LAPORAN PRAKTIKUM

SISTEMATIKA MIKROBA

KLASIFIKASI MOLEKULER FILOGENETIK

BERDASARKAN GEN 16S rRNA

OLEH :

NAMA : NAJWA MAHARANI S

NIM : 08041282126043
KELOMPOK : IV (EMPAT)
ASISTEN : UTDIYAH MILASARI

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
2023
 LAPORAN PRAKTIKUM
ACARA 4

Nama/NIM : Najwa Maharani /08041182126043 Kelompok : IV (Empat)

Asisten : Utdiyah Milasari Tanggal: 15 Maret 2023

I. Judul : Klasifikasi Molekuler Filogenetik Berdasarkan Gen 16S rRNA

II. Tujuan : Untuk mengklasifikasikan sejumlah bakteri dengan cara me-
rekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sequence gen 16S
rRNA

III. Prinsip Dasar

Sistematika bertujuan untuk memahami dan mendeskripsikan
keanekaragaman suatu organisme dan kemudian merekonstruksi hubungannya
dengan organisme lain dalam kelompok tersebut. Kajian tentang keanekaragaman
mikroba dan hubungan antar mikroba, baik fenetik maupun filogenetik, dikenal
dengan sistematika mikroba. Mikroba merupakan organisme yang dapat hidup
bebas di berbagai macam lingkungan, mikroba ini dapat tersebar di udara, air,
tanah, benda, kemudian juga dapat hidup di tubuh manusia (Gracela et al., 2022).
Dalam klasifikasi mikrobia, terdapat klasifikasi fenetik dan klasifikasi
filogenetik. Di dalam klasifikasi filogenetik, sebuah kelompok organisme yang
anggotanya memiliki banyak kesamaan karakter dianggap memiliki hubungan
yang sangat dekat dan diperkirakan diturunkan dari satu nenek moyang.
Filogenetika merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan dalam
sistematika untuk memahami keanekaragaman makhluk hidup melalui
rekonstruksi hubungan kekerabatan (phylogenetic relationship) (Hidayat dan
Pancoro, 2019).
Analisis numerik – fenetik dan analisis filogenetik menghasilkan produk
yang berbeda dalam studi taksonomi. Analisis numerik –fenetik menghasilkan
dendrogram yang menggambarkan hubungan kemiripan (similaritas). Sementara
itu analisis filogenetik menghasilkan kladogram yang menggambarkan hubungan
kekerabatan. Meskipun merupakan produk yang berbeda, analisis terhadap
dendogram dan kladogram dapat digunakan sebagai dasar (Wangiyana, 2019).

Universitas Sriwijaya
IV. Metode Praktikum
4.1. Waktu dan Tempat
Praktikum kali ini dilaksanakan pada hari Rabu, 15 Maret 2022, pada pukul
10.00 WIB sampai dengan selesai. Bertempat di laboratorium Mikrobiologi,
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sriwijaya, Indralaya.

4.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu laptop atau computer,
GeneStudio, Java, mesquite dan mega 11. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu
data DNA hasil sekuensing.

4.3. Cara Kerja

4.3.1. GeneStudio
Pertama, dibuka Program GeneStudio yang sudah terinstal di Komputer dan
dipilih menu “Components” pilih opsi “Contig Editor”. Dimasukkan sekuen DNA
yang akan di contig dengan cara klik “import”pada deretan toolbar. Dipilih file
hasil sekuensing yang akan diedit baik file Forward maupun Reverse dengan
eksistensi format file AB1 (pasangan file harus dari satu sampel/kode yang sama).
Diblok kedua file tersebut kemudian diklik Open.
Selanjutnya, setelah klik “Open” maka program secara otomatis akan
assemble guna digabungkan kedua file menjadi satu bagian. Sebelum file tampil,
akan muncul kotak dialog opsi untuk mengatur tingkat toleransi pemasangan
nukleotida (semakin tinggi yang dipilih, maka program hanya akan mencocokan
pasangan nukleotida dengan nilai tinggi, sedangkan pada tingkat rendah, maka
pasang basa dengan nilai rendah juga harus diperhitungkan), pilih dan klik OK.
Jika Grafik kromatogram tidak otomatis keluar, pilih dan klik “Show all” pada
toolbar atas. Sekuens Forward memiliki tanda panah mengarah ke kanan,
sedangkan Reverse mengarah ke kiri.
Jika tanda panah sekuens forward tidak mengarah kekanan atau tidak sesuai
maka lakukan “Reverse Complement” melalui toolbar “Contig” kemudian dipilih
dan diklik “Reverse”. Cek kembali arah panah, jika sudah benar lanjut untuk
dilakukan koreksi pada basa nukleotida yang masih bermasalah atau eror dengan

