasaran
tersebut. Rna ini kemudian akan diubah menjadi dna melalui proses reverse
transcription menggunakan ensim reverse transcriptase. Dna kemudian akan
ditransfer kedalam inti sel sasaran dan kemudian akan berintegrasi pada tempat
tertentu di genom sel sasaran dengan bantuan ensim integrase. Setelah dna yang
telah diperbaiki ini terintegrasi pada tempat tertentu di genom sel sasaran maka
dikatakan bahwa genom sel-sel sasaran (host) ini telah dimodifikasi
B. Adenovirus
Ketika virus adenovirus meninginfeksi sebuah sel inang, molekul DNA
virus tersebut akan dimasukkan kedalam sel inang tersebut. Materi genetik
adenovirus tidak bersatu dengan materi genetic sel inang. Molekul DNA virus
terletak bebas dalam inti sel dan proses transkripsinya berlangsung secara
sendiri. Molekul DNA virus tidak ikut berreplikasi ketika sel mengalami
pembelahan sehingga sel-sel inang hasil pembelahan tidak mengandung DNA
virus. Akibatnya padaterapi gen menggunakan vektor adenovirus membutuhkan
pemasukkan kembali gen-gen yang sudah dimodifikasi ke dalam populasi sel
yang baru. Sebaliknya keadaan ini akan mencegah terjadinya kanker.

 Transfer gen menggunakan cara non virus

Beberapa metoda non virus yang dapat digunakan adalah
1. Naked DNA
Metoda ini merupakan metoda transfeksi non virus yang sangat sederhana.
Penelitian klinik dengan cara menyuntikan naked DNA secara intramuskular
menunjukkan sebagian hasil yang sukses dan sebagian lagi mengalami
kegagalan. Ekspresi gen pada metoda transfeksi ini sangat rendah dibandingkan
dengan cara transfeksi lainnya.
 2. Oligonukleotida
Oligonukleotida sintetik digunakan untuk menginaktifkan gengen yang
terlibat dalam proses penyakit. Beberapa metoda yang dapat digunakan antara
lain adalah
a. Menggunakan antisense yang spesifik untuk gen sasasaran yang akan
mengganggu proses transkripsi gen sasaran yang rusak.
b. Menggunakan oligonukleotida rantai ganda (double strand oligonucleotide)
yang akan mengikat faktorfaktor transkripsi yang diperlukan untuk regulasi
promoter gen sasaran.

3. Lipoplexes and polyplexes

Untuk meningkatkan kwalitas pengangkutan DNA yang baru ke dalam sel,
DNA tersebut harus dilindungi dari kerusakan dan pemasukkannya kedalam sel
harus difasilitasi. Untuk memfasilitasi pemasukan gen ke dalam sel dapat
digunakan molekul lipid yang dikenal sebagai lipoplexes dan polyplexes yang
dirancang untuk melindungi DNA dari proses degradasi selama proses transfeksi.
Molekul lipid ini digunakan untuk membungkus plasmid yang mengandung
DNA dalam bentuk seperti micelle atau liposome.

4. Metoda Hibrid (Hybrid method)

Untuk meningkatkan efisiensi trnasfer transgen dikembangkan metoda hibrid
(campuran) yaitu kombinasi liposome dengan virus influenza atau HIV yang
diinaktifkan.

 Hambatan dalam terapi gen

Ada beberapa faktor yang menghambat efektivitas penggunaan terapi gen
dalam mengatasi penyakit-penyakit genetik yaitu
1. Masa hidup alami terapi gen yang pendek (Short-lived nature of gene
therapy). Agar terapi gen menjadi efektif , gen yang dimasukkan kedalam
sel-sel target harus dapat berfungsi dan sel-sel yang mengandung gen terapi
ini harus dapat hidup lama dan stabil.
2. Respons Imunologik. Adanya stimulus tertentu yang merangsang timbulnya
respons imunologik yang dapat menurunkan efektivitas terapi gen tentu
 sangat merugikan. Lebih jauh adanya respon imunologik ini juga akan
menyulitkan pengulangan terapi gen pada pasien.
3. Masalah dengan virus yang berfungsi sebagai vektor. Beberapa masalah
yang harus dipertimbangkan pada penggunaan virus sebagai kendaraan
pembawa gen yang telah diperbaiki adalah toksisitas, reaksi imunologik dan
inflamasi, kontrol gen dan jaringan sasaran. Ketakutan lainnya adalah
kemungkinan pulihnya kembali kemampuan virus untuk menyebabkan
penyakit pada manusia
4. Kelainan gen yang multipel. Terapi gen sulit digunakan untuk mengobati
penyakit-penyakit yang disebabkan oleh adanya kombinasi gen-gen yang
mengalami kerusakan, misalnya pada penyakit jantung, tekanan darah tinggi,
Alzheimer, artritis dan diabetes.
5. Potensi untuk timbulnya tumor. Bila DNA diintergrasikan pada tempat yang
salah di dalam genom, misalnya pada daerah tumor suppressor gene, hal ini
dapat menyebabkan timbulnya tumor. Hal ini pernah terjadi pada percobaan
klinis pada pasien dengan X-linked severe combined immunodeficiency (X-
SCID) yang diterapi dengan sel punca darah (Hematopoietic stem cells yang
diinfeksi oleh retrovirus yang mengandung transgen. Tiga dari 20 pasien
yang diterapi dengan cara ini kemudian menderita leukemia.
 Prasyarat terapi gen
Untuk melakukan terapi gen ada persyaratan yang harus dipenuhi yang
dikembangkan oleh National Institute of Health (NIH).
Beberapa prasyarat yang harus dipenuhi agar prosedur terapi gen dapat di izinkan
adalah:
1. Gen harus di klon dan diketahui karakteristiknya, sehingga harus tersedia
dalam bentuk murni.
2. Harus ada metoda efektif yang digunakan untuk memasukkan trasngen ke
dalam jaringan atau sel yang dituju
3. Resiko terapi gen harus dievaluasi secara berhati-hati dan dibuat seminimal
mungkin
4. Penyakit tidak dapat diobati dengan cara lainnya.
5. Harus ada data penelitian pendahuluan dengan hewan model atau sel manusia
dan hasilnya menunjukkan bahwa usulan
terapi gen tersebut adalah efektif.
KESIMPULAN
1. Rekayasa genetika adalah suatu proses yang mengubah susunan genetik
dari suatu organisme dengan menghapus atau memasukkan DNA.
2. Struktur materi genetik, meliputi gen, kromosom, DNA, RNA, plasmid,
episom, dan elemen tranposabel.

