Kultur Urin dan

Uji Sensitivitas Antibiotik

Praktikum Mikrobiologi Blok 12

Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat melakukan kultur urin
menggunakan metode agar plate.
2. Mahasiswa dapat melakukan uji sensitivitas
bakteri terhadap antibiotik.
• Infeksi saluran kemih (ISK) adalah infeksi yang angka
kejadiannya tinggi.
• pertumbuhan bakteri :urethra, ureter, sampai jaringan
ginjal.
• Adanya bakteri di dalam urin (bakteriuria) dapat
digunakan untuk menegakkan diagnosis ISK.
• Bakteri penyebab ISK umumnya adalah bakteri Gram
negatif, dengan Escherichia coli adalah penyebab
utama.
• Bakteri lain yang dapat menjadi penyebab ISK adalah
Klebsiela pneumonia, Enterobacter sp, Proteus
mirabilis, dan Pseudomonas sp.
• Untuk melakukan uji laboratorium pemeriksaan ISK dapat menggunakan
beberapa metode :
– kultur urin pada media agar plate
– uji rapid test microbiology menggunakan metode dip slide.
• Sampel yang digunakan adalah urin pasien yang diambil dengan
pengambilan yang steril dan legeartis.
• Metode kultur urin pada media agar plate merupakan metode kultur urin
yang standard dan paling umum digunakan.
• Pada metode ini, sampel urin diratakan pada suatu media agar plate yang
dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri penyebab ISK misalnya
McConkey Agar Plate (gram -) dan Blood Agar Plate (gram +).
• Koloni bakteri yang tumbuh kemudian dihitung
dengan menggunakan colony counter.
• Untuk mengidentifikasi jenis bakteri yang tumbuh,
diperlukan pemeriksaan lebih lanjut berupa :
– pemeriksaan Gram
– pemeriksaan biokimia bakteri (pemeriksaan
enzim)
– pemeriksaan fermentasi.
 1. Kultur urin
• Kultur urin dengan metode dip slide pada prinsipnya
serupa yaitu menggunakan suatu media padat untuk
menumbuhkan bakteri yang ada pada urin, hanya
saja untuk metode dip slide media yang digunakan
sudah dibuat dan disusun sedemikian rupa oleh
pabriknya untuk memudahkan pengerjaannya, oleh
sebab itu metode dip slide termasuk ke dalam rapid
test atau tes cepat.
• Media yang digunakan pada metode dip slide ini
adalah CLED Agar (Cystine lactose Electrolyte
Deficient) dan McConkey.
 CLED Agar (Cystine lactose Electrolyte Deficient)