Universitas Sriwijaya
fungsi “Ambiguity”. Dipilih toolbar “Contig” lalu “Ambiguity Finder” dan akan
terdapat dua opsi “Before ambiguity” kursor akan berada di belakang nukleotida
yang salah. Setelah seluruh nukleotida benar, bisa dilakukan export untuk
dikonversi dalam bentuk FASTA, pilih “export consensus” pada toolbar beri
nama file dan simpan dengan eksistensi file format FASTA klik Ok/Save.

4.3.2. Homologi Search

Setelah proses Assembling sekuen DNA hasil sekuensing selesai Langkah
selanjutnya yaitu melakukan Homologi Search menggunakan menu Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST) pada laman NCBI. Untuk sampel DNA pilih
“Nucleotide BLAST”. Pertama, dimasukkan file FASTA (.fas) pada notepad
dengan cara copy paste, atau pilih browser pada bagian bawah dan open file
dimana tempat kita menyimpan data sampel hasil pembacaan dengan GeneStudio.
Apabila semua kotak isian telah sesuai, lalu Run BLAST. Terdapat sekitar 100
data (scroll up dan scroll down).
Lalu, tahap selanjutnya yang perlu dilakukan setelah memasttikan kotak
isian telah sesuai semua yaitu dipilih 9 spesies yang berbeda dengan cara terlebih
dahulu meng-klik select all pada pojok kiri atas, lalu centang 9 spesies bakteri
yang kita inginkan, setelah itu klik opsi Download dan pilih FASTA (Complete
Sequence).

4.3.3. Mesquite
Sebelum masuk ke mesquite terlebih dahulu disatukan file hasil download
BLAST dengan file hasil assembling DNA pada GeneStudio dengan cara
membuka kedua file lalu copy sekuens hasil assembling dan paste-kan pada
bagian paling atas pada file download pada laman NCBI dan setelah disatukan lalu
save as file tersebut diberi nama file “Hasil Homologi Search Sismik 1” dan ubah
ekstensi filenya dengan cara menambahkan .nt tanpa spasi dibelakang nama file.
Kemudian buka Mesquite lalu klik File dan pilih Open file dan dipilih file yang
telah dibuat pada langkah sebelumnya, kemudian klik Open.
Dipilih FASTA (DNA/RNA) sesuai dengan data sampel dan format file yang
kita miliki, lalu klik “OK”. Diklik Save (tanpa mengganti nama file), semua kotak
dialog yang muncul pilih “OK” tunggu hingga proses selesai. Apabila matrix
tidak

Universitas Sriwijaya
otomatis muncul, klik “Show Matrix” pada bagian kiri bawah. Langkah
selanjutnya, pensejajaran sekuens DNA (alignment). Diklik “Matrix”, kemudian
dipilih “Align Multiple Sequences”, Dipilih “Opal” atau “ClustalW Align” dan
diklik “Ok” untuk setiap kotak dialog yang muncul. Ditunggu hingga proses
penjajaran selesai (ditandai dengan data/layar yang tidak lagi bergerak otomatis)
dan akan didapatkan hasil sekuen yang sudah sejajar.
Hasil yang didapat dari langkah diatas kemudian dipotong guna menyamakan
panjang dari setiap sekuen yang akan dilakukan analisis. Diklik nomor sekuen
yang tidak rata (akan terblok), kemudian ditekan tombol ”Shift + panah kiri”
untuk memblok urutan basa pada bagian depan yang tidak rata, kemudian ditekan
tombol “Backspace” pada keyboard dan pilih “Yes”, sehingga didapatkan sekuen
DNA yang sejajar. Setelah selesai, hasil yang didapat kemudian di export. Dengan
cara diklik ”File” dipilih “export” dipilih format file FASTA (DNA/RNA) dan
“OK”. Da akan muncul kotak dialong klik export. Lalu ubah ekstensi file dari .nt
menjadi
.fas lalu klik “Save”.

