TEKNIK IMUNOKIMIA

Terminologi
Antigen Antibodi Tapak Ikatan Antibodi (Antibody-binding site) Determinan Antigen Spesifisitas Sampling Hapten Afinitas Teknik pengambilan dan penanganan spesimen

Metode & Teknik

Teknik Petanda Radioaktif Teknik Petanda Enzim Teknik Petanda Fluoresen
(petanda = label)

TEKNIK IMUNOKIMIA
Reaksi Imunokimia
Reaksi Antigen-Antibodi Competitive-Binding Reactions

Teknik Label Radioaktif

Radioimmunoassay [RIA] Immunoradiometric Assay [IRMA]

Teknik Label Enzim

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA] Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique [EMIT]

Teknik Label Fluoresen

Substrate-Labeled Fluorescent Immunoassay [SLFIA] Fluorescence Polarization Immunoassay [FPIA]

Reaksi Antigen-Antibodi
Imunogen = Makromolekul yang dpt memberikan respon imun dengan membentuk imunoglobulin (antibodi). Antigen = Senyawa (makromolekul) yang terikat pada satu atau lebih antibodi membentuk komplek Ag-Ab. Antibody-binding site = Bagian molekul antibodi yang dapat membentuk ikatan dengan antigen selama reaksi antigen-antibodi berlangsung. Determinan antigen = Bagian antigen yang dapat berikatan dengan antibody-binding site Spesifisitas reaksi antigen-antibodi = derajat pengikatan antibodi terhadap antigen tertentu (mis. homolog antigen) tanpa berikatan dengan molekul lain yang strukturnya sama.

Reaksi Antigen-Antibodi
Hapten = Molekul bermassa rendah ( < 20.000 dalton, mis. obat ) yang berfungsi sebagai determinan antigen tunggal. Afinitas = Kekuatan ikatan antara determinan antigen (atau hapten) dengan suatu binding site dari antibodi tunggal.

Afinitas ikatan suatu antibodi dinyatakan dengan Tetapan Kesetimbangan (K), sebab ikatan non-kovalen antara antibodi dan antigen bersifat reversible. K = [Ab-Ag] / [Ab][Ag] = k1 / k2 k1 Ab + Ag Ab-Ag k2

Competitive Binding Reactions

Prinsip : Pengikatan (spesifik) antigen terhadap antibodi adalah proporsional terhadap konsentrasi antigen dalam larutan baku (standard), pembanding (control), dan uji (sample). Asumsi kondisi yang diharapkan : 1) Antigen dan antibodi homogen dan interaksi (kesetimbangan) bersifat reversible. 2) Petanda antigen tidak mengganggu interaksi antigen-antibodi. 3) Antigen dan antibodi hanya membentuk komplek bimolekuler (antigen dan antibodi bersifat univalen). 4) Komplek antigen-antibodi dapat dipisahkan sempurna dari bentuk bebas antigen berpetanda. Penyimpangan terhadap kondisi yang diharapkan tersebut tidak mengubah sifat umum reaksi imunokimia kompetitif.

Radioimmunoassay [RIA]
Radioimmunoassay adalah teknik imunokimia menggunakan radioisotop untuk mendeteksi kuantitas antigen atau antibodi dalam spesimen cairan biologis; berdasarkan pembentukan komplek Ag-Ab (endapan atau agregat tidak larut) yang dilakukan pada kondisi optimal.

RIA merupakan immunoassay heterogen yang memerlukan tahap pemisahan secara fisik bentuk bebas antigen berpetanda dari bentuk lain antigen berpetanda yang terikat pada antibodi, dilakukan sebelum pengukuran radioaktivitas petanda terikat.
Teknik : Solid-phase attachment Activated charcoal separation method Precipitation technique

Radioimmunoassay [RIA]
Deteksi : Radioisotop (atom atau unsur yang mengalami peningkatan jumlah neutron dalam intinya sehingga ketidakstabilan inti akan berubah spontan kembali ke bentuk stabil dengan memancarkan radiasi). Radionuklida adalah inti radioisotop tidak stabil yang dapat memancarkan radiasi : partikel alfa, elektron positif/negatif, sinar gamma.

x x

%B

x
x x

Logit B/Bo

Log konsentrasi antigen

Log konsentrasi antigen

Immunoradiometric Assay [IRMA]

Immunoradiometric assay : metode untuk menentukan kadar antigen dalam spesimen cairan biologis menggunakan antibodi yang diberi petanda radionuklida. Kelebihan antibodi berpetanda menunjukkan antigen yang terdapat dalam larutan berdasarkan reaksi non-kompetitif. Teknik : Two-site solid-phase assay (sandwich technique) One-site fluid-phase assay Aplikasi : Protein serum, faktor koagulasi VIII, ferritin, thyroid-binding protein, carcinoembryonic antigen (CEA), a-fetoprotein, IgE, ACP prostat, Antigen spesifik prostat, hormon (TSH, prolaktin, hGH, hCG urin dan hCG serum).

