HPLC 1
HPLC 1
Kinerja Tinggi
(KCKT)
1
KCKT/HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
High Performance Liquid Chromatography
Fasa gerak
Fasa Normal kurang polar
dibanding
KCKT (Normal Phase)
fasa diam
Fasa gerak
Fasa terbalik lebih polar
dari fasa
(Reverse phase)
diam 2
Prinsip
distribusi komponen
diantara fasa gerak dan fasa diam
migrasi diferensial komponen-komponen
analit dalam kolom kromatografi
A B
3
A B
int
en
sit
as
Volume retensi :
Volume fasa gerak yang diperlukan
untuk membawa analit sepanjang
kolom 4
Elusi :
Proses bergeraknya analit
yang di bawa oleh fasa gerak
melalui kolom
Proses Elusi
Isokratik
Laju alir tetap pada
proses elusi
Gradien
Laju alir berubah pada
proses elusi
5
Apa parameter interaksi
komponen – fasa diam ?
k` besar
Interaksi besar
Tertahan dalam
kolom lebih lama
6
Faktor kapasitas, k`
t t
r r (0)
k `
t
r (0)
tr(o)= waktu retensi senyawa yang tidak
tertahan dalam kolom
= waktu retensi fasa gerak
EFISIENSI KOLOM
7
KOLOM YANG EFISIEN:
Puncak sempit, tajam dan simetris
Asumsi:
Kesetimbangan distribusi analit
diantara fasa diam dan fasa gerak
terjadi dalam setiap pelat teori.
8
tr 2 tr 2
N 16( ) 5,54( )
W w1 / 2
Ukuran efisiensi kolom yg lain: HETP
HETP = L/N
9
Mengapa kolom dapat memisahkan
campuran komponen ?
10
Prinsip Pemisahan
Selektivitas kolom ?
dasar
Perbedaan k`
Faktor selektivitas,
11
1. Faktor Selektivitas ( )
t ' t t
r2 r ( 2) r (0)
t ' t t
r1 r (1) r (0)
Untuk Pemisahan:
>>1
12
Apakah parameter menjamin
pemisahan sempurna ??
I 3,2 4,5
T0= 0,99
Tr, menit
:………………………………
menjamin pemisahan bagian atas
(puncak) kromatogram
Tidak memperhitungkan overlap
puncak-puncak
2. Resolusi (Rs)
t r ( 2 ) t r (1)
Rs
1
( w1 w2 )
2
2(t r ( 2 ) t r (1)
( w1 w2 )
W = lebar puncak
14
W1/2
2(t r ( 2) t r (1) )
Rs
1,699( w1/ 2 (1) w1/ 2 ( 2 ) )
Rs ideal = 1,25
15
Cara lain menghitung Rs :
memperhitungkan
selektivitas
efisiensi
faktor kapasitas
1 k` 1
R ( )( ) N
4 1 k`
16
17
KCKT
Teknik untuk pemisahan dan analisis zat
yang sukar dipisahkan dan termolabil
Teknik untuk kontrol ketakmurnian
Eluat
dikumpulkan
detektor
Tempat kolom
pompa injektor
eluen
rekorder
18
GAMBAR HPLC
19
1. Tempat eluen/pelarut
Gambar Pompa
3. Injektor
4. Kolom
23
Gambar kolom
Kolom yang baik
bahan kolom kuat dan tidak mudah
berkarat
partikel Isi kolom berdiameter kecil (5–
10m), ukuran seragam, bulat, berpori
Efisiensi kolom tinggi (N >>, H<<)
Tahan terhadap tekanan tinggi
Menghasilkan puncak simetri dan sempit
24
Karakteristik packing kolom untuk kromatografi
25
Jenis kolom
1. Kolom polar : silika, amina
2. Kolom non polar : C-8, C-18
Si
O O
Si
Si
O R
Si
Si O
O R
O H
Si
Si O
Syarat detektor
• Tingkat noise dan drift rendah
• Sensitivitas tinggi
• respons cepat
•Tidak sensitiv terhadap perubahan tipe pelarut, laju alir
pelarut dan temperatur
• mudah pengoperasiannya
• awet
27
Berdasarkan jenis kolom dan eluen :
1. Kromatografi fasa terbalik : Fasa diam lebih
nonpolar dari fasa gerak
2. Kromatografi fasa normal : Fasa diam lebih
polar dari fasa gerak
Pemeliharaan kolom
28
Trouble shoot
Alat
Hasil pengukuran
Trouble Penanggulangan
Shoot
1. Pompa Saring kembali fasa gerak
berhenti/tekanan Periksa saringan fasa gerak
tinggi Periksa ujung-ujung kolom
periksa klep pompa (harus dgn
ahlinya.)
Bersihkan kolom dengan laju alir
minimal
ganti kolom
A B
C
D
30
TIPE-TIPE KROMATOGRAM
31
Soal resolusi:
1. Dari kromaogram KCKT suatu campuran yang diketahui
terdiri dari senyawa A dan B, diperoleh data sbb:
tr (A) = 13 menit, tr (B) = 21,5 menit, to = 2,0 menit
W(A)= 2,1 menit, W(B) = 4,1 menit.
Hitung Resolusi dan faktor pemisahannya
32
Analisis kualitatif
33
Analisis Kuantitatif
Tahapan kerja:
*Penyiapan fasa gerak :
Pelarutan, pencampuran,
penyaringan, degasing
*Preparasi sampel :
Pemisahan dgn ekstraksi
Pengenceran/pelarutan ekstrak
penyaringan/degasing
*Penyiapan larutan standar :
Induk : larutan 1000 ppm
pengenceran dengan fasa gerak.
pembuatan larutan kerja:
larutan seri dengan range
konsentrasi tertentu. 34
*Pengukuran sampel
*Penentuan konsentrasi sebenarnya
analit dalam sampel
Pengukuran sampel:
-Teknik membandingkan area standar
dengan area analit
As/Ac = Cs/Cc
35
- Teknik kurva kalibrasi
*
Area
*
Cx
C, ppm
36
Teknik analisis kuantitatif
dengan kalibrasi adisi standar
Area *
Cx
C, ppm
37