ACARA III

ISOLASI

I. TUJUAN
Mendapatkan bahan murni dari pengisolasian jamur dan bakteri.

TINJAUAN PUSTAKA
Ada beberapa cara penanaman mikrobia aerob, tergantung pada tujuan
penanaman itu. Berdasarkan atas bentuk medium dan cara menanamnya dapat
dibedakan (Jutono, 1978) :
1. Biakan agar tegak (agar deep culture)
2. Biakan agar miring (agar slant culture)
3. Biakan cair (Broth culture)
Ada bermacam-macam cara untuk mengisolasi mikrobia. Untuk isolasi
tersebut harus diperhatikan beberapa hal penting antara lain (Sumardi dan Widyastuti,
2000) :
1. Sifat-sifat spesies mikrobia yang akan diisolasi.
2. Tempat hidup mikrobia.
3. Medium untuk pertumbuhan yang sesuai.
4. Cara menanam mikrobia.
5. Cara inkubasi mikrobia.
6. Cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa biakan murni dan
sesuai dengan biakan yang dimaksud.
7. Cara memelihara agar biakan tetap merupakan biakan murni.
Fungi dapat mensintesis protein dengan mengambil sumber karbon dari
karbohidrat misalnya glukosa, sukrosa atau maltosa. Sumber nitrogen dari bahan
organik atau anorganik dan mineral dari substratnya. Sumber karbon yang paling baik
adalah glukosa, sedangkan sumber nitrogen yang paling baik adalah nitrogen dari
bahan organik. Beberapa fungi dapat mensintesis vitamin yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan dan berkembang biak. Sedangkan beberapa fungi lainnya harus
mendapatkan vitamin misalnya thiamin dan biotin dari substrat (Fordiaz, 1994).
Penyebab penyakit tumbuhan nabati (yang termasuk tumbuhan) adalah bakteri
dan sebangsanya (prokariot), jamur, ganggang, dan tumbuhan biji parasitic. Jamur
memegang peranan penting sebagai penyebab penyakit tumbuhan. Pada penyakit
tumbuhan jamur kurang mempunyai arti dibandingkan jamur. Ganggang dan
tumbuhan biji kurang berarti sebagai parasit (Semangun, 1996).

III. ALAT DAN BAHAN

Alat yang diperlukan dalam acara praktikum “Isolasi” ini untuk isolasi jamur
dari bahan tebal adalah lampu spiritus, alkohol 95 %, kapas, skalpel, pinset, PDA
tegak dan petridish steril. Dan bahan yang diperlukan adalah cabai yang terserang
penyakit antraknosa. Utnuk isolasi jamur dari bahan tipis alat yang digunakan adalah
lampu spiritus, kloroks 0,5 %, petridish steril, air steril, petridish steril dengan kertas
filter di dalamnya, PDA tegak, pinset dan skalpel. Bahan yang diperlukan adalah
daun kayu manis yang terserang jamur. Pada isolasi bakteri dari bahan tebal alat-alat
yang diperlukan adalah lampu spiritus, petridish steril, air steril, PDA tegak, pinset,
jarum ent, dan skalpel. Dan bahan yang diperlukan adalah wortel yang terserang
bakteri. Dan pada isolasi bakteri dari bahan tipis alat-alat yang digunakan adalah
lampu spiritus, kloroks 0,5 %, petridish steril, air steril, petridish steril dengan kertas
filter di dalamnya, air steril di dalam tabung reaksi, PDA tegak, pinset, jarum ent dan
skalpel. Bahan yang diperlukan adalah daun padi yang berpenyakit hawar daun.
 IV. CARA KERJA