Enzyme immunoassay [EIA]

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Petanda enzim sebagai pengganti radioisotop untuk mengukur pembentukan komplek antigen-antibodi, digunakan untuk kuantisasi ligan berbobot mulekul besar (>30.000 dalton). Petanda enzim terkonyugasi pada ligan, mis. antigen, antibodi spesifik antigen tertentu,atau antibodi spesifik terhadap antibodi primer. ELISA menggunakan solid phase, umumnya untuk reaksi kompetitif. IEMA (immunoenzymetric assay) berdasarkan teknik sandwich untuk reaksi non-kompetitif. EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique) : metode tanpa pemisahan dengan menggunakan petanda enzim terkonyugasi pada hapten disertai reaksi deteksi menggunakan perubahan substrat membentuk produk reaksi enzimatik.

Teknik Petanda Fluoresen

SLFIA (substrate-labeled fluoresent immunoassay) : metode tanpa pemisahan menggunakan petanda substrat fluorogen pada reaksi enzim-substrat untuk menentukan komplek antigen-antibodi. Banyak digunakan untuk kuantisasi TDM, hormon, IgG dan IgM serum akibat infeksi virus.

FPIA (fluorescence polarization immunoassay) : metode tanpa pemisahan berdasarkan reaksi kompetitif untuk menentukan hapten berbobot molekul kecil (< 20.000 dalton). Dalam metode ini dipantau reaksi antara hapten dan antibodi menggunakan petanda fluoresen yang terkonyugasi pada suatu hapten. Banyak digunakan pada pengukuran kuantitatif obat pada TDM, drug abuse, hormon.

Teknik Petanda DNA

Teknik hibridisasi asam nukleat digunakan pada pengukuran sampel atau spesimen kontrol yang membentuk hibrida untai-ganda (double stranded) stabil dari DNA atau RNA untai tunggal yang terdapat dalam spesimen, yang berinteraksi dengan untai-tunggal DNA probe komplementer (sebagai molekul petanda). Untuk mendeteksinya DNA probe dikonyugasi dengan petanda (radioisotop, enzim, fluoresen, biotin) seperti pada immunoassay. DNA probe digunakan a.l. untuk deteksi cepat dan spesifik jasad penyebab infeksi mis. bakteri atau virus, berdasarkan keunikan deret basa DNA di dalam genom yang berbeda dari DNA inang (host). Contoh : Mycoplasma pneumoniae, retrovirus HIV, adenovirus, cytomegalovirus, hepatitis B, herpes simplex, Chlamidya trachomatis.

TEKNIK PETANDA KELAT BERFLUORESENSI

Pembentukan kompleks lantanida (Eu, Tb) dg molekul organik b-diketon pembawa fluoresensi.
Rendemen kuantik mendekati batas teoritis Pita emisi berdekatan Pergeseran Stockes lebar (270 nm:Eu, 200 nm:Tb) Panjang gelombang eksitasi dan emisi terdpt di luar daerah interferensi spesimen biologi Masa hidup fluoresensi 50-1000 mdetik (jauh lebih lama dari fluorofor klasik.

TEKNIK PETANDA SUBSTRAT BERFLUORESENSI

Fluoresensi hanya muncul setelah reaksi hidrolisis enzimatik terhadap senyawa bertanda. Ada 3 contoh kopel reaksi enzim : 1. Umbeliferon Esterase 2. b-galaktosil umbeliferon b-galaktosidase 3. Flavin Adenin Dinukleotid (FAD) Nukleotida pirofosfatase

TEKNIK PETANDA LUMINISENSI KIMIA & BIOLUMNISENSI

Terbentuk emisi sinar sebagai hasil reaksi kimia/enzimatik terhadap substrat molekul organik : luminol, dioksetan, turunan akridin, imidazol. Kelemahan : sifat hidrofob membatasi pemakaian untuk makromolekul seperti protein, kecuali jika hapten ber-BM kecil akan terlarut setelah diberi petanda.