3. Teknologi rekayasa genetik dalam bidang farmasi menghasilkan protein,

vaksin, dan antibiotik.

4. Dampak negatif tanaman trasgenik yaitu: Menyebabkan erosi plasma

nutfah, contoh jagung Bt, dapat menyebabkan kematian larva spesies
kupu-kupu. Menyebabkan pergeseran gen. Menyebabkan pergeseran
ekologi.

5. rekayasa genetika adalah bagian dari mutasi adalah benar. Setelah

ditemukannya teknik rekayasa genetika, banyak ilmuwan yang dengan
sengaja mendorong terjadinya peristiwa mutasi pada makhluk hidup
lainnya. Mutasi yang demikian disebut mutasi buatan.
 TUGAS

1. Apa yang dimaksud dengan faktor genetik?

2. Apa perbedaan gen DNA dan RNA?

3. Apa yang dimaksud dengan genetic?

4. Apa yang akan terjadi jika rekayasa genetika tidak terkendali?

5. Bagaimana pemanfaatan rekayasa genetika dalam bidang kesehatan?

 GLOSARIUM

Amplifikasi : pembesaran, perluasan, atau pengembangan (tentang jumlah,

kepentingan,dsb).
Denaturasi : sebuah proses dimana protein atau asam nukleat kehilangan
struktur tersier dan struktur sekunder dengan penerapan beberapa
tekanan eksternal atau senyawa, seperti asam kuat atau basa,
garam anorganik terkonsentrasi.
DNA probe : suatu fragmen DNA atau RNA atau protein pelacak target gen.
Eksperiental : suatu set tindakan dan pengamatan, yang dilakukan untuk
mengecek atau menyalahkan hipotesis atau mengenali hubungan
sebab akibat antara gejala.
Endonuklease restriksi : enzim yang memotong molekul DNA.
Formulasi : suatu proses mengubah zat aktif/ekstrak dengan bantuan
eksipien menjadi suatu bentuk sediaan.
fragmen : yang merujuk kepada hasil resterisasi primitive suatu bagian
dari keseluruhan.
GAATTC : sekuens palindrom yang khas, dikenali oleh enzim restriksi
EcoRI yang sering digunakan.
Genom : keseluruhan informasi genetic yang dimiliki suatu sel atau
organisme, atau khususnya keseluruhan asam nukleat yang
memuat informasi tersebut.
Isolasi : pemisahan suatu hal dari hal lain atau usaha untuk memencilkan
manusia dari manusia lain; pengasingan; pe-mencilan;
pengucilan.
Inang : organisme yang menampung virus, parasite, partner
mutualisme, atau partner komensalisme, umumnya dengan
menyediakan makanan dan tempat berlindung.
Intron : setiap urutan nukleotida di dalam gen yang dibuang dalam
penjalinan RNA selama pematangan produk RNA akhir.
In vitro : istilah yang dipakai dalam biologi untuk menyebutkan kultur
suatu sel, jaringan, atau bagian organ tertentu di dalam
laboratorium.
Kloning : suatu proses menghasilkan individu-individu dari jenis yang
sama yag identic secara genetic.
Migrasi : perpindahan.
Mutasi : perubahan yang terjadi pada urutan nukleotida.
Replikasi : sebuah proses, cara meniru, serta menduplikasi sesuai dengan
keinginan dan kebutuhan demi mendapatkan hasil yang lebih
baik.
rDNA : (DNA rekombinan) suatu bentuk DNA buatan yang dibuat
dengan cara menggabungkan atau merekombinasi dua atau
lebih untaian benang DNA yag dalam keadaan normal tidak
berpasangan atau terjadi bersama.
Sintesis : suatu integrasi dari dua atau lebih elemen yang ada yang
menghasilkan suatu hasil yang baru.
Transkripsi : pembuatan RNA terutama mRNA dengan menyalin sebagian
berkas DNA oleh enzim RNA polymerase.
 DAFTAR PUSTAKA

Chandra, Parija Subhash. Mikrobiology and Immunology. 2012.

Sutarno . “Rekayasa Genetic Dan Perkembangan Bioteknologi Di Bidang

Peternakan.”Proceeding Biology Education Conference 2528-5742, Vol.13(1)
2016:23-27

Muthiadin, cut, 2014. Pengantar Rekayasa Genetika. Makasar: Alauddin

University Press.