Komposisi
• Prancreatic digest of gelatin ………………………………………………..4,00 g
• Prancreatic digest of casein ………………………………………………..4,00 g
• Beef extract ………………………………………………..3,00 g
• Lactose ………………………………………………..10,00 g
• L-Cystine ………………………………………………..0.128 g
• Bromthymol blue ………………………………………………..0.020 g
• Agar ………………………………………………..0.150 g
CLED Agar (Cystine lactose Electrolyte Deficient)
• berfungsi dalam enumerasi bakteri dalam urin.
• pertumbuhan bacteri patogen dan kontaminan dalam urin, tetapi
mencegah timbulnya terlalu banyak spesies Proteus yang disesebabkan
oleh larutan urin yang kaya akan elektrolit.
• Laktosa berperan sebagai sumber energi yang akan digunakan organisme
melalui mekanisme fermentasi.
• Sistein membiarkan tumbuhnya sejumlah kecil koloni coliform dengan
pengurangan sukrosa.
• Bromtimol biru digunakan sebagai indikator PH untuk membedakan
laktosa terfermentasi dari laktosa tak terfermentasi.
• Organisme yang menfermentasi laktosa akan mempunyai PH yang lebih
rendah dan mengubah warna medium dari hijau menjadi kuning.
 Mac Conkey
• Pepton : untuk menyediakan nitrogen, vitamin, mineral dan asam
amino esensial untuk pertumbuhan bakteri.
• Laktosa : untuk menyediakan karbon dan energi serta untuk
membedakan bakteri yang bisa memfermentasi laktosa
dengan bakteri yang tidak memfermentasi laktosa.
• Bile salts (garam empedu): sebagai agen selektif yang berfungsi
menghambat pertumbuhan bakteri gram positif.
• Kristal Violet : sebagai agen selektif yang berfungsi menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif.
• Natrium Klorida : untuk menyediakan elektrolit dan keseimbangan
osmotik.
• Neutral red : sebagai indikator pH, akan berwarna merah jika pH di
bawah ini 6,8.
• Agar : untuk memadatkan media.
 Mac Conkey
• membedakan bakteri yang memfermentasi laktosa (berkoloni
merah muda) dengan yang nonfermentasi (tidak berwarna).
• Bakteri yg memfermentasi laktosa menyebabkan penurunan pH,
sehingga mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah
koloni menjadi merah bata/merah jambu menyala.
• Bakteri bisa menfermentasi laktosa secara cepet karena terdapat
enzim Beta Galaktosidase dan enzim Perniase
• Koloni lain (S. aureus; P. aeruginosa dan Salmonella), bila tumbuh
tidak akan berwarna karena tidak mampu memfermentasi
laktosa.
• Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain
Enterobacter;Proteus; Salmonella; Shigella, Aerobacter;
Enterococcus.
• bakteri yang dapat memfermentasi laktosa (contoh : Escherichia coli, Klebsiella sp.) koloni dan media akan
berwarna merah atau merah muda, karena adanya produksi asam dari hasil fermentasi laktosa, dengan adanya
indikator neutral red media akan berwarna merah atau merah muda.
• bakteri yang tidak dapat memfermentasi laktosa (contoh : Salmonella sp., Shigella sp.) koloni dan media akan
berwarna transparan atau tidak berwarna karena bakteri tidak memfermentasi laktosa menjadi asam.
 2. Uji Sensitivitas Antibiotik
• Salah satu faktor yang menentukan pemilihan
antimikroba untuk pengobatan infeksi adalah
sensitivitas bakteri secara in vitro terhadap antibiotik.
• Uji kepekaan antimikroba dilakukan terhadap isolat
klinik dari spesimen.
• Pengujian dilakukan di bawah kondisi standar yang
berpedoman pada Clinical and Laboratory Standard
Institute (CLSI).
• Standar yang harus dipenuhi adalah konsentrasi bakteri
(kepekatan inokulum), suhu dan waktu inkubasi, serta
media yang digunakan (Mueller Hinton).
 Kemampuan antibiotik dalam melawan bakteri dapat
diukur menggunakan metode berikut:
• Metode dilusi
Metode dilusi dapat dilakukan menggunakan kaldu (broth dilusi)
atau menggunakan agar (agar dilusi). Konsentrasi tertinggi dimana media
terlihat jernih/tidak ada bakteri ditetapkan sebagai nilai kadar hambat
minimal (KHM). Untuk menentukan nilai kadar bunuh minimal (KBM),
makan sampel dari media yang terlihat jernih ditanam ke media agar dan
diinkubasi. Konsentrasi tertinggi dimana tidak terdapat pertumbuhan
bakteri dinyatakan sebagai nilai KBM.

