KOASISTENSI PPDH ELISA

Pengujian Antibodi Rabies

Prof. Dr. Suwarno, drh., M.Si.

Departemen Mikrobiologi Veteriner
Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga
 KOASISTENSI PPDH
• Ada 2 pengujian yang akan kita kerjakan
– Indirect ELISA untuk menganalisis Titer
Antibodi hasil vaksinasi Infectious Bronchitis
pada layer
– Indirect ELISA untuk menganalisis Titer
Antibodi hasil vaksinasi Rabies pada anjing
 Prasyarat
• Sebelum memulai baca petunjuk teknik
pengerjaannya
• Siapkan alat dan bahan
• Gunakan masker dan sarung tangan
• Lakukan pekerjaan dengan hati hati dan teliti,
tidak ceroboh, penuh tanggung jawab dan
selalu memperhatikan aspek kesehatan
terutama untuk jenis pemeriksaan yang
bersifat zoonosis
 Pengujian Antibodi Rabies

• Disiapkan sebanyak 14 serum anjing yang

berasal dari suatu daerah endemik yang
telah dilakukan vaksinasi
• Kode Sampel D1-D14
• Lakukan pengujian serum tsb dengan
melakukan tahap-tahap pada ELISA
• Metode pengujian : Indirect - ELISA
Prinsip Dasar Indirect-ELISA
 

Pada indirect-ELISA, antigen

terikat pada fase padat,
kemudian ditambahkan
antibodi primer dan
selanjutnya konjugat.

Aktivitas dari enzim yang

terikat berbanding terbalik
dengan kadar antibodi yang
terdapat dalam sampel.
 Bahan
– Antigen Rabies – Buffer coating (PZ)
– Antiserum Rabies – Buffer washing (PZ +
– NaCl Tween)
– Creamer – Buffer blocking
– Konjugat anti-dog (creamer 4%)
berlabel horseradish – Buffer assay (creamer
peroksidase 1%)
– Substrat OPD – Buffer stopping :
– Buffer substrat : H2SO4 1 N
urea-sitrat
 Alat
• Microplate ELISA
• Pipet multichannel : 10 – 200 ul
• Pipet mono : 1-10 ul, 10 – 100 ul, 1000 ul
• Microtube
• Yellow tip, white tip & blue tip
• Petridish
• Pipet hisap + bulb
• Gelas ukur 100 ml
• Becker glass / erlenmeyer
• ELISA reader + monitor + printer
• Inkubator
 Buatlah
1. PZ : 300 ml
 Brg gram NaCl harus ditimbang ?
2. Washing Buffer (WB):
 300 ml PZ + 0,3 ml Triton
 Brp % Triton nya ?
3. Blocking Buffer (BB) :
 creamer 4 % = ?
 Bagamana cara membuatnya ?
 Buatlah 30 ml dalam pelarut WB
 TAHAPAN KERJA Indirect-ELISA
1. Coating Ag : 4⁰ C 18 jam atau 37⁰C 1 jam
2. Washing 3x dengan washing buffer
3. Blocking dengan buffer blocking : 1 jam
4. Washing
5. Penambahan As uji yg diencerkan 1 : 100 buffer
assay : 1 jam
6. Washing
7. Penambahan konjugat anti-species 1: 5000 dgn
buffer assay : 1 jam
8. Washing
9. Penambahan substrat : 15 - 30 menit
10. Stopping
11. Pembacaan dengan ELISA Reader pd 405 nm 9
 Coating Ag Rabies
• Coating : Proses perlekatan
Antigen atau Antibodi pada
microplate
• Pelarut : buffer coating (PZ)
• Ambil Ag Rabies : 50 µl / 5 ml
PZ
– Masukkan Ag : 100 µl/well
– Cukup untuk ½ plate = 48 well
• Inkubasi : 37⁰ C 1 jam

10/14/21 10
 WASHING
• Untuk menghilangkan sisa reagen yang
tidak berikatan & ikatan longgar ke fase
padat
• Buang larutan dalam plate dengan menggeblok plate
scr terbalik pada bantalan kertas
• Masukkan @ 200 µl/well
• Goyang plate sebentar
• Buang cairan dengan menggeblok plate scr terbalik
pada bantalan kertas
• Ulangi sebanyak 3 kali

11
 BLOCKING
Bahan pemblok

Antigen

A B

Konfigurasi antara antigen yang dilekatkan pada fase padat

dengan bahan pemblok. A tampak samping, B tampak atas. Ruang
yang kosong di antara antigen diisi dengan bahan pemblok untuk
menghilangkan reaksi latar.
 BLOCKING
Blocking :
– Blocking fase padat (microplate) : 1-5%
– Blocking fase cair (larutan pengencer) : 0,1 – 1%

Tujuan blocking fase padat :

- Mengisi tempat yg tertinggal (kosong)
- Menghambat pengikatan non-spesifik reagen
berikutnya
- Menghilangkan pewarnaan latar pd pembacaan

Tujuan blocking fase cair :