a. Isolasi jamur dari bahan tebal

Disediakan petridish steril dan diisi dengan PDA tegak yang telah dicairkan.
Bahan yang akan diisolasi jasad reniknya disiapkan kemudian dibersihkan kotoran-
kotorannya dengan air. Bahan yang telah dibersihkan pada batas antara yang sehat
dan yang sakit diusap dengan alkohol 95 % kemudian dikupas. Diambil bagian
yang sudah dikupas tersebut beberapa potong kemudian diletakkan pada agar di
dalam petridish yang telah disiapkan. Diinkubasi pada suhu kamar selama 2-4 hari.
Diamati biakan yang tumbuh dan biakan yang tumbuh tersebut dipindahkan ke
dalam tabung reaksi yang berisi PDA (agar miring) dengan jarum ent steril.
Kemudian diperiksa dan digambar hasil isolasi tersebut di bawah mikroskop.
b. Isolasi jamur dari bahan tipis
Disediakan petridish dengan diisi PDA tegak yang telah dicairkan. Daun
dibersihkan kotorannya kemudian dipotong dengan disertakan bagian yang sehat
dan yang sakit. Potongan tersebut direndam di dalam kloroks 0,5 % selama 1-2
menit kemudian potongan bahan tersebut dicuci dengan air steril. Secara aseptik
potongan bahan tersebut dipindahkan ke dalam petridish yang sudah ada kertas
filternya supaya air yang terdapat pada bahan tersebut hilang. Lalu potongan-
potongan bahan tersebut dipindah ke dalam petridish yang telah diisi dengan PDA.
Lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 2-4 hari. Kemudian diamati hasil isolasi
dan dipindahkan ke agar miring dan diperiksa hasil isolasi tersebut di bawah
mikroskop.
c. Isolasi bakteri dari bahan tebal
Disediakan petridish dengan diisi PDA tegak yang telah dicairkan. Bahan
yang akan diisolasi jasad reniknya disiapkan kemudian dibersihkan kotoran-
kotorannya dengan air. Bahan yang telah dibersihkan pada batas antara yang sehat
dan yang sakit diusap dengan alkohol 95 % kemudian dikupas. Diambil bagian
 yang sudah dikupas tersebut beberapa potong kemudian bahan tersebut dihancurkan
dengan jarum preparat agar massa bakteri keluar dari bahan dan bercampur dengan
air steril (suspensi bakteri). Dengan jarum ose, suspensi bakteri tersebut diambil
dan digoreskan di atas agar di dalam petridish dengan bentuk S bersambung.
Diinkubasi selama 1-2 hari. Biakan yang tumbuh dipindahkan ke agar miring
dengan jalan mengambil massa bakteri dari petridish dengan jarum ose. Kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi air steril, digojok hingga homogen
lalu digoreskan pada agar miring. Hasil isolasi diperiksa dengan pengecatan
sederhana dan diamati di bawah mikroskop.
d. Isolasi bakteri dari bahan tipis
Disediakan petridish dengan diisi PDA tegak yang telah dicairkan. Daun
dibersihkan kotorannya kemudian dipotong dengan disertakan bagian yang sehat
dan yang sakit. Potongan tersebut direndam di dalam kloroks 0,5 % selama 1-2
menit kemudian potongan bahan tersebut dicuci dengan air steril. Secara aseptik
potongan bahan tersebut dipindahkan ke dalam petridish yang berisi air steril.
Bahan tersebut dihancurkan dengan jarum preparat agar massa bakteri keluar dari
bahan dan bercampur dengan air steril (suspensi bakteri). Dengan jarum ose,
suspensi bakteri tersebut diambil dan digoreskan di atas agar di dalam petridish
dengan bentuk S bersambung. Diinkubasi selama 1-2 hari. Biakan yang tumbuh
dipindahkan ke agar miring dengan jalan mengambil massa bakteri dari petridish
dengan jarum ose. Kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi air
steril, digojok hingga homogen lalu digoreskan pada agar miring. Hasil isolasi
diperiksa dengan pengecatan sederhana dan diamati di bawah mikroskop.
 V. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Bahan yang digunakan untuk isolasi

1. Isolasi jamur dari bahan tebal (Cabai yang terkena penyakit antraknosa)

2. Isolasi jamur dari bahan tipis (Daun kayu manis yang mempunyai bercak coklat).

3. Isolasi bakteri dari bahan tebal (Wortel yang mengalami busuk basah).

4. Isolasi bakteri dari bahan tipis (Daun padi yang terkena penyakit hawar daun).
Hasil isolasi
a. Jamur Colletotrichum sp.

Jamur ini mempunyai hifa bersekat. Mula-mula hialin kemudian menjadi sedikit
gelap, aservulus banyak dibentuk di permukaan atas maupun permukaan bawah.
Sering terbentuk aservulus pada ranting-ranting yang sakit tetapi tidak pada buah.
Konidium hialin, lonjong atau bulat telur dengan ujung-ujung membulat, tidak
bersekat kadang mempunyai 1-2 tetes minyak dengan ukuran rata-rata 12-16 x 4-6
ηm. Stadium sempurna (telomorf) jamur ini adalah Glomerella angulata (ston).
Pada cuaca yang lembab dan berkabut jamur pada daun dan ranting membentuk
banyak spora (konidium) (Semangun, 1996).

b. Jamur Pestalotia

Pestalotia membentuk kumpulan konidium yang tampak seperti titik-titik hitam

pada bagian daun yang mati. Konidium mempunyai 3 sel berwarna gelap dan 2 sel
ujung yang hialin. Sel ujung terdapat di bagian basal mempunyai 3 seta (ekor)
hialin. Tebalnya kurang lebih 1 ηm. Panjangnya 20-30 ηm. Konidium berukuran
20-24 x 6 ηm tanpa ekornya (Semangun, 1996).
c. Bakteri padi
Terdapat koloni-koloni bakteri yang berwarna putih kekuningan dan tembus
cahaya. Bakteri padi (Xanthomonas oryzae) merupakan penyebab penyakit hawar
daun pada padi (kresek). Bakteri ini berbentuk batang, membuat pigmen kuning
yang tidak larut dalam air. Bergerak dengan flagel monotrik, atau tidak bergerak
dan tidak membentuk spora. Gram negatif (Semangun, 1996).

