PIROGEN

SEJARAH PENEMUAN
1. Tahun 1675-1685 Anton van Leeuwenhock menemukan
mikroskop menemukan fakta baru : kehidupan yg
mikroskopik
2. Pembuktian pasteur :fermentasi yg dilakukan oleh
mikroorganisme
3. Glasgow membuktikan teori jamur
4. Edward Jenner mengembangkan vaksin pertama dari
virus cacar pada sapi 100 tahun sebelum Pasteur,
dengan cara memanaskan basil dari penyakit anthrax
bacilli dan simpul saraf rabies dari kelinci yang
terinfeksi yang merupakan pengembangan vaksin
untuk mengobati anthrax pada domba (1881) dan
rabies pada manusia (1885),
 SEJARAH PENEMUAN
5. Pada akhir tahun 1870, Robert Koch membuktikan
bahwa jenis masing-masing mikroba tergantung pada
penyakitnya seperti anthrax dan tuberkulosis. Dan
mengeluarkan postulat bahwa keadaan yang
disebabkan oleh organisme menyebabkan penyakit
tertentu :
 Organisme yang muncul harus diperhatikan pada setiap
keadaan yang menjelaskan perubahan patologi dan gejala
klinis
 Organisme tidak harus dihubungkan dengan penyebab
penyakit lain
 Setelah diisolasi dari tubuh dan dikembangbiakan dalam
koloni tunggal, organisme dapat melawan penyakit pada
hewan
 SEJARAH PENEMUAN
Peneliti banyak menyelidiki mekanisme demam dan
bakteri yang menyebabkannya  merupakan dasar
lahirnya teori dan metode mikrobiologi yang secara terus
menerus diselidiki sampai sekarang pada :
a.Pengobatan umum pada infeksi yang disebabkan luka
b.Toksin dari bakteri
c.Terapi demam
d.Pemurnian kimia dan uraian struktural endotoksin
e.Karakterisasi molekular modern dari lipopolisakarida
(LPS)
MEKANISME DEMAM
 KLASIFIKASI PIROGEN
Dibagi berdasarkan asal usulnya dari dalam dan luar tubuh :
1. “endogenous endotoxin” merupakan endotoksin lingkungan
2. “endogenous pyrogen” (EP) dan “endogenous mediator,”
dimana merupakan substansi yang dihasilkan oleh tubuh dan
merupakan penyebab inflamasi tubuh, koagulasi dan
mekanisme demam disebut cytokines.
3. Exogenous pyrogen adalah senyawa asing yang masuk ke
dalam tubuh dan sebagai respon terhadap sediaan injeksi yang
menyebabkan infeksi seperti mikroba pirogen yang sering
disebut dengan endotoxin.
4. Senyawa Nonmicrobial exogenous pyrogen adalah senyawa non
mikroba yang menyebabkan efek farmakologi (antigen) seperti
serum albumin
 ENDOTOKSIN
• Hal yang harus diperhatikan dari endotoksin yang berasal dari suatu
sediaan parenteral : selama pembuatan harus dikontrol semua pirogen
yang menkontaminasi. Hal pertama yang harus diperhatikan untuk
mengatasi pirogen adalah air dan bahan yang digunakan yang harus
melewati uji LAL (Limulus Amebocyte Lysate) atau uji pirogen yang
tertera pada buku standar (FI atau USP)
• Endotoxin, merupakan LPS yang dihasilkan dinding sel bakteri gram
negatif yang tahan terhadap pemanasan ekstrim, aktif setelah
sterilisasi uap dan mudah melewati penyaring bakteri. Hanya dapat
mati pada temperatur 200oC selama satu jam. Atau pemanasan yang
dikombinasi dengan penyesuaian pH.
 MOLEKUL LPS
• Molekul LPS merupakan struktur yang kuat dan
larut dalam lemak yang menempel pada
permukaan hidrofobik seperti gelas, plastik dan
arang.
• Dalam larutan, LPS secara spontan membentuk
lapisan bilayers yang terdiri dari bagian kepala lipid
hidrofobik dan ujungnya asam lemak yang
tersembunyi di bagian dalam dan bagian atas dan
sisi yg lain polisakarida hidrofilik yang larut pada
bagian larutan sehingga potensial mempengaruhi
kestabilan sediaan.
 LIPOPOLYSACCHARIDES YANG
BERINTERAKSI DENGAN MEMBRAN SEL
Terdapat tiga tipe interaksi LPS dengan membran
sel :
1.Berikatan dengan reseptor pada sel yang
merupakan suatu protein terlarut membentuk
kompleks dengan LPS,