- Meminimalkan pengikatan non-spesifik
imunorektan ke fase padat
- Digunakan sbg pengencer Ab, Ag & konjugat
13
 Blocking
• Setelah proses washing selesai, lakukan
blocking
• Buffer blocking : creamer 4 % dalam
buffer washing
• Masukkan BB @ 200 µl/well
• Inkubasi : 37⁰ C 1 jam
 Blocking
• Setelah proses blocking selesai dan microplate
diinkubasi, hitung brp BB yang tersisa
• Jadikan BB 4 % sisa tadi dan menjadi lar 1 %,
tambah dengan menggunakan buffer washing
• Bagaimana caranya ?
• BB 1% selanjutnya disebut sbg Buffer assay
 PENAMBAHAN SAMPEL
• Setelah buffer assay
selesai disiapkan
• Lakukan pengenceran As
Rabies 1:100
• Bagaimana caranya jika kita
membuat larutan sebanyak 1
ml ?
• Masukkan masing-masing
sampel @ 100 µl/well secara
duplo pd microplate
• Apa itu duplo dan Mengapa
perlu duplo ?
• Inkubasi :37⁰ C 1 jam 16
 Tata Letak Sampel, Kontrol dan Blank
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Kd A Kd B
A Smp Smp
Standar
Smp Smp
St1 : 2,5A EU/ml
1 1 1 1 St1 St1

B St2 St2 St2 : 1,25

C St43 St3 St3 : 0,625
D St4 St4 St4 : 0,3125

E St5 St5 St5 : 0,15625

St6 St6 St6 : 0,078125
F
K+ K+ St7 St7 St7 : 0,390625
G
Smp Smp
8 8
Bl Bl St8 St8 St8 : 0,0000000
H
 WASHING
• Buang larutan dalam plate dengan
menggeblok plate scr terbalik pada bantalan
kertas
• Masukkan BW @ 200 µl/well
• Goyang plate sebentar
• Buang cairan dengan menggeblok plate scr
terbalik pada bantalan kertas
• Ulangi sebanyak 3 kali

18
 Penambahan Konjugat
• Setelah selesai washing
• Lakukan penambahan
konjugat : anti-dog
berlabel HRP
• Pengenceran : 1: 5000
• Bagaimana caranya ?
• Masukkan konjugat @ 100
µl/well
• Inkubasi :37⁰ C 1 jam
 WASHING
• Buang larutan dalam plate dengan
menggeblok plate scr terbalik pada bantalan
kertas
• Masukkan BW @ 200 µl/well
• Goyang plate sebentar
• Buang cairan dengan menggeblok plate scr
terbalik pada bantalan kertas
• Ulangi sebanyak 3 kali

20
 Penambahan Substrat
• Siapkan substrat:
• Bufer substrat : larutan
urea sitrat (tersedia)
• Substrat : OPD
• Aduk hingga merata
• Masukkan substrat : 100
µl/well
• Inkubasi :37⁰ C 15 -30 mnt
 Stopping
• Tambahkan larutan stopping (H2S04 1 N)
sebanyak 50 µl / well ke dalam semua well
dalam microplate
• Baca dengan ELISA READER
Reaksi yang terjadi

Substrat : OPD

Conjugate anti-dog
berlabel HRP

Serum Rabies anjing

yg diuji

Ag Rabies
Reaksi yang terjadi
Reaksi
Pembacaan ELISA
 Pembacaan ELISA
• Nyalakan Reader dan Monitor
• Masukan microplate pada reader
• Setting tempat penempatan sampel, kontrol dan
blank :
– Blok Standard kolom 5 & 6
– Blok K+ pada well G3 & G4
– Blok Blank pada well H3 & H4
– Blok Unknown (sampel) pada wel kolom 1-4, kecuali well yg
ditempati K+ dan blank
• Setting panjang gelombang : 492 nm
• Tekan tombol enter.
 Hitung
• Hitung Rata-rata standard pada kolom 5
&6
– Rata-rata masing-masing standard
• Hitung rata-rata OD kontrol positif
• Hitung rata-rata OD blank
• Dan rata-rata masing-masing As uji yang
ada pada kolom 1-4
 Hitung
• Cocokkan OD masing2 sampel dengan OD Standard, kemudian
kalikan dgn kadar EU
• Misal OD sampel 1 setara dengan OD Std 4 :

0,475
X 0,3125 = 0,312 EU/ml
0,476
 Hasil ELISA Rabies Anjing
No Sampel OD1 OD2 Rata2i OD Titer Antibodi

1
2
3
4
5
6
7
8
14
Rata-Rata
SD
CV
• Tentukan berapa rata2 Titer antibodi tiap
sampel B ?
• Tentukan pula berapa nilai SD nya ?
• Tentukan pula berada nilai CV nya
 CV = SD/rata2 X 100%
• CV < 30 %  baik
• CV 30 – 50%  sedang
• CV > 50%  jelek
• Berikan Kesimpulan
 Bahan Diskusi
1. Jika di suatu pulau terdiri dari 5 kabupaten,
pulau yang ditengah dilakukan vaksinasi
rabies, sedangkan 4 pulau lainnya belum
vaksinasi. Sampel diambil dari daerah yang
divaksinasi, dengan hasil spt yg Sdr kerjakan,
apa yg Sdr dpt simpulkan ?
2. Jika pd soal No 1, ternyata setelah dilakukan
survey di daerah yg tidak divaksin banyak
ditemukan seropositif, apa artinya ?