4.3.4. Mega
Dibuka program MEGA, klik “File” lalu dipilih “Open A file/Session”. File
yang didapat dari langkah sebelumnya (file dalam bentuk .fas) lalu diklik “Open”
dan akan muncul kotak dialog klik “Align”. Untuk mengetahui variasi basa
nukleotida dan conserved region dapat dilakukan Alignment pada toolbar, lalu
pilih dan klik ClustalW dan klik OK. Diklik OK tunggu sampai proses selesai, dan
muncul tampilan alignment variasi basa nukleotida sehingga dapat terlihat daerah
beda/mutasi serta daerah conserved region (ditandai dengan tanda “ * ”). Diexport
data hasil alignment dengan cara diklik “Data” pada toolbar kemudian dipilih
“Export Alignment” dan pilih format “MEGA Format” dan kemudian “Save”. Jika
muncul diberi nama file, lalu diklik “OK”, lalu “Yes”. Tahap selanjutnya
dilakukan analisis jarak genetik dengan cara dipilih dan diklik Distance pada
toolbar lalu dipilih Compute Pairwise, didpilih file hasil export sebelumnya
(ekstensi MEGA) diklik Open.
Tampilan hasil berupa jarak genetic atau similarity selanjutnya
dirapikan/disalin ulang pada tabel word/excel. Tahap selanjutnya rekontruksi
pohon filogenetik dengan cara pada toolbar dipilih menu Phylogeny lalu dipilih
dan
Universitas Sriwijaya
diklik Construct/Test Neighbor-Joining Tree lalu Yes. Dipilih isian botstrap 1000
kemudian compute, tunggu hingga proses selesai. Hasil rekontruksi akan
ditampilkan seperti dibawah ini, tampilan hasil rekonstruksi pohon filogenetik.
Data disimpan dan disalin kedalam word. Untuk menyimpan pohon filogeni
dalam bentuk gambar dapat dilakukan dengan cara, pada menu toolbar pilih
Image lalu pilih Save as PNG file beri nama file lalu klik Save.

Universitas Sriwijaya
V. Hasil dan Deskripsi

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, didapatkan hasil sebagai

berikut :

5.1. Hasil dan Pembahasan

5.1.1. Analisis Mutasi

3 4
1 2

Keterangan :
1. Mutasi transisi dari purin (A) ke purin (G)
2. Mutasi delesi
3. Conserve area
4. Mutasi transversi dari pirimidin (T) ke purin (G)
Deskripsi :
Berdasarkan tabel analisis mutasi yang didapatkan dari praktikum yang
telah dilaksanakan, dapat diketahui bahwa terjadi beberapa mutasi pada analisis
yang dilakukan. Menurut Nugroho et al. (2021), adanya mutasi pada susunan basa
gen-gen tersebut dapat menyebabkan terjadinya perubahan asam amino. Mutasi
yang terjadi berupa 3 jenis mutasi, di antaranya yaitu mutasi transisi, mutasi
transversi, dan mutasi delesi. Mutasi transisi terjadi apabila tejadi perubahan dari
basa purin ke pirimidin atau sebaliknya. Sedangkan, mutasi transversi berarti
terjadi perubahan dari basa purin ke basa purin ataupun basa pirimidin ke sesama
basa primidin.
Delesi didefinisikan sebagai mutasi yang dikenal dengan monosomi
parsial. Kasus ini terjadi jika terdapat kromosom yang terbuang atau terhapus.
Selain mutasi, tabel analisis di atas juga menunjukkan keberadaan conserve area
atau area lestari. Menurut Greiling et al., (2018), area konservasi menunjukkan
bahwa urutan telah dipertahankan oleh seleksi alam. Conserve area berarti area
lestari dan dapat diwariskan ke keturunan berikutnya (tidak mengalami mutasi).

Universitas Sriwijaya
5.1.2. Jarak Genetik

Deksripsi :
Berdasarkan tabel jarak genetik yang didapatkan dari praktikum yang telah
dilaksanakan, dapat diketahui bahwa Sismik 1 mempunyai hubungan kekerabatan
terdekat dengan NR 148295.1 Pseudomonas songnenensis strain NEAU-ST5-5
yaitu dengan jarak genetik 0.0127. Menurut Nurnaningsih et al. (2023), semakin
kecil nilai jarak genetik yang diperoleh, maka semakin dekat pula kedua
kelompok populasi tersebut. Semakin besar nilai jarak genetik yang diperoleh,
maka semakin jauh pula kedua kelompok populasi tersebut. Sismik 1 mempunyai
jarak genetik terbesar dengan NR 114167.1 Azotobacter chroococcum strain
NBRC 102613 yaitu sebesar 0.0443, maka berarti hubungan kekerabatan
keduanya semakin jauh dibandingkan dengan sampel yang lain.