d. Bakteri wortel
Terdapat koloni bakteri yang berwarna putih kekuningan dan seperti lender.
Erwinia carotovora merupakan bakteri penyebab terjadinya busuk lunak/basah
pada wortel. Bakteri ini berbentuk batang, bergerak dengan beberapa atau banyak
flagel peritrik. Satu-satunya marga bakteri penyebab penyakit tumbuhan yang
bersifat anaerob fakultatif, gram negatif. Sebagai penyebab busuk lunak bakteri
merusak lamela tengah sel-sel tumbuhan inang karena menghasilkan enzim
pektinase (Semangun, 1996).
Pektin adalah karbohidrat komplek yang terdapat pada sayuran dan buah-buahan.
Campuran enzim pektolitik disebut pektinase, dapat memecah pektin dan
menyebabkan busuk buah atau busuk lunak. Pada sayuran dan buah-buahan, atau
menyebabkan hilangnya kemampuan membentuk gel pada sari buah (Fordiaz,
1994).
Isolasi mikrobia dimaksudkan untuk memisahkan mikroorganisme satu dari
yang lain dan menumbuhkannya dalam suatu medium tersendiri sehingga didapatkan
suatu biakan murni. Dalam praktikum ini mengerjakan 4 macam bahan yang diduga
mengalami sakit karena jamur dan bakteri. Keempat macam bahan yang digunakan
adalah daun padi, daun kayu manis, wortel dan cabai.
Dalam melakukan isolasi alat, bahan dan tempat yang digunakan harus dalam
keadaan steril. Untuk tempat, meja yang akan digunakan diusap dengan kapas yang
dibasahi dengan alkohol. Sedangkan sterilisasi alat dengan cara mencelupkan alat
seperti jarum ose, pisau, skalpel ke dalam alkohol dan dibakar di atas lampu bunsen.
 Setelah selesai sterilisasi, isolasi jamur dan bakteri dapat dilakukan. Untuk
jenis patogen jamur, perlakuan terhadap bahan tebal dan tipis berbeda. Untuk
jariongan tebal menggunakan alkohol sebagai bahan pendisinfeksi dan menggunakan
kloroks untuk jaringan yang tipis. Sebab bila menggunakan alkohol pada jaringan
yang tipis maka mikroorganisme yang ada pada jaringan tersebut akan mati dan
isolasi tidak dapat dilakukan. Sebaliknya bila menggunakan kloroks untuk jaringan
tebal maka jamur tidak akan bisa diambil dari dalam jaringan tebal karena bahan
pendisinfeksinya terlalu rendah pengaruhnya. Fungsi dari bahan pendisinfeksi adalah
sebagai sterilisasi permukaan bahan yang akan diisolasi jasad reniknya. Untuk bakteri
perlakuan terhadap jaringan tipis dan jaringan tebal sama dengan jamur yaitu
menggunakan alkohol untuk bahan tebal dan menggunakan kloroks untuk bahan tipis.
Perbedaan antara isolasi jamur dan bakteri adalah jika pada jamur setelah
bahan yang dipilih untuk diisolasi diambil maka tidak perlu dimasukkan ke dalam air
steril karena patogen dapat diambil tanpa perlu membuat suspensinya. Sedangkan
pada bakteri perlu dimasukkan ke dalam air steril tujuannya agar massa bakteri bisa
keluar dan bercampur dengan air dan nantinya massa bakteri ini yang akan digunakan
untuk isolasi.
Kontaminasi dapat terjadi karena alat yang digunakan belum benar-benar
steril dimana memungkinkan adanya mikroorganisme berupa jamur atau bakteri lain
yang masuk dan merusak media yang digunakan untuk isolasi.
Jadi keberhasilan suatu isolasi dapat dipengaruhi oleh kondisi bahan atau
tanaman sakit yang akan diisolasi, jenis medium buatan yang digunakan, cara
mengisolasi dan cara sterilisasi alat dan bahan yang digunakan.
 VI. KESIMPULAN

1. Isolasi adalah memisahkan atau mengasingkan mikroorganisme atau jasad

renik yang satu dengan yang lain sehingga didapat suatu biakan murni.
2. Pada isolasi jamur bahan yang akan diisolasi jasad reniknya dapat langsung
diletakkan pada media, sedangkan pada bakteri perlu dibuat suspensinya
terlebih dahulu.
3. Isolasi pada cabai dan wortel (jaringan tebal) disinfeksi dilakukan dengan
mengusap bahan dengan menggunakan alkohol 95 %.
4. Isolasi pada daun padi dan daun kayu manis (jaringan tipis) disinfeksi
dilakukan dengan mencelup bahan pada larutan kloroks 0,5 %.
5. Keberhasilan suatu isolasi dapat dipengaruhi oleh kondisi bahan atau tanaman
sakit yang akan diisolasi, jenis medium buatan yang digunakan, cara
mengisolasi dan cara sterilisasi alat dan bahan yang digunakan.
 DAFTAR PUSTAKA

Fordiaz, S. 1994. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. 308 p

Jutono. 1978. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University

Press. Yogyakarta. 228 p

Semangun, H. 1996. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. Gadjah Mada University

Press. Yogyakarta. 754 p

Sumardi dan Widyastuti. 2000. Pengantar Perlindungan Hutan. Gadjah Mada

University Press. Yogyakarta