TROUBLESHOTING in IN VITRO CULTURE

TROUBLE SHOTING

TROUBLE SHOTING

Kontaminasi
Browning
Vitrifikasi
Kontaminasi
Kontaminan
Berdasarkan asalnya :
• Media tidak tepat waktu dan volume saat sterilisasi
• Eksplan kontaminasi internal dan eksternal
• Alat skalpel, pinset, petri dll
• Teknik inokulasi dan sub kultur

Jenis-jenis kontaminan :

Introduced Contamination
Latent Contamination
Initial Contaminant
Jenis kontaminan :

Bakteri
o umum dijumpai
o terbawa melalui eksplan
o Membentuk gumpalan seperti lumpur berwarna di
permukaan media, putih, kuning, pink

Contoh Bakteri: Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium,

Enterobacter, Lactobacillus, Pseudomanas,
Staphylococcus, and Xanthomonas
Fungi
o masuk ke dalam media saat inokulasi
o sebagai patogen
o bermacam warna
o penampakan berupa bulu-bulu halus yang tampak kabur

Contoh Jamur : Aspergillus sp., Monilla sp. dan Penicillium sp.

Virus

Serangga
Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminan
permukaan yang berbeda, tergantung dari :

1.      Jenis tanamannya

2.      Bagian tanaman yang dipergunakan
3.      Morfologi permukaan (misalnya: berbulu atau tidak)
4.      Lingkungan tumbuhnya (green house atau lapangan)
5.      Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau)
6.      Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa)
7.       Kondisi tanamannya (sakit atau dalam keadaan sehat)

Kontaminan permukaan dapat dihilangkan/dikurangi

dengan sterilisasi permukaan (surface sterilisation)
Browning
Browning

keluarnya pigmen berwarna coklat kehitaman (biasanya

merupakan senyawa-senyawa fenol & tanin yang teroksidasi)
Cara mengatasinya :

1. Memperkecil konsentrasi/menyerap/mengikat senyawa fenol dan

tanin yang telah teroksidasi
2. Mencegah eksudasi senyawa fenol dan tanin
3. Mencegah oksidasi senyawa fenol dan tanin
Upaya memperkecil konsentrasi/menyerap/mengikat senyawa fenol
dan tanin yang telah teroksidasi

Pemberian arang aktif (activated charcoal) ke dalam medium

dengan konsentrasi 0,2 – 3 % w/v
Penambahan senyawa Polyvinil Pyrolidone (PVP) ke dalam medium
dengan konsentrasi 250-1000 mg/l
Meningkatkan frekuensi sub kultur
Penggunaan media cair
Mencuci eksplan dalam air pasca pemotongan sebelum ditanam
Upaya mencegah eksudasi senyawa fenol dan tanin

Mengurangi jumlah dan frekuensi pelukaan

Menurunkan konsentrasi garam mineral dalam media
Mengurangi penggunaan beberapa jenis zat pengatur tumbuh.
Upaya mencegah oksidasi senyawa fenol dan tanin

Menambahkan beberapa anti-oksidan seperti asam sitrat, asam

askorbat, thiourea atau L-systine
Menambahkan diethyl-dithiocarbonat (DIECA) 2 gram/l pada
pencucian setelah sterilisasi
Penambahan 3 asam amino (glutamine, arginine, asparagine)
Menghindari penyinaran guna menghindari photoaktivasi
Vitrifikasi
VITRIVIKASI

• Istilah vitrivikasi awalnya disebut hiperhidrasi (Debergh et al.

1992), transluensi, transformasi hiperhydrasi, glauciness,
glassiness, atau waterlogging

• Biasa terjadi pada kultur yang berada dalam media dengan

kadar air berlebihan (misalnya media cair / media dengan
konsentrasi pemadat rendah)
VITRIVIKASI

Hiperhidrasi merupakan kekacauan morfologi, fisiologi dan

metabolisme yang seringkali mempengaruhi kultur in vitro pada
tanaman herbaceous dan berkayu

Hiperhidrasi pada tanaman kultur ditunjukkan oleh abnormalnya

struktur dan fungsi selnya. Tunas yang sedang mengalami
hiperhidrasi memiliki internodus yang pendek dan kelihatan
tebal, rapuh, seperti kaca dan banyak menyerap air (Gaspar,
1991).
Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap kemunculan dan tingkat
Vitrifikasi :

Dapat dipacu oleh

1.Terkait erat dengan taraf konsentrasi sitokinin yang tinggi

2.Iradiasi cahaya yang rendah dan temperatur yang tinggi memacu
terjadinya vitrifikasi
3.Sterilisasi secara berlebihan memacu terjadinya vitrifikasi
4.Mudah terjadi pada beberapa jenis agar
5.Mudah terjadi pada tanaman muda yang masih lunak

Dapat dikurangi dengan

1.Meningkatkan konsentrasi agar dan/atau gula
2.Memperbaiki aerasi kultur
3.Mengganti komposisi garam-garam makro dalam media
4.Menggunakan dua fase media.
VITRIVIKASI:

Terjadi karena kelembaban udara yang tinggi dalam botol kultur,

konsentrasi agar dalam media yang rendah, di kultur dalam
media cair (Debergh, 1983; Ziv and Halevy, 1983)
VITRIVIKASI: dapat dicegah

1. Mengurangi penyerapan air

2. Mengurangi multiplikasi tunas aksiler
3. Merubah potensial matriks (sehingga penyerapan air lebih
sulit)
4. Mengurangi kontak antara eksplan dengan media (sehingga
penyerapan air lebih sulit)
5. Merubah ketersediaan hara makro dan mikro dalam media.