2.Berikatan dengan membrane reseptor
3.Langsung berinteraksi dengan membran LPS.
 PERLAKUAN YANG PENTING UNTUK MENEMUKAN
DAN MENGIDENTIFIKASI KONTAMINAN
• Proses pembuatan obat-obat parenteral dapat dibagi menjadi dua
kategori :
a. Sterilisasi pada saat pembuatan, pengisian, packing dan sterilisasi akhir
b. Sterilisasi dengan teknik aseptis selama pembuatan dan pengisian tanpa
sterilisaasi akhir
• Kelembaban merupakan sumber dari kontaminasi :
a. Udara sekitar
b. Pembuatan peralatan
c. Wadah sediaan
d. Personil yang membuat sediaan
e. Air dan drainase/pengairan
 UJI PYROGEN
• Tergantung pada sensitifitas dari kelinci yang diberikan
beberapa sediaan yang diduga terkontaminasi dengan
pyrogen
• Tujuan : diharapkan memberikan respon yang sama
terhadap manusia dan dipercaya serta cocok untuk
mendeteksi substansi pyrogen secara umum.
• Kerugian dari metode in vivo ini :
a. Mahal dalam pemeliharaan kelinci,
b. Tidak dapat melihat jumlah kontaminan,
c. Kurang sensitif terhadap uji LAL,
d. Membutuhkan waktu untuk pemeriksaan (tahunan) dan
e. Variasi yang banyak secara biologi
 UJI PYROGEN
• Tes gel-clot bacterial endotoxin adalah Test
yang menggabungkan uji secara in vivo dan in
vitro yang dikembangkan dan dioptimalkan
dengan memvalidasi air atau pelarut yang
digunakan pada sediaan parenteral serta uji
terhadap kualitas sediaan.
 DEPYROGENASI
• adalah (penghilangan, reduksi atau
destruksi) endotoksin terhadap
sediaan dan wadah serta proses
pembuatannya.
 DEPYROGENASI
• Secara tradisional, depyrogenasi pertama
adalah dengan pembakaran panas kering.
endotoksin dari bahan dengan pemanasan
kering yang dapat bertahan dilakukan dengan
siklus pembakaran panas kering secara
sehingga dapat menghancurkan molekul LPS.
 PROSES DEPYROGENASI
1.Inaktivasi
– Pemanasan basah dan kering
– Radiasi ionisasi
– Inaktivasi secara kimia (seperti penggunaan asam
atau basa kuat)
– Oksidasi (ex: hydrogen peroxide)
– Polymyxin B (PMB)
– Inaktivasi secara biologi
 PROSES DEPYROGENASI
2. Pembersihan
• Menurut ukuran partikel endotoksin ,
(ultrafiltration, penggantian ion, penghilangan
atau penggumpalan melalui filtrasi)
• Pengikatan (arang aktif, LPS yang diikat dg
suatu protein)
PROSES DEPYROGENASI
 PROSES DEPYROGENASI
Proses depyrogenasi (seperti metode sterilisasi)
secara konstruksi D (death or destruction pada
endotoxin).
Kondisi minimum untuk membunuh endotoksin E.
coli :
1. 300OC, 11 minutes
2. 250OC, 75 minutes
3. 210OC, 195 minutes
4. 175OC, 600 minutes
 variabel yang mempengaruhi reduksi
endotoxin padadepyrogenation, :
1. Jenis endotoksin (sumber dan tempat kerja,
yang berasal dari proses pembuatan yang
berbeda aplikasi serta metodenya).
2. Jumlah endotoxin (jumlah pada umumnya
1000 to 100,000 IU per component).
3. Jenis bahan yang mengandung endotoksin
(halus atau kasarnya karet/polimer untuk vial
atau wadah gelas)
variabel yang mempengaruhi reduksi
endotoxin padadepyrogenation, :
4.Metode ekstraksi yang digunakan untuk
menghilangkan endotoksin sebelum dan sesudah
pelaksanaan depyrogenation

5. Variasi potensi endotoksin dalam konsentrasi

tinggi pada larutan

6. Efek yang mengganggu analisa yang berasal dari

peluluhan atau daerah bahan pembersih yang
mungkin berasal dari polimer atau gelas akibat
pemanasan
variabel yang mempengaruhi reduksi
endotoxin padadepyrogenation, :
7. Proses pemeliharaan yang terdiri dari
beberapa variabel yaitu tutup vial, alat
pembersih yang mempengaruhi campuran
recovery (sejumlah besar dari berbagai
proses tersebut merupakan variabel yang
digunakan sebagai indikator sederhana
terhadap pengukuran waktu dan temperatur
yang digunakan)