5.1.3 Kladogram

Deskripsi :
Berdasarkan kladogram yang didapatkan dari hasil praktikum yang telah
dilaksanakan, dapat diketahui bahwa NR 114167.1 Azotobacter chroococcum
strain NBRC 102613 merupakan outgrup. Menurut Hidayat dan Pancoro (2019),
dalam analisis filogenetika kelompok outgroup sangat dibutuhkan dan
menyebabkan polarisasi karakter atau ciri, yaitu karakter apomorfik dan
plesiomorfik. Sismik 1 mempunyai hubungan kekerabatan terdekat dengan NR
148295.1 Pseudomonas songnenensis strain NEAU-ST5-5 yaitu dengan nilai
bootstrap sebesar 66. Nilai

Universitas Sriwijaya
bootstrap digunakan untuk menguji seberapa tinggi tingkat kepercayaan cabang
yang dibentuk. Semakin tinggi nilai bootstrap, maka semakin tinggi pula tingkat
kepercayaan cabang yang dibentuk.

Universitas Sriwijaya
VI. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, didapat kesimpulan sebagai
berikut :
1. Di dalam klasifikasi filogenetik, sebuah kelompok organisme yang
anggotanya memiliki banyak kesamaan karakter dianggap memiliki
hubungan yang sangat dekat dan diperkirakan diturunkan dari satu nenek
moyang.
2. Analisis filogenetik menghasilkan kladogram yang menggambarkan
hubungan kekerabatan.
3. Mutasi yang terjadi berupa 3 jenis mutasi, di antaranya yaitu mutasi
transisi, mutasi transversi, dan mutasi delesi.
4. Conserve area berarti area lestari dan dapat diwariskan ke keturunan
berikutnya (tidak mengalami mutasi).
5. Sismik 1 mempunyai hubungan kekerabatan terdekat dengan NR
148295.1 Pseudomonas songnenensis strain NEAU-ST5-5 yaitu dengan
jarak genetic sebesar 0.0127.

Universitas Sriwijaya
 DAFTAR PUSTAKA
Gracela, P. M., Rondonuwu, S., dan Baideng, E. 2022. Identifikasi Bakteri Secara
Molekuler Dari Mesin Atm Pada Beberapa Tempat Di Kota Manado. Journal
of Biotechnology and Conservation in Wallacea, 2(2):107-112.
Greiling, T. M., Dehner, C., Chen, X., Hughes, K., Iñiguez, A. J., Boccitto, M., ...
dan Kriegel, M. A. 2018. Commensal Orthologs of The Human Autoantigen
Ro60 as Triggers of Autoimmunity in Lupus. Science Translational
Medicine, 10(434) :23-26.
Hidayat, T., dan Pancoro, A. 2019. Ulasan Kajian Filogenetika Molekuler dan
Peranannya dalam Menyediakan Informasi Dasar Untuk Meningkatkan
Kualitas Sumber Genetik Anggrek. Jurnal AgroBiogen 4(1):35-40.
Nugroho, K., Trikoesoemaningtyas, M. S., dan Lestari, P. 2021. Variasi
Nukleotida pada Genotipe Mutan Cabai Hasil Iradiasi Sinar Gama
Berdasarkan Primer Spesifik Gen Terkait Karakter Ukuran Buah. Jurnal
AgroBiogen, 17(2), 83-94.
Nurnaningsih, N., Kantun, I. W., dan Wulandari, S. 2023. Analisis Populasi Ikan
Bawal Hitam (Parastromateus niger Bloch, 1795) Berdasarkan Keragaman
dan Jarak Genetik Di Wppnri 718. BAWAL Widya Riset Perikanan Tangkap,
14(3), 149-159.
Wangiyana, S.A.G. 2019. Comparation of Dendrogram and Cladogram Topology
of Gyrinops versteegii and Others Gyrinops Member for Polyphasic
Taxonomy. Jurnal Silva Samalas. 1 (2) : 13-18.

Universitas Sriwijaya
 LAMPIRAN

Gambar 1.Tabel Analisis Mutasi

Gambar 2. Tabel Jarak Genetik

Gambar 3. Kladogram

(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2023)

Universitas Sriwijaya