• Metode difusi
Cakram kertas yang telah diberi antibiotik sejumlah tertentu
diletakkan pada media agar yang mengandung sejumlah bakteri uji. Nilai
hambatan diukur dalam satuan milimeter (mm) hambatan. Bakteri dapat
diklasifikasikan menjadi tiga kategori, yaitu resisten, intermediat, dan
sensitif terhadap antibiotik.
 Cara Kerja :
1. Cara pengambilan sampel urin
• Urin yang diambil adalah urin midstream clean catch dari
urin pagi atau urin sewaktu dengan minimal 4 jam
pengumpulan kandung kemih.
• Caranya: bersihkan daerah orifisium uretra eksterna
dengan kapas yang dibasahi antiseptik sebelum
pengambilan sampel urin. Kemudian untuk
menghilangkan antiseptik, daerah orifisium uretra
eksterna dibasuh dengan air steril. Kemudian mulailah
berkemih, tampung urin pada saat tengah berkemih,
masukkan ke dalam wadah steril, lakukan uji maksimal 30
menit setelah pengambilan sampel. Apabila uji tidak
dapat langsung dilakukan, sampel dapat disimpan pada
suhu 4C selama maksimal 48 jam.
 2. Kultur urin metode agar plate
• Sampel urin yang didapat diambil dengan menggunakan
ose steril yang telah disediakan. Ose tersebut dapat
menampung sejumlah urin tertentu dalam satu kali
ambilan (1ul). Ambil 1 Ose sampel urin (pastikan lubang
ose berisi cairan/urin) kemudian goreskan pada tengah
media membentuk garis dengan arah dari atas ke bawah.
Kemudian dengan ose yang sama, segera goreskan
dengan arah horizontal bersilangan dengan arah goresan
pertama (lihat gambar). Media yang digunakan adalah
Agar McConkey. Inkubasi pada suhu 37 oC selama 24
jam. Hitung koloni yang terbentuk menggunakan colony
counter.
Cara menggoreskan pada media
 Interprestasi hasil
• Adanya bulatan pada arah goresan menunjukkan
adanya pertumbuhan kuman dari sampel urin.
Bakteriuria dinyatakan jika terdapat hitungan bakteri
per mL >100.000 colony forming unit (cfu).
• Cara menghitung jumlah koloni adalah dengan
mengkalikan jumlah koloni yang ditemukan (dari
perhitungan pada colony counter) dengan 1000
(konversi sampel urin yang digunakan).
Mikroba dapat dihitung jumlahnya dengan metode:
• penghitungan langsung (direct count) dan
• penghitungan tidak langsung (indirect count).

Penghitungan secara langsung dilakukan di bawah mikroskop atau

dengan partikel elektronik.
Pada penghitungan tidak langsung, sel mikroba dalam sampel
dikonsentrasikan dan di tanam pada media yang sesuai
pembentukan koloni dalam medium agar digunakan untuk
memperkirakan jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam
sampel.
Metode cawan yang diperkenalkan oleh Fardiaz (1992)
mengungkapkan bahwa:
1.Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan kumpulan koloni
yang besar, dimana jumlah koloni diragukan dapat dihitung sebagai satu
koloni.
2.Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung
satu koloni.

Persyaratan untuk melakukan perhitungan mikroban dengan menggunakan

colony counter antara lain,:
Jumlah bakteri pada cawan petri antara 30-300 koloni, tidak ada koloni yang
menutupi lebih besar dari setengah luas cawan petri.
Jika dilakukan berulang kali, hasilnya dirata-ratakan dan perbandingan jumlah
bakteri dari hasil pengenceran yang berturut-turut antara pengenceran
yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya.
 3. Uji sensitivitas antibiotik
• Siapkan media steril mueller hinton agar (MHA) dan
suspensi koloni kuman 0,5 McFarland (Koloni kuman
yang dipakai adalah E. coli),
• Panaskan ujung ose sampai berpijar lalu dinginkan
sesaat, kemudian masukkan ke dalam suspensi
kuman di ganti menggunakan cotton bud steril,
peras di tepi tabung, lalu goreskan secara merata
pada seluruh permukaan MHA sambil di putar, naik
turunkan 2-3 kali. Diamkan 10 menit.
“selalu homogenkan sampel”
• Letakkan cakram yang berisi antibiotik pada
permukaan media MHA dengan menggunakan
pinset. Inkubasi cawan petri pada suhu 37C selama
18-24 jam, lalu interprestasikan hasil inkubasi.
 Interprestasi hasil
• Bandingkan nilai hambatan pertumbuhan bakteri
(dalam satuan mm) dengan nilai yang terdapat pada
table berikut.
Tabel Nilai Rujukan Sensitivitas Antibiotik terhadap
Enterobacteriae

Antibiotik Dosis Sensitif Intermediat Resisten

Ampicillin 10ug >17 14-16 <13
Kloramfenicol 30 ug >18 13-17 <12
Ciprofloxacin 5 ug >21 16-20 <15
A. Zona Radical: daerah di sekitar disc, dimana sama sekali tidak ditemukan pertumbuhan
bakteri. Potensi antibiotik diukur demham mengukur diameter dari zone radical.

B. Zona irradical: daerah di sekitar disc menunjukkan pertumbuhan bakteri dihambat oleh
antibiotik tersebut, tetapi tidak dimatikan. Disini akan terlihat pertumbuhan yang kurang
subur/lebih jarang dibandingkan dengan daerah diluar pengaruh antibiotik tersebut